BAB I

PENDAHULUAN

3.1 Latar Belakang

Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase
diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat padat atau
zat cair, sedangkan fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Dalam kromatografi
fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam dapat berupa zat padat atau
zat cair. Dalam makalah ini akan dijelaskan salah satu dari sistem kromatografi yaitu
kromatografi gas.
Kromatografi gas merupakan salah satu jenis teknik analisis yang semakin
banyak diamati, karena terbukti dapat digunakan untuk menyelesaikan berbagai
masalah analisis. Pada awalnya hanya digunakan untuk analisis gas saja. Akan tetapi
dengan kemajuan ilmu dan teknologi, akhirnya dapat digunakan untuk analisis bahan
cair dan padat termasuk bahan polimer. Pengembangan kromatografi gas (KG)
berpengaruh sangat penting pada pengembangan metode kromatografi cair (KC).
dapat dipakai untuk setiap campuran dimana semua komponennya mempunyai
tekanan uap yang berarti, suhu tekanan uap yang dipakai untuk proses pemisahan.
GC dapat digunakan untuk menguji kemurnian dari bahan tertentu, atau memisahkan
berbagai komponen dari campuran. Dalam beberapa situasi, GC dapat membantu
dalam mengidentifikasi sebuah kompleks.

3.1 Tujuan
 Mengetahui prinsip kromatografi gas.
 Mengetahui derivatisasi senyawa pada kromatografi gas.
 Mengetahui prosedur validasi metode analisis yang pada analisa beberapa sediaan
obat dengan kromatografi gas.

1
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Kromatografi gas merupakan metode untuk pemisahan campuran yang komponen-

komponennya dapat menguap namun tidak terurai pada suhu percobaan yaitu dapat mencapai
suhu 400 oC. Pemisahan terjadi karena adanya perbedaan dalam kemampuan distribusi analit
di antara fase gerak dan fase diam di dalam kolom pada kecepatan dan waktu berbeda.
Prinsip dasar dari kromatografi gas yaitu sampel diuapkan kemudian dibawa oleh fase
gerak menuju kolom, selanjutnya didalam kolom akan dielusi dan terjadilah proses pemisahan
yang selanjutnya akan dideteksi oleh detektor yang sesuai. Pemisahan pada kromatografi gas
didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin
terjadi antara solut dengan fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solute dari
ujung kolom lalu menghantarkannya ke detektor.
Ada dua jenis kromatografi gas :
1. Kromatografi Gas Cair (KGC)
KGC menggunakan fase diam berupa cairan dan mekanisme sorpsi-nya adalah partisi.
2. Kromatografi Gas Padat (KGP)
KGP menggunakan fase diam padatan dan mekanisme sorpsi-nya adalah adsorpsi
permukaan. (Gandjar, Rahman, 2007)
Terdapat beberapa keuntungan yang dapat diperoleh dari penggunaan kromatografi gas,
keuntungan tersebut diantaranya:
1. Proses analisisnya cepat
2. Efisien, resolusinya tinggi
3. Sensitif
4. Analisis kuantitatif dengan akurasi yang tinggi
5. Memerlukan sampel dalam jumlah kecil
6. Handal dan relatif sederhana
7. Tidak mahal
Selain beberapa keuntungan tersebut terdapat pula kekurangan dari penggunaan
kromatografi gas, kekurangan tersebut diantaranya:
1. Terbatas pada sampel-sampel yang mudah menguap
2. Tidak sesuai untuk sampel yan termolabil
3. Cukup sulit untuk preparasi sampel dalam jumlah besar

2
Instrumen Kromatografi Gas

Gambar 1. Instrumen pada KG

Bagian-bagian utama dari sebuah kromatografi gas, yaitu : kontrol dan penyedia gas
pembawa, ruang suntik sampel, kolom yang diletakkan dalam oven yang dikontrol secara
termostatik, sistem deteksi dan pencatat ( detektor dan recorder), serta komputer yang
dilengkapi perangkat pengolah data. ( Gandjar, Rahman, 2007)
1. Fase Gerak pada KG
Fase gerak pada KG disebut dengan gas pembawa karena tujuannya adalah untuk
membawa solut ke kolom sehingga gas pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas. Gas
pembawa harus bersifatinert dan harus sangat murni. Gas yang sering digunakan, yaitu
nitrogen, hidrogen, helium, dan argon.
2. Ruang suntik sampel
Fungsi dari ruang suntik sampel adalah untuk menghantarkan sampel ke dalam aliran gas
pembawa. Ruang suntik ini harus dipanaskan tersendiri ( terpisah dari kolom) dan biasanya
10-15oC lebih tinggi daripada suhu kolom maksimum. Jadi, seluruh sampel akan menguap
segera setelah sampel disuntikkan.
3. Kolom
Kolom merupakan tempat memisahkan masing-masing komponen cuplikan karena di
dalamnya terdapat fase diam. Kolom biasanya terbuat dari baja tahan karat, nikel, serta
kaca. Ketika menggambarkan suatu kolom, seseorang biasanya menyatakan panjang kolom
(dalam meter), diameter kolom ( dalam millimeter), ketebalan lapisan fase diam ( dalam

3
 micrometer, dan jenis fase diam. Banyak bahan kimia yang dapat dipakai sebagai fase
diam. Fase diam yang dipakai pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi
polar. Jenis fase diam menentukan urutan elusi komponen-komponen dalam cairan.
Fase Diam Polaritas Golongan Suhu
Sampel Maksimum

Squalen Non polar Hidrokarbon 125oC

Apiezon L Non polar Hidrokarbon, 300 oC

ester, eter
Metal silicon Non polar Steroid, pestisida, 300 oC
alkaloid, ester
Dionil ptalat Semi Semua jenis 170 oC
polar
Dietilenglikolsuksinat Polar Ester 200 oC

Carbowax 20M Polar Alkohol,amina, 250 oC

aromatic, keton
Tabel 1. Jenis Fase Diam dan Penggunaannya

Pemisahan dengan KG didasarkan pada dua sifat senyawa yang dipisahkan, yaitu kelarutan
senyawa dalam cairan tertentu dan tekanan uap atau keatsiriannya. Karena tekanan uap
berbanding langsung dengan suhu, maka suhu merupakan faktor yang utama pada KG.
Pemisahan pada KG dapat dilakukan pada suhu tetap yang biasanya disebut dengan
pemisahan isothermal dan dapat dilakukan menggunakan suhu yang berubah secara
terkendali yang disebut dengan pemisahan suhu terprogram.
4. Detektor
Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom tempat keluar fase gerak
yang membawa komponen hasil pemisahan. Detektor ini berfungsi mengubah sinyal gas
pembawa dan komponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik, dimana sinyal elektronik
ini berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif terhadap komponen-komponen yang
terpisah di antara fase diam dan fase gerak.
Selektif Batas
Batas
No. Jenis Detektor Terhadap Terkecil
Linieritas
Senyawa Pendeteksian

4
 Detektor daya
4 -5
1 hantar panas Tidak selektif 10 10 g/ml
(TCD)
Semua
Detektor ionisasi 7 -11
2 senyawa 10 2 x 10 g/ml
nyala (FID)
organik
Detektor
Sulfur dan 3 -12
3 fotometrik nyala 10 2 x 10 g/ml
fosfor organik
(FPD)
Detektor termionik Nitrogen dan 3 -10
4 10 2 x 10 g/ml
nyala (FTD) fosfor organik
Detektor Senyawa
2 -13
5 penangkap bersifat 5 x 10 10 g/ml
elektron (ECD) elektronegatif

Tabel 2. Jenis-Jenis DetektorKomputer

5. Komputer
Komputer pada sistem KG berperan sebagai suatu alat pengolah data ( data processor).
Informasi yang diperoleh dapat dimanfaatkan dalam analisis kualitatif, biasanya dengan
membandingkan waktu retensi sampel dalam kondisi analisis yang sama. Sedangkan, untuk
analisi kuantitatif biasanya dilakukan dengan perhitungan relative tinggi atau luas puncak
kromatogram sampel melalui metode baku luar (external standar) atau baku dalam
(internal standar). (Gandjar, Rahman, 2007)

Derivatisasi pada Kromatografi Gas

Derivatisasi merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu senyawa menjadi
senyawa lain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuasi untuk dilakukan analisis menggunakan
kromatografi gas. Alasan dilakukannya derivatisasi :
1. Volatilitas dan stabilitas senyawa yang tidak memungkinkan untuk dianalisis secara KG.
2. Meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram.
3. Meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap/
4. Meningkatkan deteksi, missal : senyawa steroid dan kolesterol
5. Meningkatkan stabilitas.
6. Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detector tangkap electron (ECD). (Gandjar,
Rahman, 2007)
Beberapa cara derivatisasi yang dilakukan pada kromatografi gas :
1. Esterifikasi

5
 Digunakan untuk membuat derivate gugus karboksilat. Pengubahan gugus karboksil
menjadi esternya akan meningkatkan volatilitas karena menurunkan ikatan hidrogen.
Derivatisasi dengan esterifikasi dapat dilakukan dengan esterifikasi Fisher biasa dalam
asam kuat. Reaksi yang terjadi:

H+ atau
R-OH + R’-COOH R’-COOR
BF3

2. Asilasi
Biasanya digunakan pada sampel yang mengandung fenol, alkohol, atau amin primer atau
sekunder. Derivatisasi dengan cara ini dilakukan menggunakan asam asetat anhidrat dan
katalis (misalkan asam asetat, asam p-toluen sulfonat, piridin, N-metil amidazol) sebelum
penyuntikan ke kromatografi gas ( pre column derivatization) atau dilakukan penyuntikan
di dalam kolom (on column derivatization). Asilasi umumnya memberikan kromatogram
yang baik.
3. Alkilasi
Derivate dapat dilakukan dengan sintesis Wiliamson, yakni alcohol atau fenol ditambah
alkil atau benzil halida dengan adanya basa. Jenis agen penderivat yang saat ini digunakan
hanya α-bromo-2,3,4,5,6-pentafluorotoluen.
4. Siliasi
Derivat silil digunakan untuk menggantikan eter alkil untuk analisis sampel yang bersifat
polar yang tidak mudah menguap. Derivate yang paling sering dibuat adalah trimetilsilil.
Keuntungan derivatisasi dengan cara siliasi : eter silil mudah dibuat untuk banyak gugus
fungsi, dapat dilakukan dalam vial kaca dengan tutu bersekrup yang dilapisi teflon, pereaksi
siliasi sering kali mampu melarutkan sampel, sering terjadi pada suhu kamar. Laju reaksi
derivatisasi dapat ditingkatkan dengan penambahan katalis asam seperti trimetilklorosilan
atau katalis basa seperti piridin.
5. Kondensasi
Untuk analisis sampel yang mengandung gugus aldehid atau keton dengan tujuan
mencegah terjadinya enolisasi karena ikatan hidrogen, meningkatkan resolusi karena
adanya zat penganggu, dan meningkatkan sensitifitas deteksi.
6. Siklisasi
Penutupan gugus polar melalui siklisasi dilakukan pada senyawa yang mengandung dua
gugus fungsi yang kira-kira sangat mudah dibuat heterosiklis beratom 5 atau 6. Beberapa

6
jenis heterosiklis yang terbentuk : ketal, boronat, triazin, dan fosfit. Tujuannya biasanya
untuk membuat suatu senyawa menjadi lebih volatil (mudah menguap).
(Gandjar, Rahman, 2007)

7
 BAB III
ISI

3.1 Chiral Analysis of Derivatized Amino Acids From Kefir By Gas Chromatography
Pada kali ini kami mengambil salah satu jurnal yang berjudul “Chiral Analysis of
Derivated Amino Acids From Kefir by Gas Chromatography”. Tujuan dari peneliatian ini yaitu
Untuk memisahkan derivat asam amino dengan kromatografi gas yang baik menggunakan
analisa kiral.
Dalam proses penelitian kali ini kita menggunakan alat yaitu kromatografi gas.
Berikut ini adalah spesifikasi dari kromatografi gas yang akan kita gunakan, yaitu :
• Dilengkapi dengan deteksi ionisasi api dan port petunjuk-injection.
• Data diperoleh dengan software(DataApex, Republik Ceko)
• Gas pembawa adalah nitrogen dan dilakukan pada aliran konstan (1 mL / menit)
• Suntikan dibuat dengan rasio split 20/01, suhu injektor diatur pada 200 ° C dan detektor
pada 250 ° C
• Kolom CG kiral adalah octakis komersial (3-O-butanoyl-2,6-di-On-pentil)-γ-
siklodekstrin (Lipodex E)
Sementara itu, bahan yang akan digunakan untuk penelitian ini yaitu larutan asam amino yang
mengandung 19 jenis asam amino (masing-masing asam amino dengan berat 10 mg) yang
dilarutkan ke dalam 10 ml pelarut (60 : 32 : 8 H2O : EtOH : Piridin) lalu di vortex.
Pada penelitian ini kita akan membuat 2 jenis larutan, yaitu larutan sampel dan
larutan standar. Pertama-tama kita akan membuat larutan standar. Berikut ini adalah langkah-
langkah untuk membuat larutan standar, yaitu :
1. Timbang 1 mg asam amino. Masukkan dalam tabung 1,5 mL Eppendorf
2. Tambahkan 100 μL larutan campuran alkohol : air : piridin (60:32:8) lalu tambahkan 6
μL chloroformate. Vortex selama 5 detik
3. Akan terjadi derivatisasi dimana lapisan air menjadi buran sedangkan yang mengadung
zat organik tetap tampak jelas
4. Terbentuk larutan standar asam amino
Setelah selesai membuat larutan standar. Lalu kita membuat larutan sampel. Berikut ini adalah
langkah-langkah untuk membuat larutan sampel, yaitu :
a. Larutan Sampel 1
1. Ambil 5% dari butiran AGK1 CIDCA yang sudah ditumbuhkan di tempat steril
2. Lalu suspensikan ke dalam 100 ml susu

8
 3. Inkubasikan pada suhu 30°C selama 24 jam
b. Larutan Sampel 2
1. Ambil 5% dari biji-bijian AGK1 CIDCA kefir yang sudah ditumbuhkan di tempat
steril
2. Lalu suspensikan ke dalam 100 ml susu UHT skaim
Setelah semua larutan selesai dibuat, lalu lanjutkan dengan langkah-langkah berikut ini yaitu:
1. Tambahkan sedikit larutan standar dan 20 μL asam trikloroasetat ke 10 mL larutan
sampel kefir lalu sentrifugasi selama 15 menit pada 4200 rpm
2. Tuangkan supernatan ke atas kolom pertukaran ion lalu cucilah residu dengan melewati
10 ml air deionisasi melalu kolom
3. Asam amino kemudian dielusi dengan 10 mL Amonium hidroksida 7M
4. Kemudian, solusio dikeringkan dengan penguapan pada suhu 40 ° C dan di bawah
aliran nitrogen. Kolom dicuci dengan air deionisasi dan diregenerasi dengan 3 M HCl

Hasil dan Pembahasan

Untuk proses pemisahan menggunakan kromatografi gas pada pembahasan kali ini
menggunakan kombinasi etil alkohol dan etil kloroformat untuk menemukan pemisahan asam
amino. Selain itu juga ntuk menemukan jumlah maksimum asam amino yang dapat terpisah
secara enantiomer terpisah. Kombinasi tersebut menggunakan metil, isobutil, dan klorometil
kloroformat sedangkan ECF sebagai reagen pemisah.
Berikut hasil retensi dan faktor enantioseparation

Gambar 1: Retensi

9
Gambar 2: Faktor Enantioseparation

Dari hasil retensi menggunakan kombinasi fase gerak tersebut, asam amino dapat terpisah
dengan baik dan menunjukkan retensi tinggi menggunakan IbuCF. Tetapi terdapat
pengecualian yaitu tidak bisa digunakan untuk Metionin yang dapat terpisah baik
menggunakan CIMCF/EtOH dan Asparagin menggunakan ECF dan IbuCF
Untuk asam amino yang lebih volatile digunakan fourinated alcohols (etanol diganti dengan
FEtOH atau PFHexOH). Hasilnya dapat dilihat pada gambar berikut:

Gambar 3: Retensi

10
Gambar 4: Faktor Enantioseparation

Dari hasil yang didapatkan Retensi lebih rendah dibandingkan dengan kombinasi sebelumnya,
maka suhu yang digunakan juga bisa lebih rendah. Sedangkan faktor pemisahan hampir sama
kecuali Isoleusin dan Valin punya punya faktor pemisahan yang lebih besar
Validasi Metode pada sampel Kefir
1. LOQ

11
Dihitung menggunakan rasio area peak turunan asam amino dengan area peak n-tetradecana
dengan injeksi internal standar,
2. Linearitas
Untuk linearitas menghitung persamaan regeresi menggunakan ANOVA dan hasilnya
berbeda, walupun granul dari kefir sama setelah ditumbuhkan pada media berbeda.
3. Presisi
Standar dan sampel ditambah alkohol dengan 150 µL larutan asam amino standar.
Hasilnya adalah:
a. untuk yang ditambah dengan alkohol, RSD >15% (buruk)
b. Larutan standar asam amino RSD<10%

12
 4. Akurasi
Recovery test dilakukan dengan penambahan alkohol pada sampel 1 dan 2 dengan 50
dan 150 µL larutan asam amino standar (konsentrasi ringgi dan rendah, kira0-kira 250
dan 750 ppm). Hasilnya adalah:
Relative recovery
a. Sampel 1: 79% (s.d. = 6.7) dan 94% (s.d. = 4.5)
b. Sampel 2: 84% (s.d. = 4.1) and 93% (s.d = 4.3)

Kromatogram

13
Kesimpulan
• ECF/EtOH terelusi lebih cepat dibandingkan IbuCF/EtOH
• Proline sebagai baseline
• Kedua enantiomers terdeteksi dan terukur pada sampel kefir
• Metode pemisahan ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi dan memisahkan asam
amino bebas dalam produk susu seperti kefir grains grow dan skimmed UHT milk

3.2 One-step extraction and quantitation of toxic alcohols and ethylene glycol in plasma
by capillary gas chromatography (GC) with flame ionization detection (FID)
Pendahuluan
Keracunan dengan alkohol yang mudah menguap (VA) metanol dan isopropanol
(metabolit aseton), dan/atau etilena glikol (EG) membutuhkan metode analisis cepat dan akurat
untuk pengobatan yang efektif di departemen darurat (ED). Etanol juga biasa ikut tertelan
dengan zat ini dan karena itu termasuk dalam metode analisis volatile. VA dan EG adalah aditif
umum di banyak rumah tangga dan komersial produk, dan konsumsi sehingga beracun tidak
jarang. Farmakologi, toksisitas VA dan EG dikaitkan dengan metabolitnya menyebabkan
asidosis berat, sedangkan senyawa induk berkontribusi pada peningkatan kesenjangan osmolal.
Efek ini menyebabkan perubahan pola peningkatan gap osmolal diikuti oleh gap anion
meningkat dari waktu ke waktu. Hal ini umumnya dicatat dalam ED, meskipun kesenjangan
osmolal tidak disarankan untuk digunakan sebagai skrining untuk keracunan alkohol beracun.
Sebaliknya, identifikasi cepat dan spesifik penyebab dari peningkatan osmolal dan / atau
kesenjangan anion dengan VA atau pengujian EG membantu memandu strategi pengobatan
klinis.
Metode analisis enzimatik dari VA dan EG telah dikembangkan, meskipun mereka kurang
spesifik dan tidak dapat di-multipleksasi untuk identifikasi beberapa glikol dan / atau VA
secara bersamaan. Sebagai hasil dari kinerja metode sederhana dengan analisis enzimatik,
metode yang lebih spesifik dan kuat untuk analisis VA dan EG yang umum digunakan yang
mempekerjakan kromatografi gas (GC) untuk analisis. Beragam metode GC telah
dikembangkan untuk menganalisis VA dan EG, dan banyak analisis berhasil menunjukkan
gabungan untuk VA dan EG. Sayangnya, metode ini memerlukan prosedur ekstraksi yang
panjang atau menghasilkan matriks dengan kandungan garam yang tinggi yang mungkin
membatasi analit transisi ke fase gas dan menyumbat filter pre-kolom. Metode lain
menggunakan injeksi headspace yang membutuhkan derivatisasi untuk analisis glikol, dan
lebih mahal untuk diterapkan daripada injektor cair. Derivatisasi diperlukan untuk injeksi
14
headspace sebagai glikol yang mendidih pada suhu >180 ° C. Perlu dicatat bahwa meskipun
kombinasi metode VA dan EG diterbitkan 20 tahun yang lalu, teknologi dan filter yang
digunakan untuk metode ekstraksi tidak lagi tersedia, menunjukkan bahwa itu adalah waktu
untuk kembali mengunjungi-Metode yang pada baru, lebih platform tersedia.
Tujuan
Analisis klinis alkohol yang mudah menguap (misalnya metanol, etanol, isopropanol,
dan metabolit aseton) dan etilena glikol (EG) umumnya menggunakan kromatografi gas (GC)
metode terpisah untuk analisis. Di sini, dijelaskan Metode untuk analisis gabungan dari alkohol
yang mudah menguap dan EG.
Desain dan Metode
Alkohol Volatile dan EG diekstraksi dengan 2: 1 (v: v) asetonitril mengandung standar
internal (IS) 1,2 butanediol (untuk EG) dan n-propanol (untuk alkohol). Sampel dianalisis pada
Agilent 6890 GC FID. Metode yg dievaluasi untuk presisi, akurasi, reproduktifitas, linearitas,
selektivitas dan limit kuantitasi (LOQ), diikuti oleh korelasi dengan metode GC yang ada
dengan menggunakan sampel pasien, Bio-Rad QC, dan di rumah disiapkan bahan QC.
Material dan Metode
 Larutan Sampel

Sampel dikumpulkan di Li-heparin tabung pemisah plasma (BD Biosciences,

367962), dipisahkan dengan sentrifugasi, dianalisis dan dilaporkan. Plasma sisa
disimpan pada -20 ° C sebelum analisis.
Sampel positif untuk metanol, isopropanol, aseton, atau etilena glikol itu
kembali dianalisis dengan menggunakan metode analisis VA atau EG di CLS pada saat
metode perbandingan untuk memperhitungkan ketidakstabilan sampel selama
penyimpanan. Jika diperlukan, sampel paten negatif untuk VA dan EG dibubuhi dengan
larutan standar untuk menyediakan berbagai sumber sampel dan memungkinkan
metode perbandingan dalam jangka waktu yang sesuai.
Pengembangan metode dan validasi dilakukan pada dua kromatografi gas yang
terpisah. Hal ini diklasifikasikan sebagai peningkatan jaminan kualitas / proses oleh
Badan Etik Riset University of Calgary dan diberikan pembebasan dari etika ulasan.
 Reagen

 Omnisolv metanol (MX0486), etanol (EX0278), isopropanol (PX1834) dan

aseton (AX0116) serta n-propil alkohol (CAPX1824-6) dan asetonitril
(CAAX0142-6)

15
  Etilena glikol (85.978), propilen glikol (398.039), 1,2 butanadiol (177.652), 2,3
butanadiol (177.652), dan dietilen glikol (H26456)

 Gliserol (G33)

 Obat serum gratis (DFS; 456), serta Liquicheck L1 (383) dan L2 (384) bahan
QC

 Clinical Laboratory Reagent Water (CLRW) digunakan untuk penyusunan

standar kalibrasi dan injeksi blangko.

 GC

Analisis kromatografi gas (GC) dilakukan menggunakan Agilent 6890 sistem

dilengkapi dengan detektor ionisasi nyala (FID) dan Agilent 7683 autosampler
menggunakan helium sebagai gas pembawa. Pemisahan kromatografi dicapai pada 30 m ×
530 m RTX-200 leburan silika kolom (Restek, 15085, Brockville, Kanada) dengan silika
dinonaktifkan leburan (10 m × 530 m) Kolom penjaga (Agilent, 160-2535-10). Data dicatat
dan dianalisis menggunakan software Agilent Chemstation menggunakan rasio luas puncak
analit dengan standar internal dibandingkan dengan standar 6 titik kurva untuk analisis
kuantitatif masing-masing analit.

16
Volume Injeksi 1 uL dengan aliran split
(2: 1). Program injector termasuk 3 air
dan 5 sampel pra-injeksi jarum, dan 5
air pasca-injeksi jarum.

Langkah pembersihan ini diperlukan

Pasca-injeksi waktu tinggal ditetapkan
untuk 0,25 menit untuk
memungkinkan sampel loading
efisien.
untuk memastikan baseline bersih
dan elusi lengkap glikol dari kolom.
Total waktu lari dari injeksi injeksi
adalah sekitar 15 menit, termasuk
suhu re-equilibrium dan pra-injeksi.

Laju aliran gas kolom ditetapkan pada

4 mL / menit selama 1 menit dan
menggenjot produksinya sampai 15
mL / menit pada 60 mL / menit2 dan
diadakan untuk sisa jalankan.
Program aliran ini diperlukan untuk
memperoleh baik EG bentuk puncak
dan pemisahan VA efektif.
Suhu lubang injeksi ditetapkan untuk
250°C, dan suhu oven pada 45°C
selama 3 menit, dan meningkat
menjadi 250°C pada 70°C/menit
dimana diadakan untuk tambahan 2
menit untuk membersihkan kolom
dengan setiap injeksi.

 Kalibrasi dan QC prepasasi sampel

Larutan stok alkohol Volatile kalibrasi yang mengandung metanol, etanol,

isopropanol dan aseton diperoleh dari cerilliant (A-057, A-071, Round Rock, Amerika
Serikat). EG dan PG yang dibubuhi ke dalam larutan standar kalibrasi pada konsentrasi
set. Kalibrator disiapkan dalam konsentrasi akhir 5% albumin manusia dari stok 25%
(Alburex 25, 02274663). Persiapan dan konsentrasi akhir kalibrator termasuk dalam
Informasi Tambahan. Kurva kalibrasi dipasang ke kuadrat garis cocok untuk EG dan
PG untuk memperhitungkan pemulihan non-linear dari senyawa ini di rendah dan tinggi
tingkat dari matriks protein, sementara VA ditetapkan dengan kurva kalibrasi linear.
Kalibrasi yang diperlukan berikut pemeliharaan alat, atau bila beralih analitis atau
penjaga kolom (kira-kira setiap 3-6 bulan).
 Prepasasi sampel dan ekstrasi

Prosedur ekstraksi dengan pengendapan protein asetonitril digunakan untuk

deproteinasi sampel.

17
 400 uL asetonitril
Sampel divortex selama
mengandung standar
beberapa detik untuk
internal (10 mmol / L N-
memastikan lengkap
propil alkohol untuk
pencampuran dan Supernatan
alkohol yang mudah
disentrifugasi selama 2 dikumpulkan dan
menguap dan 2,5 mmol
menit pada 10.000 × g dianalisis segera.
/ L 1,2-butanadiol untuk
pada benchtop
glikol) ditambahkan ke
centrifuge (Eppendorf
200 uL kalibrator, QC,
MiniSpin plus).
atau sampel pasien.

 Monitoring QC

Sampel Routine QC terdiri dari Biorad Liquicheck L1 dan L2, ditambah

disiapkan Ethylene glycol / L (EG10) standar 10 mmol. Sampel ini digunakan untuk
menilai variabilitas intra dan inter-hari dan berjalan bersama sampel pasien untuk
memastikan fungsi instrumen yang tepat. EG10 disiapkan oleh spiking dalam standar
EG menjadi 5% albumin dan disimpan pada -20 ° C dalam batch besar sebelum
digunakan.
Konsentrasi masing-masing sampel QC dengan rentang diterima tercantum
dalam Tabel 2.

 Validasi Metode

Metode ini telah divalidasi sesuai dengan pedoman dari Institute Clinical dan
Laboratorium Standar (CLSI) dan International Union of Pure dan Applied Chemistry
(IUPAC).
 Linearitas dan LLOQ

18
 Linearitas dinilai untuk setiap analit pada rendah, menengah, dan rentang tinggi.
Linearitas rendah dinilai oleh spiking sampel pasien kosong dengan VA dan EG dengan
konsentrasi antara 2 dan kalibrator 3. Demikian pula, linearitas mid-range disiapkan
dengan konsentrasi awal antara 5 dan kalibrator 6.
Batas atas dari AMR dinilai dengan spiking sampel pasien dikumpulkan dengan
sekitar 150 mmol / L metanol, etanol, dan isopropanol, 100 mmol / L aseton, dan 75
mmol / L EG. Sampel pasien yang melonjak diencerkan baik menggunakan sampel
konsentrasi yang lebih rendah atau DFS dan dianalisis dalam rangkap tiga. Linearitas
rendah diperpanjang di bawah kalibrator terendah, dan linearitas yang tinggi melebihi
batas atas kisaran kalibrasi.
LLOQ dihitung dari Data kromatografi baku dengan suntikan 5 ekstrak terpisah
dari kalibrator terendah dan DFS. Standar deviasi (SD) dari respon dihitung dari nilai-
nilai ini dan dikalikan dengan 10, dan kemudian dibagi dengan kemiringan garis antara
kalibrator terendah dan kosong seperti yang dijelaskan sebelumnya
 Impresisi dan inakurasi

Dalam menjalankan variasi ditentukan oleh 10 suntikan berturut-turut dari L1,

L2, dan bahan EG10 QC untuk mengevaluasi variabilitas instrumental dan
kromatografi. Antara menjalankan variasi ditentukan dengan analisis dari 20 ekstraksi
terpisah dari bahan QC yang sama pada hari yang berbeda dengan teknologi yang
berbeda selama kurang lebih 2 bulan. Akurasi yang dilakukan dengan menganalisis
lima sampel dari AL2 College of American Patolog (CAP) survei tahun 2013 dan 2014.
Metode korelasi dilakukan dengan perbandingan terhadap protokol analisis saat
ini untuk VA dan EG di CLS, yang mempekerjakan protokol terpisah untuk analisis.
Pengujian VA di CLS menggunakan tembaga sulfat / Sodium Tungstat penggaraman
prosedur untuk ekstraksi, sedangkan metode EG digunakan metode presipitasi protein
serupa dengan menggunakan asetonitril dengan dibubuhi standar internal.
40 sampel pasien dengan konsentrasi analit yang mencakup rentang pengukuran
analitis dianalisis dan dibandingkan dengan memplot setiap titik dan kesamaan dinilai
dengan analisis regresi linear.
 Carryover dan Recovery

Carryover dihitung dengan analisis rangkap tiga dari sampel L1 QC diikuti

dengan suntikan konsentrasi tinggi sampel pasien berduri, dan lain sampel L1 QC. Hasil
dari tiga suntikan pertama rata-rata, dan peningkatan sinyal dalam sampel QC

19
 berikutnya dikuantifikasi. Persen carryover kemudian dihitung dengan membagi selisih
nilai QC dengan konsentrasi sampel disuntikkan. Proses ini dilakukan dengan
menggunakan lima tingkat peningkatan sampel pasien berduri dari percobaan linearitas
yang tinggi.
Recovery dinilai dengan metode penambahan standar yang dijelaskan
sebelumnya. Sampel pasien dibubuhi sejumlah dikenal analit standar sebagai dasar.
Tiga meningkatnya jumlah larutan standar konsentrasi dikenal kemudian dibubuhi
menjadi Aliquot terpisah dari sampel dan dianalisis. Selisih antara konsentrasi
diharapkan dan dihitung dari masing-masing sampel digunakan untuk menilai
pemulihan.
 Spesifisitas metode/interferensi

Pengujian zat yang berpotensi mengganggu dilakukan oleh spiking gliserol, 2,3
butanediol, dietilen glikol, benzena dan toluena dalam sampel pasien kosong dan L1
QC. Selain itu, sampel dari diabetic ketoacidosis (DKA), dan pasien metilmalonat
asidemia (MMA) diuji untuk kemungkinan gangguan. Waktu retensi relatif (RRT) dari
setiap puncak tambahan dari berduri di analit yang ompared dengan yang VA, EG, dan
PG untuk memeriksa gangguan.
Hemolisis, ikterus, dan lipemia juga diuji mungkin gangguan efisiensi ekstraksi.
Sampel pasien dibubuhi konsentrasi analit, dan kemudian spikedwith: rendah atau
tinggi konsentrasi segaris plasma sel darah merah (freeze-dicairkan EDTA) untuk
moderat dan kotor hemolisis, rendah atau konsentrasi tinggi dari bilirubin ditaurate
(Calbiochem, 201102), dan rendah atau tinggi konsentrasi intralipid (Sigma, I141).
Hasil dari sampel pasien dibandingkan dengan dan tanpa interferensi untuk
memeriksa kemungkinan perubahan dalam efisiensi ekstraksi. Kriteria penerimaan
untuk non-interferensi yang kurang dari 10% perbedaan antara suntikan dengan
dan tanpa gangguan.

Hasil
Perbandingan metode 40 sampel pasien dari metode GC dengan metode baru
menunjukkan hasil yang baik. Data korelasi ditampilkan pada Gambar 1 menyarankan nilai
metode baru memiliki bias sedikit dibandingkan dengan metode lama, meskipun hal ini
dikaitkan dengan peningkatan pemisahan kromatografi dan bentuk puncak dengan metode

20
baru. Selain itu, dikaitkan dengan menggunakan kurva kalibrasi metode yang berbeda antara
metode sebelumnya (titik tunggal untuk VA) dan metode baru (enam titik untuk VA dan EG).
LLQ dihitung untuk setiap analit menunjukkan stabilitas baseline pada tingkat rendah.
Sebuah contoh dari kalibrator terendah ditunjukkan pada Gambar 2A, sementara 2B
menampilkan contoh kromatogram dari kalibrator tertinggi. 2C menampilkan kromatogram
dari L1 QC sampel (Biorad), dan 2D menunjukkan contoh sampel L2 QC. Ringkasan data
linearitas termasuk dalam Tabel 3. Selain itu, DFS, air, dan 5% albumin diuji sebagai matriks
pengenceran, namun hanya DFS ditemukan untuk memberikan hasil yang diterima untuk
pengenceran (data tidak ditampilkan).
Recovery diuji pada tiga konsentrasi yang terpisah (2, 10, dan 20 mmol/L) dalam
rangkap dua dari sampel pasien, hasilnya dirangkum pada Tabel 3. Pemulihan dihitung dari
EG di atas 100% disebabkan kurva kalibrasi non-linear karena pemulihan variabel pada tingkat
rendah dan tinggi. Penilaian akumulasi ditemukan sekitar 2,6% untuk EG, meskipun itu
diabaikan untuk VA (Tabel 3). EG carryover disebabkan interaksi non-spesifik dengan bahan
kolom dan ketekunan dalam ruang injeksi karena rendah penguapan. Faktor-faktor ini juga bisa
berkontribusi pada non-linearitas kurva kalibrasi EG dan merupakan pertimbangan penting
ketika mengimplementasikan analisis EG oleh GC. Untuk menghilangkan kemungkinan
gangguan dari akumulasi, semua suntikan menunjukkan konsentrasi EG lebih besar dari 10
mmol/L termasuk setidaknya satu suntikan air berikutnya untuk membersihkan port injection.

21
Pembahasan
Naskah ini menyajikan, cara ekstraksi cepat sederhana untuk analisis VA dan EG dari
serum pasien atau plasma.
a. Pertimbangan untuk pengembangan metode
Adaptasi dari metode ini diperlukan pertimbangan berbagai variabel. Aliran gas (2: 1)
memungkinkan untuk deteksi EG dan VA. Matriks ekstraksi (yaitu asetonitril) dipilih untuk
dua alasan utama: puncak injeksi terelusi sekitar 3,6 menit dengan demikian tidak mengganggu
elusi alkohol volatile atau glikol (Gambar 2 dan 3), dan bekerja segera untuk deproteinasi
sampel. Metode ekstraksi sebelumnya digunakan untuk analisis gabungan EG dan VA dengan
injeksi cair terdiri dari ultrafiltrasi dan pengendapan asam sulfat untuk deproteinasi. Namun,
metode ultrafiltrasi yang rumit karena sentrifugasi berkali-kali dan metode penggaraman
menyebabkan matriks sampel murni dapat menyumbat instrumen, sehingga meningkatkan
biaya pemeliharaan. Asetonitril sebagai matriks ekstraksi menyediakan matriks injeksi volatile
yang tidak mengganggu analisis dan relatif bersih, sehingga waktu cepat dan dapat
diaplikasikan rutin di laboratorium klinis.
Dalam perkembangannya, pemisahan kromatografi dan bentuk puncak yang baik
dipengaruhi oleh tingkat aliran gas serta suhu. Selain itu, bentuk puncak untuk EG memerlukan
waktu tinggal tertunda selama injeksi. Memegang jarum di tempat injeksi sekitar 0,25 menit
sangat meningkatkan bentuk puncak EG, sehingga diperlukan kecepatan dalam injeksi juga
aliran gas yang awalnya lambat (2,0 mL/menit selama 1 menit) untuk memperbaiki bentuk
puncak analit elusi setelah injeksi (yaitu glikol). Hal ini disebabkan sifat "lengket" glikol
membutuhkan waktu ekstra untuk memasuki fase gas dalam tempat injeksi.

22
23
 Rentang linier dari metode ini awalnya dilakukan baik menggunakan 5% albumin atau
DFS sebagai matriks pengenceran. Namun matriks albumin 5% memberikan hasil yang kurang
tepat dengan >2 kali pengenceran. Injeksi standar yang mengandung VA dan EG pada matriks
berair (air) menunjukkan respon sinyal secara keseluruhan lebih rendah daripada ketika dalam
matriks organik (asetonitril). Hal ini disebabkan volume ekspansi yang lebih tinggi dari pelarut
air melebihi dari ruang injeksi yang mengarah ke pengurangan sampel loading ke kolom
analitis. Oleh karena itu, matriks organik (yaitu asetonitril) diperlukan untuk setiap QC atau
kalibrasi injeksi. Jadi, standar air tidak direkomendasikan untuk kalibrasi metode ini.

b. Gangguan dan puncak tambahan

Gangguan potensial diuji selama pengembangan metode yang tercantum dalam Tabel
4. Gangguan uji tersebut adalah toluen dan 1,3 propandiol, yang masing-masing co-elusi
dengan EG dan 1,2 butanadiol (standar internal glikol). Toluen adalah aditif umum dalam
deterjen, pewarna, cat, tekstil dan plastik serta toksisitas berat disarankan terjadi di sekitar 2-5
mmol/L, meskipun dengan cepat dimetabolisme untuk asam hippuric dan orto-kresol untuk
ekskresi dalam urin. Xilena dan benzena tidak menunjukkan ketinggian puncak yang cukup
pada konsentrasi toksik, sehingga cocok dengan metode ini dan tidak mengganggu pengujian.
Dietilen glikol mudah terdeteksi, seperti 2,3 butanadiol, dan secara kromatografi terpisah
sehingga tidak mengganggu. Pengujian 1,3 propandiol menunjukkan retensi sangat mirip
(tR=1,01) dengan 1,2 propandiol sehingga dipilih puncak ini sebagai standar internal di tempat
1,2 propandiol.
Pengujian sampel pasien diabetes ketoasidosis (DKA) menunjukkan puncak aseton
positif, yang dapat membantu membedakan antara toksisitas isopropanol dan DKA. Juga diuji
sampel yang mengandung asam propionat, metabolit diketahui meningkat pada metilmalonat.
Asam propionat telah terbukti mengganggu metode lain dari analisis EG oleh GC, namun tidak
ikut campur dalam metode ini.

24
 Propylene glycol (PG) juga termasuk dalam campuran kalibrasi dengan metode ini,
karena merupakan aditif umum dalam produk makanan dan obat-obatan. PG memiliki LLQ
0,27 mmol/L, yang baik dalam pemisahan dari analit lain dan berperilaku mirip dengan EG
dalam recovery dan kalibrasi.

c. Aplikasi rutin metode

Hasil yang kurang dari 1 mmol/L untuk VA atau EG dilaporkan "Tidak Terdeteksi"
untuk menghilangkan potensi positif palsu dan membatasi tindakan klinis yang tidak pantas.
Hasil kuantitatif 1,0-1,9 mmol/L dilaporkan non-kuantitatif sebagai "b2 mmol/L", sementara
semua hasil 2 mmol/L atau lebih besar dilaporkan secara numerik. Rentang kritis saat ini pada
CLS adalah: 2 mmol/L untuk metanol dan EG, 6 mmol/L untuk aseton, dan 8 mmol/L untuk
isopropanol. Jika sampel pasien melebihi dari AMR, hasilnya dilaporkan keluar STAT sebagai
laporan awal menunjukkan tes lebih besar dari kisaran linear, dan kemudian sampel secara
manual diencerkan dan analisis ulang untuk pelaporan nilai akhir. PG hanya dilaporkan dalam
jumlah 4.0 mmol / L, di mana ia dapat berkontribusi untuk peningkatan kesenjangan osmolal.
Penelitian ini digunakan plasma heparin untuk evaluasi metode, dan serum mudah
diterapkan sebagai matriks sampel. Urine dapat sebagai matriks sampel, tapi proses ekstraksi
menghasilkan berbagai puncak tambahan. Matriks lainnya seperti darah atau post-mortem
sampel akan memerlukan validasi lebih lanjut.

Kesimpulan
Metode ini menyajikan prosedur sederhana, bersih, re-produksi, dan sensitif untuk
analisis VA dan EG tanpa perlu detektor spektrometri massa yang mahal dan rumit. Hal ini
juga dapat secara rutin digunakan di laboratorium Kimia rumah sakit dengan <30 teknologi.
Merupakan metode yang cepat dengan teknik persiapan sampel yang sederhana.

25
 BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan
Prinsip kromatografi gas adalah pemisahan didasarkan pada titik didih suatu
senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan fase
diam. Metode GC digunakan untuk menguji kemurnian dari bahan tertentu, atau
memisahkan berbagai komponen dari campuran, juga dapat membantu dalam
mengidentifikasi sebuah kompleks.. Metode ini dinilai sederhana, spesifik, sensitif,
presisi, dan akurat untuk tujuan QC suatu produk farmasi secara berkelanjutan. Untuk
mendapatkan kondisi analisa yang optimun perlu dilakukan optimasi terlebih dahulu
terhadap prosedur dan reagen yang digunakan. Beberapa cara derivatisasi pada
kromatografi gas adalah esterifikasi, asilasi, alkilasi, siliasi, kondensasi, dan siklisasi.

26
 DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, I.G, Rahman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar. Hal.
419 -449
Menestrina,F. Grisales,J.O., Castells, C.B. (2016). Chiral Analysis of Derivatized Amino Acids
From Kefir By Gas Chromatography. Microchemical Journal 128: 267-273.
Orton, D.J., Boyd, J.M., Affleck, D. (2016). One-step Extraction and Quantitation of Toxic
Alcohols and Ethylene Glycol in Plasma By Gas Chromatography (GC) with Flame
Ionization Detection (FID). Clinical Biochemistry 49: 132-138.
http://chemwiki.ucdavis.edu/Core/Analytical_Chemistry/Instrumental_Analysis/Chromatogra
phy/Gas_Chromatography
http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm.htm

27