KLT (KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS)

1. Definisi
Kromatografi lapis tipis (klt) adalah metode analisis yang digunakan untuk memisahkan
suatu campuran senyawa secara cepat dan sederhana. KLT merupakan salah satu metode
isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap (adsorpsi) dan daya partisi serta
kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen.
Oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen
bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan
(Hostettmann et al, 1995).
2. Prinsip kerja
Terjadinya hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada
interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan
diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Semakin dekat kepolaran antara
senyawa dengan eluent maka senyawa akan semakin terbawa fase gerak, sesuai dengan
prinsip ‘like dissolve like’
3. Pelarut
Fase diam
a. Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam
perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40µm. Makin kecil diameter
akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi
kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2 /g.
Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%.
b. Alumina Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk kelompok fase diam
yang beraktifitas tinggi. Alumina yang digunakan TLC bersifat sedikit basa (pH 9),
ada juga yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang bersifat asam (pH 4). Juga
digunakan CaSO4 sebagai pengikat yang dapat menurunkan bebasaan pada tinggkat
tertentu. Sepertihalnya Silica gel, alumina dikenal dengan atau tanpa pengikat dan
bahan indicator. Pemberian namapun identik dengan silika gel dengan code G.H.P.F.
c. Selulosa Menggunakan selulosa sebagai fase diam maka mekanisme pemisahannya
sama seperti mekanisme pemisahan pada kromatografi kertas. Perbedaannya hanya
serat selulosenya pada TLC/KLT lebih pendek dari pada serat selulosa kromatografi
kertas. Panjang serat bervariasi 2-20 µ. Serat lebih pendek menyebabkan difusi
rendah selama elusi dan menghasilkan bercak yang sempit (lebih kecil). Selulosa
untuk TLC terdapat dim bentuk selulosa serat asli (contohnya MN 300) dan selulosa
 mikrokristal (contohnya Avicel). Fase diam selulosa biasanya digunakan senyawa
yang bersifat polar.
Fase gerak
Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fase gerak (deret eluotropik)
non polar Parafin cair
Petroleum eter
Sikloheksana
Karbon tetraklorida
Benzena
Toluena
Kloroform
Dietileter
Etilasetat
Aseton
n-propanol
etanol
asetonitril
methanol
polar air

4. Kelebihan dan kekurangan

Beberapa kelebihan KLT yaitu:
1.      KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.
2.      Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi
warna,fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
3.      Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau
dengan cara elusi 2 dimensi.
4.      Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak.
5.      Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
6.      Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
7.       Jumlah perlengkapan sedikit.
8.      Preparasi sample yang mudah
9.      Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan
metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).

Adapun kekurangan KLT  yaitu:

1.      Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang
diharapkan.
2.      Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
3.      Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun
5. Contoh aplikasi
Contoh penggunaan metode pemisahan secara KLT dapat diterapkan dalam
menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti
poldanmig yang beredar di pasaran apakah memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak.
Sehingga dengan kadar yang tepat obat dapat memberikan efek terapi yang dikekndaki
SKRINING FITOKIMIA DAN ANALISIS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
EKSTRAK TANAMAN PATIKAN KEBO (Euphorbia hirta L.)
1. Ekstraksi
a. Serbuk simplisia herba Patikan Kebo sebanyak 457,5 gram, dimaserasi dengan
1700 ml pelarut etanol 75% dan diremaserasi sebanyak tiga kali dengan pelarut yang
sama pada suhu ruangan selama 24 jam.
b. Filtrat disaring menggunakan corong Buchner untuk memisahkan filtrat dengan
maserat.
c. Filtrat yang diporoleh dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada suhu 40oC
sampai diperoleh ekstrak kental.
2. skrining fitokimia > uji flavonoid
Sebanyak 1 ml larutan uji masing-masing dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi.
Tabung 1 sebagai kontrol, tabung 2 ditambah dengan 1 mL larutan Pb Asetat (timbal
asetat) 10%, positif flavonoid jika terdapat endapan kuning (Raphael, 2012). Tabung 3
ditambah dengan beberapa tetes NaOH 20% terbentuk warna kuning jika mengandung
flavonoid (Ugochukwu dkk., 2013).
3. Kromatografi Lapis Tipis
Penyiapan fase diam Silica gel G60 F254/plat KLT dengan panjang 8 cm dan lebar
2 cm, kemudian dicuci dengan metanol, lalu diaktivasi dengan oven pada suhu 100oC
selama 10 menit Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dalam 1 ml etanol kemudian
 ditotolkan pada fase diam. a. Identifikasi Senyawa Flavonoid Fase gerak asam asetat
glacial : butanol : air (1:4:5), dengan penampak noda uap ammonia. Reaksi positif
ditunjukkan dengan terbentuknya noda berwarna kuning cokelat setelah diuapi ammonia
pada pengamatan dengan sinar tampak dan berwarna biru pada UV 366 nm menegaskan
adanya kandungan flavonoid (Marliana, 2005).
4. hasil
skrining fitokimia dan Hasil analisis Kromatografi Lapis Tipis
Flavonoid(+) adanya endapan kuning

KROMATOGRAFI KOLOM
1. Definisi
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat unt
uk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas
yang dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair,
ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum
perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1 sedangkan daya penyerapnya
adalah 25-30 kali berat bahan yang akan dipisahkan. Teknik banyak digunakan dalam
pemisahan senyawa-senyawa organik dan konstituen-konstituen yang sukar menuap
sedangkan untuk pemisahan jenis logam-logam atau senyawa anorganik jarang dipakai
(Yazid,2005, hal 98)
2. Prinsip kerja
Didasarkan pada absorbsi komponen 2 campuran dengan afinitas berbeda terhadap
permukaan fase diam.
3. Pelarut
1. Fase diam
Absorben padat yaitu Silika gel atau alumina
2. Fase gerak
Eluen yaitu campuran cairan murni

4. Kelebihan dan kekurangan

Kelebihan :
a. Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative
 b. Dapat digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran
c. Dapat digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
Kekurangan :
a. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual
b. Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama
5. Contoh aplikasi
Prosedur penelitian diawali dengan preparasi sampel. Sebanyak 4.000 g serbuk
biji alpukat dimaserasi dengan menggunakan n-heksana selama 3x24 jam, dimana
setiap 24 jam ekstrak disaring. Residu yang diperoleh dikeringkan untuk
kemudian dimaserasi kembali menggunakan etanol 95 % selama 3x24 jam. Filtrat
etanol dievaporasi dan diperoleh ekstrak kental etanol. Ekstrak kental etanol
dipartisi dengan etil asetat dan air (1:1) menggunakan corong pisah sehingga
terbentuk 2 fase. Fase etil asetat diambil untuk kemudian dipekatkan dengan
rotary vacum evaporator hingga diperoleh ekstrak kental etil asetat (Mursiti,
2015). Pemisahan ekstrak kental etil asetat dilakukan dengan kromatografi kolom.
Kromatografi lapis tipis dilakukan untuk mencari eluen yang sesuai, fase diam
yang digunakan plat silika G-F254 dan dielusi dengan n-butanol : asam asetat : air
(4:1:5, lapisan atas), n-heksana : etil asetat (7:3), n-heksana : etil asetat (8:2), n-
heksana : etil asetat (9:1), dan metanol : etil asetat (4:1). Setelah larutan
pengembang sampai garis batas, elusi dihentikan, selanjutnya memerhatikan
bentuk noda pada berbagai larutan pengembang ditentukan perbandingan larutan
pengembang yang paling baik (Zirconia et al., 2015). C selama 3Persiapan
pertama kromatografi kolom adalah memanaskan silica gel pada suhu 160 jam
kemudian didinginkan. Setelah itu silica gel dibuat bubur dan dimasukkan dalam
kolom, lalu dibiarkan semalam. Ekstrak kental etil asetat digerus bersama silica
gel dan dimasukkan dalam kolom, kemudian ditambah dengan eluen pelan pelan
sambil kran dibuka. Fraksi ditampung dalam botol vial 3 ml sampai eluen habis
(Syahril et al., 2015). Fraksi dianalisis dengan KLT dengan eluen yang sesuai.
Botol yang berisi fraksi tunggal dengan Rf sama dikelompokkan menjadi satu
wadah. Ekstrak kental etanol, ekstrak kental etil asetat, dan isolat murni hasil
kromatografi kolom selanjutnya dilakukan uji flavonoid. Isolat yang telah diuji
kemurnian dengan kromatografi kolom selanjutnya diidentifikasi strukturnya
menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FT-IR. Identifikasi isolat flavonoid
 dilakukan dengan penambahan pereaksi geser. Isolat murni hasil kolom 200-600
nm, selanjutnya isolatdalam metanol dituang dalam kuvet (2-3 mL) direkam
spektranya pada dalam metanol tadi ditambah 3 tetes larutan NaOH, dicampur
dan direkam spektranya. Pada penambahan pereaksi geser berikutnya larutan
isolat dalam metanol ditambah 3 tetes AlCl3, dicampur dan direkam spektranya,
kemudian larutan isolat yang sudah ditambah AlCl3 tadi ditambah 3 tetes HCl dan
direkam spektranya.
Identifikasi senyawa flavonoid pada biji alpukat (Persea americana Mill.), baik
ekstrak kental etanol, ekstrak kental etil asetat, dan isolat murni hasil kolom
menunjukkan positif mengandung flavonoid, ditandai dengan perubahan warna
menjadi merah kecoklatan (Zirconia et al., 2015).
DENSITOMETRI
1. Definisi
Densitometri adalah metode analisi instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi
elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak atau noda pada lempeng KLT.
2. Prinsip kerja
Prinsip kerja alat ini adalah dengan proses pemantulan dari fotometrI resapan
(reflection–absorbtion photometry), pemantulan dari fluorometri (reflection fluorometri)
dan tranmisi dari fotometri resapan (transmitan– absorbsion photometry). Panjang
gelombang yang biasa digunakan 200-700 nm
3. Pelarut
A. Fase diam
Absorben padat yaitu Silika gel atau alumina
B. Fase gerak
Eluen yaitu campuran cairan murni
4. Kelebihan dan kekurangan
Kelebihan
Memiliki spesifitas yang tinggi, dapat dipercaya, pengerjaannya relatif mudah dan cepat,
biaya relatif murah, polaritas pelarut dan pelarut campuran dapat diubah dalam waktu
yang singkat (Wulandari,2013)
Kekurangan
Peralatan yang cukup kompleks dan harga yang terlalu mahal
5. Contoh aplikasi
Penetapan Kadar Coumarin
Sampel (Ekstrak Etanol Herba Alfalfa) uji ditimbang dengan seksama, ditambahkan
etanol 2 ml digojog dengan vortex, kemudian disentrifus. Fase etanol diambil, diulangi
perlakuan ekstraksi pada residu sebanyak 2 kali. Kemudian fase etanol dievaporasikan
diaddkan menjadi 200 μl dengan etanol. Hasilnya ditotolkan pada plate silikagel 60 F254,
disertakan standar coumarin, dimasukkan ke dalam chamber yang telah berisi jenuh fase
gerak, dieluasikan hingga batas, diangkat dan dikeringkan. Densito dilakukan pada panjang
gelombang 304 nm. Hasil 229,83 ppm

VAKUM EVAPORATOR
1. Definisi
Rotary Vacuum Evaporator merupakan alat yang menggunakan prinsip vakum
distilasi.. Rotary Evaporator mampu menguapkan pelarut dibawah titik didih sehingga
zat yang terkandung di dalam pelarut tidak rusak oleh suhu yang tinggi. Banyak cairan
organik yang tidak dapat didistilasi pada tekanan atmosfer karena temperatur yang d
iperlukan untuk berlangsungnya distilasi dapat menyebabkan senyawa terdekomposisi
(biasanya terjadi pada senyawa bertitik didih lebih dari 200oC)
2. Prinsip kerja
-Prinsip utama alat ini terletak pada penurunan tekanan sehingga pelarut dapat
menguap pada suhu di bawah titik didihnya dan terpisah dari sumbernya dengan
pemanasan secara vakum.
-Rotary vakum evaporator adalah instrumen yang menggunakan prinsip destilasi
(pemisahan). Prinsip utama dalam instrumen ini terletak pada penurunan tekanan pada
labu alas bulat dan pemutaran labu alas bulat hingga berguna agar pelarut dapat menguap
lebih cepat dibawah titik didihnya
3. Pelarut
4. Kelebihan dan kekurangan
Kelebihan
Instrumen ini lebih disukai, karena hasil yang diperoleh sangatlah akurat. Bila
dibandingkan dengan teknik pemisahan lainnya, misalnya menggunakan teknik
pemisahan biasa yang menggunakan metode penguapan menggunakan oven. Maka
bisa dikatakan bahwa instrumen ini akan jauh lebih unggul. Karena pada instrumen ini
memiliki suatu teknik yang berbeda dengan teknik pemisahan yang lainnya. Dan
 teknik yang digunakan dalam rotary vakum evaporator ini bukan hanya terletak pada
pemanasannya tapi dengan menurunkan tekanan pada labu alas bulat dan memutar
labu alas bulat dengan kecepatan tertentu. Karena teknik itulah, sehingga suatu pelarut
akan menguap dan senyawa yang larut dalam pelarut tersebut tidak ikut menguap
namun mengendap. Dan dengan pemanasan dibawah titik didih pelarut, sehingga
senyawa yang terkandung dalam pelarut tidak rusak oleh suhu tinggi.

5. Contoh aplikasi
Sebanyak 50 gram serbuk simplisia daun beluntas dimasukkan ke dalam Erlenmeyer
(500 ml) kemudian direndam dengan 250 ml pelarut etanol 96% p.a, ditutup dengan
aluminium foil dan dibiarkan selama 7 hari, sambil sesekali dikocok. Ekstrak yang
diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator pada suhu 70oC
sehingga diperoleh ekstrak pekat daun beluntas. Ekstrak pekat daun beluntas
dicampurkan dengan etanol 96% p,a kemudian dipartisi dengan n-heksana. Ekstrak
yang diperoleh dilakukan uji fitokimia flavonoid. Ekstrak yang positif mengandung
flavonoid dilanjutkan untuk di isolasi dan pemurnian dengan teknik kromatografi
lapis tipis (KLT) menggunakan fase diam GF254 dengan ukuran 20 cm x 20 cm dan
fase gerak campuran dari n-butanol-asam asetat-air (BAA) (4:1:5). Selanjutnya isolat
relatif murni diidentifikasi menggunakan spektrofotometer Ultra Violet – Visibel.