MODUL X : ANALISIS HPLC

a) Urgensi Praktikum
High Performance Liquid Crhomatography (HPLC) merupakan teknik pemisahan
dengan ketepatan analisis dan kepekaan yang tinggi serta cocok untuk memisahka senyawa-
senyawa non volatil yang tidak tahan pada pemanasan. Penggunaan HPLC dalam bidang
farmasi yaitu untuk uji identitas, uji kemumian dan penetapan kadar. Senyawa yang dapat
dianalisis dengan HPLC mulai dari senyawa ion anorganik sampai senyawa organik
makromolekul. Hal tersebut mendukung penggunaan HPLC dalam analisis sampel biologis.
b) Deskripsi Singkat Praktikum
Dalam praktikum ini, mahasiswa akan mengoperasikan instrumen HPLC untuk
mengukur kadar obat yang terkandung dalam plasma hewan coba yang telah dipreparasi
sebelumnya.
c) Sasaran Pembelajaran Praktikum
(1) Mahasiswa mengetahui dan memiliki keterampilan untuk pengoperasikan instrumen HPLC.
(2) Mahasiswa mengetahui mengintepretasikan data kromatogram secara kualitatif dan
kuantitatif.
(3) Mahasiswa berpartisipasi secara aktif dalam praktikum.
d) Alokasi Waktu Praktikum
Minggu ke ….
e) Tempat Praktikum
Laboratorium kimia farmasi (Lt. 4 fakultas farmasi UNHAS) dan laboratotium
biofarmaka (Lt.4 LPPM UNHAS).
f) Teori
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan
distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary)
dan fase bergerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fase
bergerak dapat berupa zat cair atau gas.
HPLC (High performance liquid chromatography) adalah suatu instrumen
kromatografi yang dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970. Kegunaan
umum HPLC adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun
senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-senyawa mudah
menguap (volatile); penentuan molekul- molekul netral, ionik, maupun zwitterion; isolasi dan
pemurnian senyawa. HPLC merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan
baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. HPLC sangat berguna untuk menentukan
kadar obat dalam cairan biologis dan dapat memisahkan komponen zat dalam obat. Hasil
analisisnya disebut kromatogram (gambar 1).

Gambar 1. Kromatogram
Prinsip dasar dari HPLC dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap
komponen dalam sampel untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan
untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analit dalam suatu sampel.
Sedangkan analisa kuantitatif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analit tersebut dalam
sampel. Komponen HPLC dapat dilihat pada gambar 2.

Gambar 2. Komponen HPLC

Tabel 1. Komponen HPLC
Komponen Fungsi
Wadah fase gerak Untuk menampung fase gerak yang bersifat
inert.
Kolom Tempat terjadinya elusi dan melekatnya fase
diam yang digunakan seperti silica dan
polimer-polimer stiren dan divinil benzene
Pompa Untuk menjamin proses penghantarab fase
gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan dan bebas dari
gangguan
Injektor Untuk memasukkan sampel cairan ke aliran
aliran fase gerak. Volume sampel berkisar
5- 20 µL. Injektor juga harus mampu
menahan tekanan tinggi dari sistem cairan.
Detektor Untuk mendeteksi signal yang diberikan
atau untuk pembacaan hasil analisis.
Terbagi menjadi detector universal
(mendeteksi zat secara umum, tidak spesifik
dan tidak selektif), dan detector spesifik
yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik seperti detector UV-VIS,
Fluoresensi dan elektrokimia.
Komputer Komputer tidak hanya mengontrol semua
modul instrumen HPLC tetapi mengambil
sinyal dari detektor dan menggunakannya
untuk waktu elusi (waktu retensi) dari
komponen sampel (analisis kualitatif) dan
jumlahnya sampel (analisis kuantitatif).
Tabel 2. Parameter yang mempengaruhi kromatogram
Parameter Definisi Rumus
Waktu retensi Selang waktu yang diperlukan tR' = tR – tM
oleh analit mulai saat injeksi ket:
sampai keluar dari kolom dan tR' (waktu retensi terkoreksi)
sinyalnya secara maksimal tR (waktu retensi analit)
ditangkap oleh detektor tM (waktu retensi pelarut)
Faktor kapasitas Faktor kapasitas dapat K’= (tR-to)/to
memberikan gambaran dimana Ket:
puncak-puncak analit terelusi tR – to (waktu retensi terkoreksi)
secara relatif terhadap puncak to : waktu retensi fase gerak
fase geraknya. (K’ yang baik yaitu berkisar antara 2
dan 10)

Selektivitas Kemampuan fase diam untuk Selektivitas (α) merupakan nilai

memisahkan 2 komponen retensi relative tiap komponen oleh
fase diam. a=k2/k1 atau a= (t2-t0) :
(t1-t0) Supaya pemisahan terjadi,
maka nilai α harus lebih besar dari 1.
Efesiensi kolom Ukuran kemampuan dari kolom
yang digunakan untuk
memisahkan campuran senyawa
yang dianalisis
Resolusi Nilai yang diperoleh dari R= ( tR2-tR1 ) / 0.5 (W1+W2)
perbedaan waktu
retensi Ket : R = Resolusi
pertama dengan waktu retensi t = Waktu retensi
W = Luas Area
kedua. Pemisahan dua puncak
dengan R ≥ 1,5 merupakan
harga resolusi ideal,
g) Alat-alat yang dibutuhkan
1. Labu ukur 5 mL
2. Pipet mikro (100-1000 a/ 10-100 )
3. Beaker glass 250 mL
4. Neraca analitik
5. Gelas ukur 10 mL dan 25mL
6. Tube hplc
7. Spoit 1 mL
8. Vial
9. Penyaring besi HPLC
10. Seperangkat alat HPLC
h) Bahan-bahan yang dibutuhkan
1. Senyawa baku obat
2. Sampel biologis
3. Metanol HPLC grade
4. Aqua pro injection
5. Tip pipet mikro biru dan kuning (dikondisikan)
6. Kertas saring
i) Prosedur kerja
 Instrumentasi
1. fase diam: kolom C18 (150 x 3.0 mm, 5 um)
2. fase gerak: asetonitril dan 0.2% formic acid (70:30 v/v %) (opsi 1)
metanol : buffer fosfat pH 4.7 (ratio 60:40 v/v) (opsi 2)
3. laju alir: 1 mL/mjn
 Penyiapan Larutan Standard dan Pembuatan Kurva Baku
1. Buat larutan stok 1000ppm dalam labu tentukur 10 mL
2. Buat seri pengenceran dengan konsentrasi (1-5) ppm
3. Elusi menggunakan HPLC, dibaca pada detektor PDA dengan absorbansi 355nm dan plot
data untuk mendapatkan linearitasnya sebagai kurva baku.
 Penyiapan Larutan sampel
1. Siapkan sampel biologis yang mengandung meloxicam (telah dipreparasi sebelumnya).
2. Sebanyak 20 uL sampel injeksikan ke HPLC
3. Dibaca pada detektor PDA dengan absorbansi 355nm.
Rujukan Artikel HPLC sampel biologis
Artikel Fase gerak & Fase diam
Development and Validation of an HPLC Method for the RP-HPLC. Fase gerak: phosphate
Determination of Meloxicam and Pantoprazole in a Combined buffer/acetate was used (30:70,
Formulation v/v), with a pH of 3.4 and a flow
Peneliti: Raneem Ahmad, Mohammad Hailat, Zainab rate of 1.0 mL/min at 25 ◦C. T
Zakaraya, Osaid Al Meanazel and Wael Abu Dayyih 2022. Fase diam: C18

Development and validation of stability-indicating RP- C18 column (dimension, 250 ×

HPLC method for the simultaneous determination of 4.60 mm; particle size, 5 μm)
tizanidine HCL and meloxicam in rabbit's plasma. mobile phase consisting of
Penulis: Muhammad Zaman , Muhammad Hanif , Najm methanol–water (8:2)
Ul Hassan Khan , Asif Mahmood , Muhammad Naeem
Qaisar , and Huma Ali
HPLC-PDA METHOD FOR THE QUANTIFICATION OF Fase diam : C18 column 5 µm,
PARACETAMOL IN PLASMA: APPLICATION TO PK/PD STUDIES 150 × 4.6 mm.
WITH ARTHRITIC RATS. International Journal of Pharmacy and Fase gerak : water: methanol
Pharmaceutical Sciences. Vol 9, Issue 5, 2017. (75:25)
The quantification of paracetamol, paracetamol Fase gerak : potassium
glucuronide and paracetamol sulphate in plasma and dihydrogen orthophosphate,
urine using a single high-performance liquid isopropanol, tetrahydrofuran
chromatography assay. Journal of Pharmaceutical and Fase diam : C-18 Coloum
Biomedical Analysis 34 (2004) 585–593
Penulis: L.S. Jensen, J. Valentine∗, R.W. Milne, A.M.
Evans.
Liquid chromatography method for determination of Fase diam : kolom C8
mefenamic acid in human serum. Journal of Fase gerak : asetonitril - air
Chromatography B, 800 (2004) 189–192. (50:50)
Penulis: Mohammad-Reza Rouini, Ali Asadipour, Yalda
Hoseinzadeh Ardakani, Fakhredin Aghdasi
Validation of Analytical Method for Quantification of Fase gerak : metanol 100%
Egg Cholesterol Using Reversed Phase-High Fase diam : kolom ZORBAX
Performance Liquid Chromatography-Multiwavelength
 Detector. Tropical Animal Science Journal 42(3):230- Eclipse XDB-C18
236. Y. L. Penulis: Maslukhah
Simple and Selective HPLC-UV/Vis Bioanalytical Fase gerak : 60 : 80 metanol
Method to Determine Aluminum Phthalocyanine dalam air yang diasamkan
Chloride in Skin Permeation Studies. Fase diam : kolom C18
Journal of Analytical Methods in Chemistry Volume
2018, Article ID 7423764, 7 pages
Penulis: Thaiene Avila Reis, Ana Elise Jaculi, Rubens da
Costa Alves,Tais Gratieri , Ricardo Bentes Azevedo,
Graziella Anselmo Joanitti, Guilherme Martins Gelfuso,
and Marcilio Cunha-Filho
Bioanalytical RP-HPLC method validation for Fase gerak : acetonitrile
resveratrol and its application to pharmacokinetic and Fase diam : kolom C18
drug distribution studie. Journal of Applied
Pharmaceutical Science Vol. 12(02), pp 158-164,
February, 2022

j) Referensi
Gandjar, I.G dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar
Nasr Y., Khalid F. Aldosari., 2020. Profiles of drug substances, Excipients and related
methodology, Vol 45. Elsivier Inc.