Kromatografi Preparatif

By: Kelompok 3 Farmasi C

 Nama Kelompok

Dwi Putri Utami (201410410311131) Hanan Rumaisah (201410410311146)

Aulia Tamara (201410410311134) Kukuh Adhe K. (201410410311148)

Alfira Aryanti (201410410311136) Syafitri Anggiyani A. (201410410311150)

Muhammad Husni A. (201410410311138) Vivi Laily Kurniati (201410410311152)

Dian Harianti Lestari (201410410311140) Noviani (201410410311154)

Vini Nurbaiti (201410410311144) Anita Karlina (201410410311159)

Ari Nugroho Saputro (201410410311240)

Pengertian Kromatografi Preparatif

Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP)

merupakan metode pemisahan yang memerlukan biaya
paling murah dan memakai peralatan sangat sederhana
. Walaupun KLTP dapat memisahkan dalam jumlah
gram,sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah
miligram. KLT preparatif dilakukan dengan
menggunakan lapisan tebal (sampai 1 mm) sebagai
pengganti lapisan penyerap yang tipis (Nasution, 2010).
Fase Diam

Fase diam pada KLT Preparatif adalah sebuah plat dengan ukuran
ketebalan bervariasi. Pada fase diam adsorben yang paling banyak digunakan
yaitu silika gel yang dipakai untuk pemisahan campuran lipofil maupun
senyawa hidrofil. ketebalan adsorben yang paling sering digunakan ialah 0,5
2 mm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran plat sudah tentu mengurangi
jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTP
Fase Gerak

Fase gerak atau Eluen yang digunakan umumnya bersifat non polar,
dimana eluen dicampur untuk memperoleh kepolaran yang diinginkan.
Campuran yang baik akan menghasilkan eluen yang memiliki kekuatan
bergerak sedang, namun sebaiknya tidak mencampur lebih dari 2 eluen.
Pencampuran eluen dengan perbedaan kepolaran yang sangat berbeda dapat
menyebabkan terpisahnya eluen. Hal tersebut dapat ditunjukkan dengan
terbentuknya bercak berbentuk bulan setengah yang aneh, atau diperoleh 2
garis depan eluen pada lapisan.
Konsentrasi Sampel

Konsentrasi sampel juga sebaiknya hanya 5-10%. Sampel yang ditotolkan

harus berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan
juga bergantung pada lebarnya pita (Kristanti, 2008).
 CONTOH CARA
PENGERJAAN KLT
PREPARATIF
Kelebihan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Biaya lebih efektif dibandingakan dengan metode yang membutuhkan instrumen tertentu,
seperti HPLC atau CCC.

Tekhnik sederhana yang memerlukan sedikit pelajaran atau pengetahuan tentang

kromatografi yang digunakan

Metode analisis dapat ditingkatakan dengan mudah untuk metode preparatif

Mampu untuk mengisolasi natural product dengan cepat dalam rentang miligram-gram

Fleksibelitas dari pelarut dan fase diam yang dipilih, yaitu sistem pelarut bisa diubah
dengan cepat selama proses

Sejumlah besar sampel dapat analisis atau dipisah secara bersamaan

Hampir semua pemisahan dapat dilakukan dengan pemilihan fase diam dan fase gerak
yang sesuai
Kekurangan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Kontrol deteksi kurang dibandingkan dengan HPLC

Kontrol eluasi kurang dibandingkan dengan HPLC

Kapasitas dan kecepatan kurang jika dibandingkan dengan VLC

Terbatas untuk pelarut sederhana

Contoh Penelitian yang menggunakan KLTP

JURNAL 1 JURNAL III

JURNAL II JURNAL IV
Preparative High-Performance Liquid Chromatography
for the Purification of Natural Acylated Anthocyanins
from Red Radish (Raphanus sativus L.)
Jurnal 1
HPLC preparatif dilakukan dengan
Glison Model 576 pompa dan kolom
Cosmosil C18-AR-II, 20 mm x 250
mm, 5mcm) menggunakan MeOH-H20
dengan perbadingan 40:60
mengandung 0,1% TFA sebagai fase
gerak. Laju alir 7mL/menit, dengan
UV-Vis detektor lamba 520 nm.
Kromatogram dihasilkan dari 10 frasi
pada gambar di samping. Fraksi
diketahui terkonsentrasi oleh
evaporotary dan masing-masing fraksi
dianalisis dengan HPLC analisis untuk
memeriksa kemurnian sebelum
karakterisasi.
Karya ini diarahkan isolasi preparatif dari anthocyanin dan karakterisasi
mereka dengan spektroskopi teknik seperti NMR dan MS. Berikut cara
mengidentifikasi anthocyanin
Setelah koleksi masing-masing fraksi,pelarut diuapkan di bawah vakum
dan kemurnian diperiksa oleh HPLC analitis. Kemudian, fraksi
dimurnikan oleh HPLC semipreparative. Kemudian dianalisis dengan 1H
dan 13C NMR spektrometri untuk menghasilkan senyawa yang dikenal 1-
10.Spektral data yang digunakan untuk karakterisasi anthocyanin yang
dikumpulkan oleh semi-preparatif HPLC. FAB-MS data fraksi
menyediakan bukti massa molekul. 1H dan 13C NMR Data anthocyanin
ini kemudian dibandingkan dengan nilai yang dilaporkan dalam literatur
anthocyanin.Kemudian sepuluh senyawa yang diketahui diidentifikasi lagi
oleh analisis spektral dan dibandingkan dengan data yang dilaporkan (2,3)
Isolasi dan Karakterisasi Alkaloid dari Daun Sirih
Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav)
Jurnal 2
Pemilihan Fase diam dan Fase Gerak

Fase diam yang digunakan yaitu silika gel GF254 sedangkan

fase gerak yang digunakan yaitu etil asetat 100%. Fraksi yang
terpilih untuk di pantau adalah fraksi alkaloid netral atau basa
lemah karena ketika di semprot dengan penampak noda
dragendorff menimbulkan warna orange atau jingga yang
sama dengan pembanding piperin. Kemudian di lakukan
kromatografi cair vakum(KCV) untuk pemisahan lebih lanjut
sehingga di hasilkan fraksi yang lebih sederhana. Fraksi yang
terpilih pada metode ini adalah fraksi yang menunjukkan
warna orange atau jingga lebih banyak di banding fraksi yang
lain
Dari hasil penampak bercak pada pat KLT preparative, hanya pita 2 yang memberikan hasil
positif alkaloid, sehingga pita 2 dikerok dan dilarutkan dalam methanol. Kemudian
dibiarkan seama 24 jam, setelah itu disaring dan diuapkan. Selanjutnya dilakukan uji
kemurnian terhadap isolate yang diperoleh dengan metode KLT pengembang tunggal dan
KLT dua dimensi. Hasil dari uji kemunian menggunakan KLT dua dimensi dapat diketahui
bahwa isolat hasil dari pemisahan KLT preparatif ini cukup murni, hal ini dilihat dari hasil
bercak yang dihasilkan dari penggunaan KLT dua dimensi yang menghasilkan hanya satu
bercak. Isolat murni tersebut kemudian dilakukan karaktrisasi isolat dengan menggunakan
spektrofotometer UV-sinar tampak dan spektrofotometer inframerah.
Preparative Isolation of monogalactosyl and
digalactosyl diglycerides by thin-layer chromatography

Jurnal 3
 Prosedur TLC

Ekstrak dipisahkan menjadi fraksi minyak mentah secara bertahap

Aseton sebagai fase gerak untuk pemurnian monogalactosyl

digliserida (GDG) dan aseton-acetic acid-air untuk digliserida
digalactosyl (DGDG)

Dilakukan penyemprotan plat dengan air maka lipid akan terdeteksi

Metode Analisis

Identifikasi galactolipid telah ditetapkan dengan deacylation dan hidrolisis

asam yang mana diikuti dengan identifikasi glukosa dengan kromatografi
kertas.

Komponen galaktosa dalam lipid telah dianalisis secara kuantitatif dengan

metode radin, lavin dan brown dengan bantuan kurva standart galaktosa.

Komposisi asam lemak dari galaktolipid itu determinan dengan kromatografi

gas-liquid dari metil ester. Tingkatan ester yang jenuh telah ditentukan
menggunakan hidrogenasi dengan H2 dan Pt.
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA PENANDA DARI
DAUN JAKANG (Muehlenbeckia platyclada MEISSN)

Jurnal 4
Prosedur kerja

1) Menghilangkan kotoran yang menempel pada daun Jakang

kemudian dicuci sampai bersih.

2) Selanjutnya daun Jakang dijemur di bawah sinar matahari dengan

ditutup kain hitam.

3) Setelah kering diserbuk sampai halus. Lebih kurang 50 g serbuk

daun jakang dibebaskan dari senyawa yang kepolarannya rendah
seperti lemak dan klorofil dengan cara soxhletasi.

4) Dibutuhkan sebanyak 200 mL petroleum eter sampai warna

pelarutnya jernih. Sari petroleum eter yang diperoleh dipekatkan
dengan pemanasan di atas penangas air.
lanjutan

5) Serbuk yang sudah diawalemakkan dengan petroleum eter,

dikeringkan di udara bebas dalam cawan porselin besar.

6) Setelah kering disoxhletasi dengan kloroform 200 mL sampai

pelarutnya jernih. Sari kloroform yang didapat dipekatkan dengan
pemanasan di atas penangas air.

7) Selanjutnya, serbuk dikeringkan kembali di udara bebas dalam

cawan porselin besar dan setelah kering disoxhletasi dengan etanol
96% 200 mL sampai pelarutnya jernih. Sari etanol yang diperoleh
dipekatkan dengan pemanasan di atas penangas air.
lanjutan

8) Kemudian pada akhir fraksinasi diperoleh sari petroleum eter,

kloroform, dan etanol. Sari petroleum eter, kloroform, dan etanol yang
telah diuapkan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai.

9) Terakhir dilakukan uji kromatografi lapis tipis menggunakan fase diam

silika gel 60 F 254 dan fase gerak n-heksana - etilasetat (3:1)

Dragendorf untuk mendeteksi senyawa golongan alkaloid,

sitroborat untuk mendeteksi senyawa golongan flavonoid

 HASIL

Setelah pemisahan secara KLT preparatif selesai, dilakukan pengerokan

pada pita senyawa penanda yang akan diisolasi.

Bercak yang dikerok adalah bercak yang mempunyai harga hRf 47. Setelah
bercak dikerok, kemudian hasil kerokan tersebut dilarutkan dalam metanol
dan segera disaring menggunakan kertas saring. Penyaringan ini
dimaksudkan untuk memisahkan senyawa yang terikat pada penyerap.

Filtrat yang diperoleh kemudian dikeringkan, sehingga diperoleh isolat yang

berwarna kuning yang diduga sebagai senyawa golongan flavonoid dengan
bobot sebesar 0,03 gram dan merupakan senyawa penanda pada daun
jakang
lanjutan

Selanjutnya dilakukan uji kemurnian terhadap isolat dan diidentifikasi lebih

lanjut menggunakan metode pereaksi geser dengan spektrofotometri UV-Vis.

Spektra UV dari isolat dalam metanol menunjukkan serapan maksimum pada

panjang gelombang 327,2 nm dari pita I dan 279,5 nm dari pita II.

Dari informasi tersebut dapat ditafsirkan bahwa flavonoid tersebut termasuk

golongan flavon karena masuk dalam daerah panjang gelombang 310-350
nm yang merupakan daerah pita I serta 250-280 nm yang merupakan daerah
pita II.
TERIMAKASIH