Yang kuning juga dibaca tapi gaada di ppt ya ges!

Konsep Dasar HPLC

Menurut (Mubarok, 2021) HPLC merupakan jenis dari kromatografi kolom dan bekerja
dengan prinsip yang sama. Prinsip utama dari kromatografi kolom adalah adanya adsorbsi
(penempelan permukaan) dari solut (cairan sampel) ke dalam larutan melalui fase diam yang
menyebabkan adanya pemisahan solut dengan larutan. Tingkat adsorbsi tergantung pada
afinitas dari fase diam dan fase gerak. Fase diam terdiri dari adsorben seperti silika.
HPLC berfungsi sama dengan prinsip kromatografi diatas. Campuran sampel atau
analit yang terlarut dalam cairan larutan dipompa. Ini akan menjadi fase geraknya, jadi analit
masuk ke dalam fase gerak. Larutan fase gerak ini karena dipompa maka bergerak melewati
fase diam dengan tekanan yang tinggi. Fase diam terdiri dari kolom atau disebut juga kolom
HPLC. Ketika sampel dilewatkan pada kolom maka akan berinteraksi dengan dua fase tersebut
(fase diam dan fase gerak).
Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit berdasarkan kepolarannya,
setiap campuran yang keluar akan terdeteksi dengan detektor dan direkam dalam bentuk
kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak
menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.

Figure 1. Contoh Kromatogram HPLC

Interkasi analait pada fase diam dan fase gerak menyebabkan pemisahan. Pemisahan
ini didorong oleh kekuatan interaksi dan kepolaran. Bila analit lebih polar dia akan menempel
ke fase yang lebih polar, bila fase diam lebih polar maka analit akan banyak menempel di dase
diam. Akhirnya akan menciptakan pemisahan-pemisahan fase. Deteksi menggunakan detektor
(UV-VIS) akan mengenali pemisahan analit ini setelah melewati kolom HPLC. SIgnal akan
dikonversi dan direkam oleh komputer dan ditunjukkan menjadi kromatogram.
Fase gerak biasanya adalah campran air, asetonitril dan metanol. Berbagai komponen
campuran berinteraksi pada berbagai tingkatan karena interaksi fase diam dan gerak.
Sumber: Mubarok, Fithrul. 2021. HPLC Prinsip dan Cara Kerja.
https://www.researchgate.net/publication/352836880_HPLC_Prinsip_dan_Cara_Kerja

Instrumentasi HPLC

Perangkat dasar instrumen HPLC terdiri dari beberapa rangkaian alat antara lain, micro
prossesor, pompa yang bertekanan tinggi untuk memompakan pelarut, injektor, kolom
analitik, detektor, recorder atau data prosesor yang masingmasing mempunyai fungsi
berbeda. Namun bila semuanya berjalan lancar akan memberikan data yang sangat berarti
dan akurat dalam analisa Vxia\itatif maupun taiantitatif ataupun iso\asi senyawa bioaktif.
Dengan kemurnian yang tinggi fungsi masing-masing bagian HPLC adalah sebagai berikut
(Willard, 1988)

Sumber :
Willard HH, Merritt LL (Jr), Dean JA, Settle FA (Jr). 1988. Instrumental Methods of
Analysis 7th Ed. Wadworth. Inc. Bellmont, California USA, 580-613

Sumber : https://wiralabanalitika.com/2021/05/03/high-performance-liquid-chromatography-
hplc/

Aplikasi HPLC

Seperti yang sudah disebutkan pada artikel sebelumnya, HPLC kerap digunakan dalam
industri farmasi atau laboratorium farmasi sebagai metode analisis sampel. Namun HPLC juga
memiliki kegunaan dalam bidang lain seperti pada industri makanan dan minuman, analisis
lingkungan, forensik, serta pada tes klinis.

Dalam bidang farmasi, HPLC dapat digunakan untuk menguji stabilitas obat, uji
disolusi, serta quality control. Sedangkan pada industri makanan dan minuman, HPLC dapat
digunakan pada beragam analisis seperti untuk analisis keberadaan senyawa polisiklik, analisis
kadar gula dan pengawet, atau pengukuran kualitas minuman ringan dan air.

Pada bidang lain, HPLC dapat pula digunakan untuk analisis antibiotik dalam darah,
analisis kokain pada urin, dan sebagainya.

Alat UHPLC Ultimate 3000 dari Thermo Scientific

Analisa Kulitatif dan Kuantitatif pada HPLC

Analisa Kualitatif
• Untuk menentukan jenis komponen dalam suatu sampel
• Perbandingan waktu retensi antara larutan standar dan sampel denga metode Analisa
yang sama (Parameter HPLC yang sama)
• Pada instrument HPLC itu bedasarkan perbandingan waktu retensi antara baku standar
dengan sampel dengan catatan metode yang digunakan harus sama persis, apa saja itu?
Itu adalah parameter yang diatur, semua parameternya harus sama mulai dari laju alir
fase gerak kemudian Panjang gelombang yag digunakan, waktu Analisa, suhu, jenis
detector yang digunakan harus sama persis, ketika semua parameter sama kemudian
ada larutan standar kita injeksikan kita dapatkan waktu retensi nya
Seperti ini (gambar yang dibawah)
Kita gatau ini apa saja didalam ini, ini sampel ya (nunjuk aliran birunya)
Terus lanjut gambar yang ini
Nah, kita injeksi larutan standar tadi ternyata ada waktu retensi kurang lebih sekian menit,
katakan lah 5 menit (tunjuk yang ada merah merahnya)
Nah dari sampel yang banyak tadi peaknya (tunjuk sampel yang atas nya), jadi sampel tu
kita tidak bisa mengontrol apakah dia harus mengandung ini saja, karena bisa jadi sampel
itu bisa mengandung banyak peak didalamnya terutama sampel-sampel organic, karena zat
organic banyak sekali senyawa yang ada di dalam sampelnya.
Nah, karena banyak sekali senyawa didalamnya (nunjuk yang atas lagi) maka kita harus
membandingkan mana yang sama waktu retensi nya, berapa lama dia tinggal didalam
kolom, harus sama. Karena kalo dia sama berarti zat nya sama juga, apalagi dia memberi
respon yang sama persis, pada Panjang gelombang tersebut peaknya sama persis waktunya
(nunjuk yang ada tanda panah ijo-ijonya), berarti itu bisa dikatakan senyawa yang sama,
itu kalau kita menggunakan larutan standar.
Tapi di beberapa ditektor ms misalkan mass spectrometer itu ada library, nah kita
bandingkan dengan database yang ada di library, kemudian kita lihat pada metode tersebut
yang memiliki respon yang sama persis pada database maka dianggap sama, jenis
senyawanya, pada prinsipnya Analisa kualitatif instrument itu kita deteksi bedasarkan
waktu retensi yang sama dengan metode yang sama, karena ketika kita merubah metode
katakanlah larutan standar kita injeksi dengan laju alir eluen 1 ml/menit, sampel kita injeksi
dengan laju eluen 2 ml/menit, nah ini kita gabisa bandingkan meskipun ada senyawa yang
memiliki waktu retensi yang sama dengan standar, tapi karena laju alir eluen nya berbeda
maka kita kita tidak bisa bandingkan, kita tidak bisa gunakan sebagai patokan bahwa “ohh
ini zat yang sama dengan standar”
Karena jelas ketika laju alir nya lebih tinggi otomatis waktu retensi dari senyawa yang sama
akan berubah, standar pun ketika kita Analisa larutan standar kita Analisa dengan laju alir
1ml/menit dengan laju alir 2ml/menit larutn standar pasti akan memberikan waktu retensi
yang berbeda, apalagi sampel yang didalamnnya banyak sekali senyawa.
Analisa kuantitatif
• Menentukan kadar suatu target dalam sampel
• Perbandingan luas area atau tinggi puncak dari kromatogram sample terhadap standar
• Tinggi puncak sebenernya respon dari detector, ketika sampel melewati detector
kemudian memberikan nilai absorbansi. Respon detector selain waktu juga luas area.
• Dan masing masing senyawa akan memiliki luas area yang berbeda, katakanlah
senyawa A (kafein misalkan) 1 ppm luas area nya 1000, belum tentu vitamin C 1 ppm
ketika dianalisa luas area nya 1000, bisa jadi nilainya berbeda. Sama, kalua kita Analisa
logam Cu 1 ppm absorban nya 0,2 misalkan, logam Fe 1 ppm ternyata absorbannya
Cuma 0,1, nah seperti itu juga di instrumen HPLC, kafein 1 ppm luas areanya 1000,
vitamin c ternyata hanya 500, jadi kita tidak bisa pastikan bahwa ketika 1 ppm luas
areanya harus 1000 harus 100, jadi tergantung jenis senyawa yang dianalisa seberapa
banyak dia akan memberikan respon terhadap detector.
• Nah hubungannya annti dengan working range, Semakin tinggi konsentrasi, semakin
tinggi puncak dari peak, nah jangan sampai konsentrasi sampel melewati batas limit
deteksi dari detector, jangan sampai terlalu tinggi sehingga puncaknya tidak terlihat.

Nah ini (tunjuk yang biru yang ada kursornya) kita bandingkan misalnya injeksi pada
kurang lebih waktunya 27 menit itu muncul luas areanya sekian, nah kita lihat tadi
secara kualitatif kita tahu bahwa yang memiliki waktu retensi yang sama, ternyata disini
target (yang biru biru garis pink) itu lebih kecil peaknya berarti kosentrasi nya lebih
rendah