A B C D
Pemisahan bisa terjadi karena adanya interaksi [polar dan nonpolar, ionik,
besaran partikel] antara Fasa Gerak, Fasa Diam, dan komponen itu sendiri.
Jika beberapa komponen tersebut lebih kuat interaksinya dengan fasa gerak dan
beberapa komponen lainnya lebih tertarik dengan fasa diamnya, maka
pemisahan dapat terjadi, di mana komponen – komponen yang lebih kuat
interaksinya dengan fasa gerak akan terelusi lebih dahulu / lebih cepat, sehingga
waktu tambat yang dibutuhkan untuk melewati sistem [waktu retensi] akan lebih
cepat dibanding komponen – komponen yang interaksinya lebih kuat dengan
fasa diamnya.
Fasa gerak lebih non- Fasa gerak lebih polar
polar dibandingkan fasa dibandingkan fasa
diamnya. Ex : Hexane, diamnya.
petroleum benzene Ex : MeOH, ACN, Air.
Fasa Diamnya lebih Fasa Diamnya lebih non-
polar dibandingkan fasa polar dibandingkan fasa
geraknya. Ex : Silika, geraknya.
Diol Ex: C-18, C-8, C4, NH2,
High cost operation. CN
Sistem awal. Lower cost operation.
Merupakan
perkembangan sistem
awal.
Mekanisme adsorpsi fasa normal
-Si-OH
-Si-OH Polar Non-polar -C-C-C-C-C-C-
-Si-OH
-Si-O-(CH2)17-CH3 H
-Si-O-(CH2)17-CH3 Non-polar Polar
-Si-O-(CH2)17-CH3
O
H
O O O O O O
| | | | | |
OSiOSiOSiOH OSiOSiOSiOR R = C18H37
| | | | | |
(octadecylsilyl
O O O O O O
silica “C18”)
| | | | | |
OSiOSiOSiOH OSiOSiOSiOR
| | | | | |
O O O O O O
R B 100 % R B 100 %
a a
t t
i i
o o
P P
e e
l l
a a
r r
u u
t t
Cukup dengan satu pompa saja [LC- Membutuhkan lebih dari satu
20AD/AT] mampu menarik lebih pompa [LC-20AD/AT/20AB],
dari satu fasa gerak secara minimal 2 pompa [untuk 2 jenis
bergantian. fasa gerak terpisah]. Mampu
Membutuhkan tambahan LPGE Unit menarik lebih dari satu fasa
[switch valve low pressure gerak secara bersamaan.
gradient], di shimadzu mampu Membutuhkan Degasser online
menarik 4 fasa gerak terpisah. [DGU-20A3].
Membutuhkan Degasser online Membutuhkan mixer.
[DGU-20A5].
Kemampuan gradient fasa gerak
Membutuhkan mixer. cukup baik bahkan untuk
Kemampuan gradient fasa gerak perbandingan yang ekstrim [99%
hanya teruji sampai 90% :10%. : 1%] sekalipun.
Untuk perbandingan yang ekstrim Sistem gradient high price.
[99% : 1%] kurang baik.
Sistem gradient low price.
Low dan High Pressure:
Terkait dengan kinerja Pompa dan
Kolom yang digunakan
SISTEM KCKT
Kolom Detektor
Integrator
Injektor
Fase Pompa
gerak
HPLC with Autosampler
Auto Injektor
Sampel
injektor
Valve
Fase Gerak
Detektor
Pompa B
Pompa A
Kolom
Mixer
Valve
Degasser
High Pressure Pump Purging Pump
1. isokratik
fasa gerak
2. gradient
1. Piston tunggal
Pompa
2. Piston ganda
1. Prekolom
Kolom
2. Standard
Pelarut Non-polar
n-Dekan > n-Heksan > n-Pentan > Siklohexan
Syarat fasa gerak HPLC
sampel loop
KOLOM
24
Guard Colomn Colomn Tubing
Mekanisme pemisahan pada Kolom
Fasa gerak
Sampel A dan B
Fasa diam
Kolom
Fasa gerak
ke detektor
A B
Waktu retensi (min)
Sinyal pada rekorder
1. Teoritical Plates [umumnya minimal 2000]
2. Tailing Factor [umumnya maksimal 1.5]
3. Resolusi [umumnya minimal 1.5]
4. Faktor Kapasitas [umumnya bergantung pada masing-
masing rule]
5. Efisiensi Kolom [HETP merupakan jarak antara plat-
plat teoritis]
Nilai-nilai dari parameter di atas harus memenuhi persyaratan dari standard masing
masing acuan rule yang digunakan. Misal untuk farmasi acuan pada CPOB, BPOM, FDA,
dsb.
Detektor
Eksitasi elektronik
kuvet
Ein Eout
l
Hk.Lambert-Beer
A= eCl = - log (Eout / Ein)
A= eCl = - log (Eout / Ein)
absorbansi
1 Kisaran linear
konsentrasi
Pemilihan panjang gelombang:
Kuantitatif / preparatif?
275 nm
208 nm
275 nm
208 nm
Detektor Photodiode Array
Sumber Monokromator
[mengubah
untuk
meletakkan/mel
serapan
Kuvet/sample
compartment/flow Monokromator
cell tempat untuk [mengubah cahaya Detektor photodiode array mendeteksi adanya
Sumber cahaya meletakkan/melewatk
polikromatis menjadi signal perubahan serapan dari banyak panjang
cahaya monokromatis] gelombang
[D2/W]
Detektor Photodiode Array
37
Hasil Ekstraksi dari Detektor PDA
Hasil Spektrum
Hasil
Kromatrogram
pada 254 nm
38
Detektor Spektrofluoresen
Excitation Wavelength
+ hn1 *
* hn2+
A* Emission Wavelength
hn1 hn2
Fluorescence
A A
Kuvet/sample
Sumber cahaya
compartment/flow cell
[Xenon]
tempat untuk
Monokromator [mengubah
meletakkan/melewatkan
cahaya polikromatis menjadi
sample
cahaya monokromatis]
Detektor photomultiplier
Monokromator mendeteksi adanya
[mengubah cahaya signal perubahan
polikromatis menjadi serapan
cahaya monokromatis]
Rancangan Cell untuk detektor Fluorescence
Reagen derivatisasi
Sistem optik
Kuvet/reference
compartment/flow cell
tempat untuk
meletakkan/melewatk
an reference
[reference side]
Miror
pemantul
cahaya
reference
Miror
pembagi
Sumber cahaya [W2] cahaya
Detektor silicon
photocell mendeteksi
adanya perubahan
sudut sinar.
Miror
Kuvet/ sample pemantu
compartment/ l cahaya
flow cell sample
tempat untuk
meletakkan/m
elewatkan
sample
[Sample side]
Detektor Refraktive Indeks
Detektor Konduktifitas
Konduktifitas sangat dipengaruhi temperatur.
Cell harus diletakkan pada kondisi temperatur terkontrol
k= (I/E)*(L/A)
A A
L elektroda
Perbandingan detektor
UV/ VIS RF RID CDD ECD
LOD 10 ppb 10 ppt 100 ppb 10 ppb 100 ppt
GC Yes Yes No No No
Peak A Peak B
height
0 1 2 3 4 5 6 7
Time (minutes) base
Acidic
Ionic Anion exchange/ion pair
Basic
Sample Cation exchange/ion pair
Keterangan gambar:
b. 6-Metilmerkaptopurin = 291,2 nm
c. 6-Merkaptopurin = 325,4
Kromatogram Analisis
Reference
• Cristina Legido-Quigley. 2008. Hplc theory introduction and
instrumentation , 6 th edition. Pharmaceutical Chemistry LTD,
New York
• Gurdeep RC,. Sham, KA. 2003. Instrumental Method Of Chemical
Analysis. Himalaya Publishing House. p. 2.624-2.638
• HPLC instrumentation – Agilent TechnologiesHPLC
instrumentation – Agilent Technologies
• http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chemed/sep/lc/hplc.htmhttp://elchem.ka
ist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/hplc.htm
• http://www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/Lqd_Chroma.html
http://www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/Lqd_Chroma.html
• http://weather.nmsu.edu/Teaching_Material/SOIL698/Student_Mat
erial/HPLChttp://weather.nmsu.edu/Teaching_Material/SOIL698/St
udent_Material/HPLC
HP1090/HPLCINJ.HTMHP1090/HPLCINJ.HTM
Reference
• http://test-
http://testeequipment.globalspec.com/LearnMore/Labware_Scienti
fic_Instruments/Analytiequipment.globalspec.com/LearnMore/Lab
ware_Scientific_Instruments/Analytical_Instruments/Chromatogra
phs/HPLC_Columnscal_Instruments/Chromatographs/HPLC_Colu
mns
• Introduction to HPLC – Agilent TechnologiesIntroduction to HPLC
– Agilent Technologies
• Skoog, H. and Neiman, S. 1998. Principles of Instrumental
Analysis. 5th ed. Harcourt Brace & Co. Orlando.
• Ravi Shankar, Textbook Of Pharmaceutical Analysis, Rx
Publications, 2005, p. 18-1 to 18-11
• Robert D. Braun, Introduction Instrumental Analysis, Pharma Book
Syndicate, 2006, p. 860 to 863