METODE PEMISAHAN OBAT 6

KROMATOGRAFI GAS & HPLC

I. KROMATOGRAFI GAS
kromatografi gas adalah teknik untuk
memisahkan senyawa atsiri dalam fase gas melalui
fase diam.
• Bila fase diam berupa zat padat, kita sebut cara
itu sebagai kromatografi gas-padat.
• Bila fase diam berupa zat cair, kita sebut cara itu
sebagai kromatografi gas-cair.

• Prinsip pemisahan: partisi

• Fase stasioner: cairan yang dilapiskan pada zat
penyangga padatan
• Fase mobil: gas seperti He, N2, H2
 KOMPONEN GC
• Tabung gas
• Pengatur aliran gas
• Oven + kolom
• Detektor
• Rekorder
OVEN KROMATOGRAFI GAS
 KOLOM GC
• 2 JENIS
Kolom isian
Kolom pipa terbuka

• SUHU KOLOM DIATUR

 DETEKTOR

• Mendeteksi komponen-komponen yang ada

dalam sampel
• Digambarkan dalam bentuk kromatogram
Contoh Kromatogram
 IDENTIFIKASI
• Dengan membandingkan dengan senyawa
standar
• Kondisi kromatografi harus sama dengan
sampel
• Diidentifikasi berdasarkan waktu retensi
 KUANTIFIKASI
• Integrator: persentase luas area puncak
sampel terhadap seluruh luas are puncak-
puncak yang ada pada kromatogram

Cara perhitungan:
• Standarisasi internal
• Standarisasi eksternal
• Normalisasi internal
 kromatografi gas adalah teknik untuk
memisahkan senyawa atsiri dalam fase gas
melalui fase diam.

• Bila fase diam berupa zat padat, kita sebut

cara itu sebagai kromatografi gas-padat.
• Bila fase diam berupa zat cair, kita sebut cara
itu sebagai kromatografi gas-cair.
Kromatografi gas

Syarat cuplikan:
> harus memiliki keatsirian yang cukup
(Volatil)
> stabil terhadap panas.

Populasi:
± 10~20% senyawa dapat dianalisis dengan
kromatografi gas.
Dengan kata lain

Senyawa yang dapat dianalisis dengan KG:

Pada suhu operasional KG (< 450oC)

1. molekul / senyawa dapat berubah fase gas
atau uap
2. Tidak terdekomposisi pada suhu tersebut
Bagian dasar kromatografi gas :
1. Sistem gas pembawa
2. Sistem pemasukan cuplikan
3. Sistem pemanasan kolom
4. Kolom
5. Sistem deteksi
6. Sistem pengolah data
 GAS DAN DETEKTOR
Detektor Gas Gas Gas
Pembawa Pembakar Pendukung
1. TCD He/Ar/N2/H2 __ _____
2. FID He/N2 H2 Udara
3. FTD He/N2 H2 Udara
4. FPD He/N2 H2 Udara
5. ECD N2 __ _____
 GAS DAN TEKANAN

Tipe Gas Tekanan Gas yang dibutuhkan

1. Gas Pembawa 7 kg/cm2 atau lebih tinggi
2. Gas Pembakar 2 kg/cm2 atau lebih tinggi
3. Gas Pendukung 2 kg/cm2 atau lebih tinggi
• Syarat gas sebagai fase gerak :
1. Lembam
2. Koefisien difusi gas rendah
3. Kemurnian tinggi
4. Mudah didapat dan murah
5. Cocok dengan detektor yang dipakai

• Contoh gas pembawa : N2, He, H2, Ar, dll

Bagan sistem kromatografi gas
 KROMATOGRAFI GAS
CARA

• Fase gerak: gas-gas berkemurnian tinggi

• Mengalir dari tabung gas melalui injektor,
masuk ke dalam kolom, ke dalam detektor
dan pembuangan.
• cuplikan dimasukkan ke injektor dengan
syringe / semprit.
SISTEM PEMASUKAN CUPLIKAN (INJEKTOR)

• Cuplikan harus dimasukan ke dalam kolom

sekaligus.
• Suhu gerbang suntik harus cukup panas untuk
menguapkan cuplikan sedemikian cepat
sehingga tidak menghilangkan keefisienan yang
disebabkan oleh cara penyuntikan.
• Sebaliknya harus cukup rendah untuk mencegah
penguraian akibat panas.
 KROMATOGRAFI GAS
CARA

• Injektor merupakan tempat masuknya sampel

ke dalam sistem KG
• dipanaskan antara 150 ~ 250oC guna
menguapkan sampel dan pelarutnya.
• Linarut-linarut yang berfase uap ini akan
digerakkan ke kolom oleh gas pembawa.
• Kolom berada dalam oven
yang terkontrol suhunya.
 KROMATOGRAFI GAS
CARA

• Laju migrasi linarut-linarut dalam kolom

ditentukan oleh : sifat-sifat fisikokimia
mereka, suhu dan komposisi kolom.
• Dalam kolom, linarut-linarut ini mengalir
dengan kecepatan yang berbeda-beda.
Linarut yang bergerak tercepat akan
keluar dari kolom paling awal dan diikuti
dengan sisanya.
KROMATOGRAFI GAS
CARA
 KROMATOGRAFI GAS
CARA
• Masing-masing linarut yang terelusi dalam kolom
akan memasuki detektor.
• Suatu sinyal listrik akan terbentuk akibat dari
interaksi linarut dengan detektor.
• Sinyal-sinyal yang terukur direkam oleh suatu
sistem data dan dirajah sebagai fungsi waktu
menjadi sebuah kromatogram.
 KROMATOGRAFI GAS
CARA
• Sebuah kromatogram ideal mempunyai deretan
puncak yang rapat namun tidak bertumpukkan.
Beberapa puncak yang bertumpukkan
dinamakan terelusi bersama.
• Waktu dan ukuran sebuah puncak digunakan
untuk identifikasi dan mengukur kadar senyawa
dalam cuplikan.
 KROMATOGRAFI GAS
CARA
• Ukuran puncak hasil analisis berhubungan
banyaknya senyawa dalam cuplikan.
• Bila konsentrasi sebuah senyawa bertambah
maka ukuran puncakpun membesar.
• Bila kolom dan semua kondisi operasi
kromatografi gas tetap sama, sebuah senyawa
akan mengalir dalam kolom dengan kecepatan
yang sama.
 KROMATOGRAFI GAS
CARA
• Sehingga sebuah senyawa akan dapat
diidentifikasikan oleh waktu yang dibutuhkannya
untuk bergerak dalam kolom (dinamakan waktu
tambat).
• Identifikasi senyawa tidak dapat hanya
ditentukan sendiri oleh waktu tambatnya.
• Senyawa yang asli, murni dan diketahui
kadarnya harus dianalisis dan waktu tambat
serta ukuran akan didapatkan.
• Nilai-nilai yang diperoleh dapat dibandingkan
dengan cuplikan yang tak dikenal guna
menentukan keberadaan senyawa yang dicari
(dengan membandingkan waktu tambat) dan
kadarnya (dengan membandingkan ukuran
puncak).
• Bila beberapa puncak bertumpang tindih maka
ketepatan pengukuran puncak-puncak ini
tidaklah mungkin didapat.
• Bila dua buah puncak memiliki waktu tambat
yang sama maka ketepatan identifikasi tidaklah
mungkin diperoleh.
• Oleh karena itu, tidaklah diinginkan terjadinya
puncak yang bertumpang tindih
atau terelusi bersamaan.
 SISTEM DETEKSI
( DETEKTOR)
Detektor Senyawa yang Jumlah
terdeteksi minimum
TCD Semua senyawa kecuali gas 10 ppm (10 ng)
pembawa
FID Senyawa organik 0,1 ppm (0,1 ng)
ECD Senyawa halogen/logam 0,1 ppb (0,1 pg)
organik
FTD Senyawa nitrogen/fosfor 1 ppb (1 pg)/
organik 0,1 ppb (0,1 pg)
FPD Senyawa sulfur/fosfor organik 10 ppb (10 ng)/
50 ppb (50 pg)
THERMAL CONDUCTIVITY DETECTOR (TCD)

Mendeteksi semua
senyawa yang
memiliki perbedaan
bahang dengan gas
pembawa.
FLAME IONIZATION DETECTOR (FID)

Sensitif terhadap
senyawa-senyawa
organik pada
umumnya.
ELECTRON CAPTURE DETECTOR (ECD)

Sensitif terhadap
senyawa-senyawa
halogen dan logam
organik.
Biasanya untuk analisis
pestisida organoklorin
FLAME THERMIONIC DETECTOR (FTD /NPD)

Sensitif terhadap senyawa

fosfor organik dan
nitrogen organik.
Biasanya untuk analisis
pestisida dan produk
medikal.
FLAME PHOTOMETRIC DETECTOR (FPD)

Sensitif terhadap
senyawa-senyawa
fosfor organik,
sulfur organik dan
timah organik.
Biasanya untuk
analisis pestisida
dan flavour.
 SISTEM PENGOLAH DATA
• Sinyal yang didapat dari detektor akan direkam
dalam bentuk kromatogram dan diolah.
KROMATOGRAFI CAIRAN KERJA TINGGI
HPLC
II. KROMATOGRAFI CAIRAN KINERJA TINGGI (HPLC)
• Kromatografi partisi cairan-cairan
• Fase stasioner: cairan yang dilapiskan pada
zat padat penyangga
• Fase mobil: pelarut/cairan
SUSUNAN ALAT
KOLOM HPLC
 IDENTIFIKASI dan KUANTIFIKASI

• Identifikasi dengan membandingkan waktu

retensi sampel dengan standar
• Kondisi HPLC sampel harus sama dengan
standar
• Kuantifikasi: seperti GC
 High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
Peralatan HPLC secara prinsip terdiri dari :
• Tempat pelarut
• Pompa
• Tempat injeksi sampel
• Kolom
• Detektor
• Rekorder
i
High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) [lanjutan]
1. Fasa mobile (pelarut)
pelarut yang digunakan harus dilakukan degassing untuk mengeluarkan
gas terlarut yang tidak diinginkan.
2. Sistem pompa
ada dua jenis pompa, yang mendasari pemakaiannya yaitu : tekanan tetap
dan volume tetap.
3. Flow controller (pengendali aliran)
untuk menstabilkan aliran fasa mobile akibat adanya perubahan tekanan
gas, temperatur dan viskositas.
4. Kolom
Tidak memerlukan temperatur yang tinggi, karena sifat ikatan kimia
terhadap fasa stasioner sangat sensitif terhadap temperatur yang tinggi.
 High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) [lanjutan]
5. Detektor
karakteristik detektor untuk HPLC
- sensivitasnya tinggi
- respon yang menyeluruh terhadap sampel
- tidak meruska sampel
- tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan aliran fasa
mobile
- dapat beroperasi secara terus menerus.

6. Rekaorder
Mengeluarkan output berupa kromatogram.
 Keuntungan HPLC
• Cepat
• Resolusi
• Sensitivitas detektor
• Kolom yang dapat digunakan kembali
• Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik
• Mudah rekoveri sampel
Kromatografi Kolom Terbuka

Sistem pemasukan sampel: manual, tidak volumetrik 

Color Injector
Waktu analisis lama, mengandalkan gaya grafitasi dan
kapiler  pompa
Hasil pemisahan kurang baik  pengemasan kolom
Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk analit tidak
berwarna  Detektor
Kesulitan penghitungan kadar  integrator
Injector:
KCKT Sistem pemasukan
dikembangkan sampel:
dari kromatografi sample
kolom terbukaloop
untukdan
menjawab
robotik injektor, sangat
kekurang-kekurangan volumetrik
tersebut

Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik

Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil,
tekanan dapat dibuat besar  Hasil pemisahan baik
Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus
berwarna)
Integrator:dilengkapi komputer, bisa menghitung AuC 
mudah penghitungan kadar 

Sehingga disebut: Kinerja Tinggi

 BAGAN SISTEM KCKT

detektor

kolom
injektor
oven
pompa

Wadah
solven
integrator
WADAH FASE GERAK

Merupakan tandon berisi fase gerak

Mempunyai sistem penyaring
POMPA
Merupakan sistem agar fase gerak mengalir.
Kinerja pompa yang diinginkan :
 Tekanan yang dihasilkan tinggi

 Fluktuasi tekanan rendah

 Kecepatan aliran fase gerak tepat
 INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke dalam sistem
KCKT

Pump Pump

Column

Column

[INJECT] [LOAD]
 Sistem sample loop injektor

posisi load Posisi inject

pompa kolom pompa kolom

sample loop
 OVEN KOLOM – instrumen pemanas
Syarat :
1. Keseragaman temperatur yang baik
2. Kestabilan temperatur yang baik
3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik
Kolom pada KCKT

> Penampang: baja tahan karat, tahan tekanan tinggi

Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih
kompak, hasil pemisahan lebih baik
Dapat dipakai berulang
DETEKTOR HPLC

Yang umum dipakai

 Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)
 Detektor Photodiode Array (PDA)
 Detektor Fluorescence (RF)
 Detektor Konduktivitas (CDD)
 Detektor Refraktive Indeks (RID)
 Detektor Elektrokimia (ECD)
 Detektor spektrometer massa
 DETEKTOR SPEKTROFOTOMETER UV/VIS

Prinsip: penyerapan sebagian energi (hv) oleh molekul pada panjang

gelombang tertentu => tereksitasi elektronik

Eksitasi elektronik

kuvet

Ein Eout

l
Hk.Lambert-Beer
A= eCl = - log (Eout / Ein)
A= eCl = - log (Eout / Ein)
absorbansi

Kisaran linear
1

konsentrasi
Pemilihan pjg gelb.: quantitative / preparative?
275 nm
208 nm

275 nm
208 nm
CONTOH KROMATOGRAM HPLC
Detektor Photodiode Array

Sample Cell Grating

satu elemen dapat

Mendeteksi absorban
D2 / W lamp Pada satu pjg gelb..

512 Elements Photodiode Array

Detektor Photodiode Array : Kromatogram 3D
Spektrum
kromatogram
Absorbansi

lb.
ge
ng
nja
Pa

waktu
Detektor Photodiode Array
 Puncak dapat di identifikasi dengan spektrum UV.
 Pemeriksaan kemurnian puncak dapat dilakukan.
--overlap 3 spektrum
--rasio kromatogram
--perbandingan threshold dan similarity index.
Detektor Spektrofluoresen

Excitation Wavelength

+ hn1 *
* hn2+
A* Emission Wavelength

hn1 hn2
Fluorescence
A A
Rancangan Cell untuk detektor Fluorescence
Reagen derivatisasi
Reagen OPA untuk amine primer
A
CHO
+ R-NH2 N-R
CHO A
o-phthalaldhyde
(OPA)
Reagen ADAM untuk asam lemak
+ R-COOH
CHN2 CH2OCOR
9-anthryldiazomethane
(ADAM)
 Detektor Refraktive Indeks

Sistem optik
Detektor Refraktive Indeks
 BAGIAN DARI SISTEM HPLC

Kromatogram gula
 Analytical Conditions
 Column : Shim-pack CLC-NH2
 Mobile phase : Acetonitrile /
water
=7/3
 Flow rate : 1.0 mL/min
 Temperature : Ambient
 Peaks
1. Glycerol
2. Xylose
3. Fructose
4. Glucose
5. Sucrose
6. Manose
7. Lactose
Detektor Konduktifitas
V K (conductivity) = I [A] / E [V]
=A [cm2] / L [cm] * k
I (k : specific conductivity)

k= (I/E)*(L/A)
A A

L elektroda
Detektor Konduktifitas
 Konduktifitas sangat dipengaruhi temperatur.
 Cell harus diletakkan pada kondisi temperatur terkontrol
Kromatogram anion dalam air laut
 Analytical Conditions
 Column : Shim-pack IC-A3
 Mobile phase :

8.0 mM p-hydroxybenzoic acid

3.2 mM Bis-Tris *
 Flow rate : 1.5 mL/min
 Temperature : 40 C
 Injection Volume : 100 uL
 Peaks
 1. F (1.4 ppm)
 2. Cl (10200 ppm)
 3. NO2 (10 ppm)
 4. Br (43 ppm)
 5. NO3 (44 ppm)
 6. SO4 (431 ppm)

Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane

Perbandingan detektor
UV/ VIS RF RID CDD ECD
LOD 10 ppb 10 ppt 100 ppb 10 ppb 100 ppt
GC Yes Yes No No No

LOD : Limit deteksi (S/N=3)

GC : Gradient Compatibility