High Performance Liquid

Chromatography
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1
 HPLC
C
P I

FD

1. Fase gerak dipompa masuk ke tabung

stainless steel yg berisi partikel fase
E diam berdiameter 3-10 m
L
2. Dengan injektor Rheodyne larutan
baku/sampel disuntikan ke dalam
aliran fase gerak
3. Pemisah komponen terjadi ditabung fase diam
4. Komponen dideteksi oleh detektor
5. Data diproses oleh komputer
2
 Injektor Rheodyne
dari pompa

ke kolom putar tuas

SUNTIK

dari pompa ke kolom

A B

F C

E D A B

F C
E D

ISI LOOP
dgn semprit
suntik
 Penggunaan

Gabungan HPLC dengan detektor spektrofotometer dengan DAD

menjadikan HPLC sebagai
• metoda baku analisis sediaan farmasi yang akurat, persis dan tegar,
bagi industri farmasi.
• metoda untuk memantau kestabilan atau mengetahui terjadinya
degrasi bahan obat murni, maupun kestabilan bahan aktif dalam
sediaan farmasi
• metoda untuk mengukur kadar bahan aktif dan metabolitnya di dalam
cairan biologis
• Metoda penetapan nilai koefisien partisi dan pKa dari suatu obat dan
penetapan obat yang terikat dengan protein dalam cairan biologis

4
 Keunggulan HPLC
• Volume suntik terkendali menghasilkan volume yang tidak berubah 
menjamin presisi analisis kuantitatif.
• Pengembangan teknik HPLC paling intensif pada jenis fase diam,
detector dan software
• Variasi kolom dan detector emnyebabkan memudahkan pengaturan
selektivitas
• Dibanding GC cocok untuk senyawa yang tidak stabil terhadap
pengaruh suhu.
• Otomasi mudah

5
 Keterbatasan

• Jika senyawa tdk punya gugus kromofor, maka

diperlukan detector lain yang sesuai
• Diperlukan pre-extraksi komponen-2 senyawa
aktif dari bentuk sediaannya
• Diperlukan biaya untuk mengolah limbah
eluen,

6
 Kolom HPLC fase sungsang (Reverse)

• C18 (ODS) type

• C8 (octyl) type
• C4 (butyl) type Sifat Non-polar
• Phenyl type -Si-C18H35
• TMS type
• Cyano type Si

7
Structur senyawa yang berpengaruh pada waktu tambat
(Rt) pada kolom HPLC

• Senyawa netral
– Untuk senyawa netral Rt tergantung dari perbandingan polaritas
dan hidrofobitas yang terkandung dalam senyawa tersebut. pH
eluen tidak mempengaruhi Rt

• Senyawa yang dapat di-ionkan

– Untuk senyawa yang dapat di-ionkan Rt bisa dikendalikan
dengan mengatur pH eluen

8
 Hidrofobisitas

• Jika analit mengandung

– CH3CH2CH2--- : rantai hidrokarbon
Hidrofobisitas
: Gugus aromatik
menjadi kuat.

• Jika analit mempunyai

-COOH : gugus karboxil
-NH2 : gugus amino Hidrofobisits
-OH : gugus Hydroxyl menjadi lemah.
9
 Rt waktu tambat dan Hidrofobisitas

• OH

C18 (ODS)
Weak

Strong
OH

10
 Menaikkan polaritas eluen
20 % 30 % 40% / H2O

1 : p-Hydoxymethylbenzoate
2 : p-Hydoxyethylbenzoate Eluen : MeOH
3 : p-Hydoxypropylbenzoate
4 : p-Hydoxybutylbenzoate 11
Pengaruh jumlah atom C pd gugus alkil

C8

Sedang
C18 (ODS)
sample
Kuat
C4
sample [emah

sample

12
 Pengaruh fase diam

 Analytical Conditions
ODS C8 TMS  Column : Shim-pack CLC-ODS
 Mobile phase : MeOH : H2O = 7 :3
 Flow rate : 1.0 mL/min
 Temperature : 40 C
 Injection volume : 10 uL
 Detection : UV-254 nm
 Peaks
1. Methyl benzoate
2. Ethyl benzoate
3. n-Propyl benzoate
4. n- Butyl benzoate

13
• Senyawa yang dapat ter-ion-kan
– Laju elusi bagi senyawa yang dapat di-ion-kan bisa dikendalikan dengan cara
mengatur pH larutan dapar dari eluennya..
Untuk asam K’app = K’/(1+10pH-pKa)
untuk basa K’app = K’/(1+10pKa-pH) ►
– Jika kolom terikatnya adalah gugus alkil maka pilihlah fase gerak yang dapat
menekan ionisasi analitnya. Jika analitnya bereaksi asam pilihlah eluen yang
bereaksi asam. Sedangkan jika analtnya basa pilihlah eluen yang bereaksi basa.

R-COOH  RCOO- + H+
(pKa=4.5)
R-NH2 + H+  R-NH3+
(pKa=6.0)
– Variasi pH fase gerak hanya dapat dilakukan pada rentang pH 2-8.5, karena
pada pH < 2 salut silan pada fase diam lepas dan pada pH > 8,5 silikanya
cenderung terlarut.

14
 Reverse Phase
Ion-Pair Chromatography

Ion-Pair Reagent

15
 Ion Paring
Important Considerations

• Type of Ion-Pair reagents

• Concentration of Ion-Pair reagents
• pH of solvent

R-COOH RCOO- + H+
(pKa=4.5)
R-NH2 + H+ R-NH3+
(pKa=6.0)
16
 Type of Ion-Pair Reagents
Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate

Mobile Phase: H2O/MeOH

1:1,with 0.005M ion pairing
reagent and 1% HOAc

1 Maleic Acid
2 Phenylephrine
3 Phenylpropanolamine
4 Naphazoline
5 Phenacetin
6 Pyrilamine

17
Concentration of
Ion-Pair Reagents

18
Penyebab terjadinya puncak yang berekor

• Banyak senyawa pengotor muncul sebagai

puncak --> perlu extraksi bahan
aktifnya/membuang pengotor
• Adanya Extra column (dead volume)
• Suntikan sample berlebih
• Pemilihan eluen yang tidak cocok
• Pengaruh retensi sekunder
– Gugus Silanol
– Residu logam berat
19
 Dead Volume

• Dead volume will cause a broad peak.

– Sample Injector Connection
– Column Connection
– Detector Connection
Good
connection

Dead Volume
20
 Incorrect solvent for sample
• Better do not select a high soluble solvent as a sample
solvent.
Methanol as a sample solvent Ethanol as a sample solvent

20 uL Caffeine 20 uL Caffeine

Ethanol as a sample solvent

Better inject small
10 uL Caffeine amount of sample.

21
 Secondary retention effects

• Silanol Group
– Even modified silica gel (e.g. ODS, C8), residual
silanol group are still remained on the surface
area.
– Silanol group will strongly absorb amine
compounds, therefore tailing will be happened.
C18
OH
Silanol group
silica core C18
O- negative charge
C18 22
C18
 End capping

• To suppress the silanol group effect, an end

capping type of column will be selected.

C18 C18
OH TMS treatment O-TMS
silica core C18 silica core C18
OH TMS : trimethylsilyl group
O-TMS
C18 C18
C18 C18
[Non-End capping type] [End capping type]
23
 Secondary retention effects

• Residual heavy metal

– Normal silica gel has heavy metal as an impurity.
This heavy metal will have an interaction with
chelate compounds, therefore tailing will be
happened.

C18
+ O-TMS
O High pure type of
silicaMcore C18
O-TMS silica gel are available.
M+ C18 O
C18
24
 HPLC system

• Isocratic elution system

– Single solvent of constant composition
• Gradient elution system
– Multi solvents of changeable composition
• High pressure gradient system
• Low pressure gradient system

25
Isocratic Elution System

pump injector oven

detector

column

Single Solvent
26
Gradient Elution System

A
column
injector detector
pump oven

B concentration
B

pump

Time
27
 Isocratic Elution Mode

MeOH / H2O = 6 / 4
Long Time Analysis

Bad Separation

MeOH / H2O = 8 / 2

( column : ODS type ) 28

 Gradient Elution Mode

MeOH concentration
95%

30%

29
 Calibration method

• External calibration method

• Internal calibration method
• Standard additive method
• Correction Normalization method

30
 External Standard Calibration
Preparation of Standards

Target Compounds

Dilution Dilution Dilution Dilution

31
 External Standard Calibration
Calculation of Results

Y = bX + a
[Peak Area]

b : SLOPE
2500 a : Y intercept

125 2500

[Concentration]

32
 Internal Standard Calibration
Preparation of Standards

Internal
Target Compounds Standard

Dilution Dilution Dilution Dilution

33
Internal Standard Calibration
Analysis of Vanillin

34
 Internal Standard Calibration
Calculation of Results
[Target Area / IS Area]

Y = bX + a
b : SLOPE
5.0 a : Intercept

1.67 T 2500
500
[Target Conc. / IS Conc.]
IS
Y = Target Conc. / IS Conc.
1.67 = Target Conc./ 100 ppm
Target Conc. = 167 ppm
35
 Data Kalibrasi Internal
IS St IS St C
ppm ppm Count Count 1,0558
1 0 ,1 1 4 ,2 627 662 1,4059 1,2882
1 0 ,1 1 7 ,2 628 809 1,7030 1,5224
1 0 ,1 2 0 ,0 4 624 950 1,9842 1,9110
1 0 ,1 2 3 ,1 629 1202 2,2871
Sample 1,4778
1 0 ,1 1 8 ,9 9 609 900 1,8800 1,4529
1 0 ,1 1 8 ,7 3 616 895 1,8540 1,4644
1 0 ,1 1 8 ,8 5 618 905 1,8660
0,9920
Mean r 0,9583
SD slope (b) -0,3237
RSD intercept (a)

36
 Advantage of external standard
calibration method
• Only the target compound separation can be
focused.

Target Target

37
 Disadvantage of external standard
calibration method
• Injection error will directly influence the
quantitative result.
10 uL injection 11 uL injection

100 ppm 110 ppm

38
 Advantage of internal standard
calibration method

• Injection error can be eliminated.

10 uL injection 11 uL injection
1100 2200
1000 2000
IS T
IS T

2000 / 1000 = 2 2200 / 1100 = 2

39
 Advantage of internal standard
calibration method

• Recovery in the pretreatment process can be

estimated. addition of IS (100 ppm)
standard IS (100 ppm) to actual sample
IS T
IS T
1000
950

Recovery = (950/1000)x100 = 95%

40
 Disadvantage of internal standard
calibration method
• Separation is slightly difficult.

IS
T IS T

T
IS

41
 Disadvantage of internal standard
calibration method

• It is difficult to look for the IS compound.

– The chemical structure of IS compound is
similar with one of target compound.
– IS sample is not existent in the actual sample.

42
 Calibration Method
• External standard calibration
– Separation is not difficult
– Injection error will directly influence the
quantitative result
• Internal standard calibration
– Injection error can be eliminated
– Recovery in the pretreatment procedure can be
estimated
– Separation is slightly difficult
– Difficult to look for the IS compound

43
 Standard additive
calibration method

Original
Sample T
Target

T
44
Standard additive
 ABC   EDC
calibration method AB : BC = ED : DC
100/10 = ED/7
10 = ED/7
ED = 70

T x104
B A
Peak Area
17
T

10x104
12

7
C
X =70 ppm
T

7x104
E D
-70 0 50 100 ppm
Added amount 45