(High Performance Liquid Chromatography)

High Price Liquid Chromatography

KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

10/10/20
19 1
 Kromatogarfi
Cair Kinarja
Tinggi (KCKT)

High Performance
Liquid
Chromatography 10/10/20
19 2
(HPLC)
Hampir 20 % senyawa yang diketahui tidak dapat dianalisis dengan
Kromatografi Gas dengan berbagai alasan antara lain;
• Tidak mudah menguap (insufficiently volatile)
• Tidak dapat melewati kolom
• Tidak tahan panas (Thermally unstable)
• Terurai dalam kondisi saat pemisahan dengan GC.

Penggunaan HPLC tidak terbatas untuk senyawa yang mudah

menguap, tetapi juga mampu memisahkan makromolekul dan jenis-
jenis ion, senyawa alami yang labil, material polimer, dan berbagai
senyawa dengan BM besar yang mempunyai banyak gugus fungsi
dan dapat digabungkan dengan Spektrofotometer Infra Red (IR) dan
Spektrometri Massa (MS) 10/10/20
3
19

.
Teori HPLC

Pemisahan komponen campuran berdasarkan pada distribusi

kesetimbangan (K) dari komponen di dalam kedua fasa.
Cs Cs = Konsentrasi komponen dalam fasa diam
K=
Cm
Cm = Konsentrasi komponen dalam fasa gerak

Variabel yang mempengaruhi perbedaan migrasi adalah’

1. Kompetisi fasa gerak
2. Temperatur
3. Jenis fasa diam
10/10/20
19 4
 Volume retensi dan waktu merupakan ukuran yang bisa
digunakan untuk mengidentifikasi puncak pada kromatogram.

Waktu retensi (Tr) adalah waktu yang diperlukan untuk

mengelusi oleh suatu zat/bahan yang sampai pada konsentrsi
maksimum. Waktu retensi merupakan suatu fungsi dari kecepatan
fasa gerak dan volume fasa gerak. Sedang volume retensi adalah
volume fasa gerak puncak komponen tersebut sampai tepat diujung
kolom.

VR = Volume retensi
VR = F x Tr Tr = Volume alir (flow rate)gerak fasa
10/10/20
19 5
Sistem HPLC
1. Isokratik (ratio fasa gerak dicampur diluar sistem)
2. Gradient (ratio fasa gerak diatur melalui sistem dengan bantuan
mikroprosesor)
3. Recycling (isokratik dan gradient fasa gerak kembali kedalam sistim)

R B 100 % R B 100 %
a a
t t
i i
o o
P P
e e
l l
a a
r r
u u
t t

10/10/20
A 100 % A 100 %19 Waktu
6 Retensi
Waktu Retensi
Rangkaian
Dasar HPLC

Injektor

Detektor
Pompa Kolom
Wadah fasa
Wadah
gerak
Pembuangan
Rekorder
10/10/20
atau data
19 7 prosesor
 1. Tunggal (isokratik)
Wadah fasa gerak
2. Lebih dari satu (gradient)

1. Piston tunggal
Pompa
2. Piston ganda

1. 0.1 – 1.0 L (analitik)

Injektor
2. 500 L - 5 ml (preparatif)

1. Prekolom
2. Standard
Kolom
3. Radial Compression
4. Narrow Bore
5. Short

1. RI (refractive Index)
2. UV-Vis
Detektor 3. Flourescence
4. PDA (Photo Diode Array)
10/10/20
8
19

5. Amperometric
Jenis-jenis kolom HPLC

N0 Nama kolom Jenis adsorban

1 Ultrasil-Si SiO2 (silika)

2 Ultrasil-octyl Octana (C8)
3 Ultrasil-ODS Octadecana (C-18)
4 LiChrosorb Si SiO2 (silika)
5 LiChrosorb RP-2 Etana (C-2)
6 LiChrosorb RP-8 Octana (C8)
7 LiChrosorb RP-18 Octadecana (C-18)
8 LiChrosorb NH2 Amina
9 LiChrosorb CN Cyano
10/10/20
19 9
 Mekanisme pemisahan pada HPLC

A dan B mulai terpisah

Fasa gerak

Sampel A dan B
Fasa diam

Kolom

Fasa gerak
ke detektor

A10/10/20
19 B 10
Waktu retensi (min)
Sinyal pada rekorder
Syarat fasa gerak (pelarut/elusi)
HPLC
 Inner Tidak bereaksi baik dengan bahan kolom dan senyawa yang akan
dipisahkan
 Harus p.a (pro analysis) atau HPLC grade
 Mempunyai viskositas yang rendah
 Homogenous dengan pelarut lainnya
 Tidak mempunyai pengaruh terhadap sistem detektor
 Tidak korosif
 Tidak explosif baik akibat pemanasan maupun tekanan

10/10/20
19 11
Macam-macam tampilan puncak senyawa
pada kromatogram

1. Tajam (sharp)

2. Kembar (twin)

3. Berbahu (Shoulder)

4. Melebar (slope)
10/10/20
19 12
Tampilan puncak pada kromatogram pada HPLC tidak selalu sebagaimana
yang diharapkan yaitu segi tiga sama kaki, bentuk puncak yang asimetri
umum dijumpai. Hal ini terjadi sampel yang diinjeksikan lebih besar dari
kapasitas daya migrasi partikel kolom. Misalkan kemampuan daya migrasi
partikel kolom 0,1 mg/g, sedangkan sampel yang diinjeksikan 1 mg/g,
sehingga puncak memberikan kenaikan yang tajam pada permulaan dan
kemudian melebar.

h AF = b/a = 1 h AF = b/a = 2
10 % h 10 % h
a b a b

10/10/20
13
Axis waktu
19
Axis waktu
AF = asimetri faktor
Kolom selektifitas, efesiensi, ratio
pemisahan

Selektifitas cukup, tetapi

efesiensi rendah

Selektifitas dan efesiensi

baik

Selektifitas rendah, tetapi

efesiensi baik

10/10/20
19 14
Cara-cara mengatasi permasalah
pemisahan/migrasi senyawa pada HPLC

1. Mengatur kecepatan alir (flow rate) atau menaikan dan

menurunkan kecepatan alir fasa gerak.
2. Merubah perbandingan (ratio) fasa gerak atau
merubah kepolar fasa gerak.
3. Menaikan atau menurunkan temperatur kolom.
4. Membuat turunan (derivat) senyawa yang dipisahkan.
4. Menambah panjang kolom (double column)
10/10/20
19 15
Kalkulasi hasil kromatogram HPLC

Di dasarkan pada perbandingan luas area puncak

yang dihasil antara cuplikan (sampel) dan kontrol
(standard).

1. Luas segi tiga sama kaki (alas x 1/2 tinggi)

2. Garis regresi linier

10/10/20
19 16
Keuntungan-keuntungan melakukan
analisa dengan HPLC

a. Cepat (waktu analisis kurang dari 1 jam)

b. Daya pisahnya (migrasi) baik
c. Peka, detektor spesifik (UV-Vis dan Flourescence
dapat mendeteksi sampai jumlah g)
d. Kolom dapat dipakai kembali
e. Ideal untuk molekul besar, ion yang tidak bisa
dengan GC
f. Mudah memperoleh kembali cuplikan (sampel)
10/10/20
19 17
 Instrumentation
 Instruments
required:
 Mobile phase
reservoir
 Pump
 Injector
 Column
 Detector
 Data system

18
Instrumentasi

1. Pompa, merupakan salah satu bagian terpenting dalam

sistem KCKT dan berfungsi untuk mengalirkan fase
gerak ke dalam kolom. Pompa ada 2 jenis, yaitu:
pompa tekanan tetap dan pompa volume tetap

2. Injektor, berfungsi untuk memasukkan cuplikan ke

dalam kolom. Injektor pada HPLC terdiri atas injektor
septum dan autoinjektor.

3. Kolom, merupakan jantung dari KCKT yang berfungsi

sebagai alat untuk memisahkan masing-masing
komponen. Kolom umumnya terbuat dari baja tahan
karat dengan diameter 2-6 mm dan panjang 10-30 cm.
4. Detektor,berfungsi untuk mendeteksi komponen yang ada
pada eluat dan mengukur jumlahnya. Detektor ada
beberapa macam, diantaranya:
a. Detektor UV
b. Detektor Elektrokimia
c. Detektor Indeks Bias
d. Detektor Konduktivitas
e. Detektor Fotometrik
f. Detektor Fluoresen
5. Integrator, berfungsi mengubah sinyal kromatografi menjadi
bentuk angka secara otomatis dan sangat tepat
6. Recorder, untuk mencatat sinyal yang ditangkap oleh
detektor
 POMPA
Pompa yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan, antara lain:
1. Dapat memompakan fase gerak secara konstan (0,1 –10 ml/menit)
2. Dapat memberikan tekanan yan cukup tinggi
3. Memberikan fluktuasi tekanan yang cukup tinggi
4. Memberikan ganguan (derau) yang rendah
5. Cara kerja sederhana
6. Cukup lembam terhadap pelarut-pelerut yang umum digunakan
 SOLVENTS
Polar Solvents

Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol >

Oxydipropionitrile

Non-polar Solvents

N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane

 Fase Gerak
Fungsi fase gerak membawa analit untuk
masuk dan keluar dari kolom.

Pertimbangan pada pemilihan fase gerak,

antara lain:
1. Sifat dan polaritas analit/sampel
2. Polaritas pelarut
Injector port & hplc Syringe
 KOLOM

Kolom dapat dibagi atas 2 kelompok, antara lain:

Kolom Analitik: diameter dalam 2-6mm, panjang
kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom.
- Untuk kemasan pellicular, panjang yang
digunakan adalah 50-100cm.
- Untuk kemasan Mikropartikulat, panjang 10-
30cm. Dewasa ini ada yang hanya 5 cm

Kolom Preparatif: umumnya memiliki diameter 6mm

atau lebih besar dan panjang kolom 25-100cm.

Almawati 26
KOLOM
 Panjang 10-25 cm dan diameter 4,5-5,0 mm yg
diisi dg fase stationer berukuran rata-rata 5-
10mm dr bahan stainless steel
 Pengisi Kolom dapat berupa: Oktil Silan(C8),
Okta Desil Silan (C18), silica, senyawa Sianida
dan senyawa lain.
 KOLOM
Pertimbangan pemilihan Kolom, antara lain:
1. Sifat analit
2. Isi Kolom
3. Efisiensi Kolom
4. Panjang Kolom
5. Diameter kolom
6. Tekanan dalam Kolom
7. Informasi dari pustaka,kolega dan produsen

30
Column

 Small(~10 µm) silica or

polymer particles
containing a network of
uniform pores
 Twotypes (diameters of 5 ~
10 µm)
 Polymer beads
 silica-based particles
31
32
33
Guard Colomn Colomn Tubing

34
 Detektor
Pertimbangan pemilihan detektor, antara lain:
1. Sensitivitas
2. Linieritas
3. Reprodusibel
4. Mudah dioperasikan
5. Mudah perawatan
 Jenis-jenis Detektor HPLC
• Detektor UV/Vis dan PDA (Photo Diode Array)
• Detektor RI (Refraktif Indeks Detector)
• Detektor Konduktifitas (Conductivity Detector)
• Detektor Elektrokimia (Electrochemical
Detector)
• Detektor ELSD (Evaporized Light Scattering
Detector)
• Detektor MS (Mass Spectrometer Detector)

36
Detektor PDA (Photo Diode Array)
• Dapat berfungsi sebagai detektor UV/Vis biasa
• Untuk menentukan impurities
• Identifikasi peak
• Penentuan spektrum pada Rt tertentu

37
Hasil Scaning PDA Detektor dalam 3D

38
Hasil Ekstraksi dari Detektor PDA

Hasil Spektrum

Hasil
Kromatrogram
pada 254 nm

39
Urutan Prioritas
Pemilihan Detektor
• Detektor UV (254 atau 280 nm)
• Detektor UV-Vis
• Detektor Fluoresensi
• Detektor Universal: - Indeks Bias
• - Elektrokimia
Urutan Fungsi Analisis
Detektor
 Kuantitatif
1. Kadar Besar: Detektor UV-Vis
2. Kadar Kecil: Detektor Fluoresensi
 Preparatif: Detektor UV-Vis
 Kualitatif: - Detektor UV-Vis
- Detektor Fluoresensi
- Gabung dengan SM
Optimasi Pemisahan pada
KCKT Fase Terbalik
 Resolusi
 Merupakan ukuran apakah seuatu senyawa terpisah
secara baik atau tidak dengan senyawa lain
 R >1,5
Resolution for complete
separation
Ratio of Overlapping Area
Resolution is a function of
Capacity Factor, k’
Selektivitas, α

 Nilai yang menunjukkan seberapa

baik sistem kromatografi dapat
memisahkan dua komponen
 The Number of Theoritical Plate, N
Nilai yang menunjukkan jumlah piringan toritis (Theoritical Plate)
dari kolom yang digunakan dalam sistem HPLC
 Equation

N = 16 x (Rt/W)2

 Modified equation for actual

measurement
N = 5,54 x (Rt/W1/2)2

 Modified equation for

integrator
N = 6,28 x (Rt x H/Area)2

49
Contoh Perhitungan N
Resolution
Contribution of Capacity

51
Resolution
Contribution of Selectivity

52
Resolution
Contribution of Efficiency

53
Factors Affecting Resolution

54
How to increase N?
H = Panjang kolom / N

Setiap kolom
mempunyai laju
alir optimum

55
 Laju Alir Optimum

 Untuk memperoleh efisiensi kolom

4,0 mm ID 0,6 ml/min
4,6 mm ID 0,8 ml/min
6,0 mm ID 1,0 ml/min
These setting are preferable

56
Smaller Particle Size

4,0 mm ID 0,5 ml/min

4,6 mm ID 0,8 ml/min
6,0 mm ID 1,0 ml/min

57
 How to increase k’ ?

 By decreasing % of organic solvent

k’ = 2 – 10 is preferable

k’ < 2
- insufficient separation
k’ > 10
- long running time
- Broad band, cause
(1) low sensitivity
(2) poor accuracy in quantification

58
 Optimasi Solvent
Komponen Sampel:

Nitrobenzen
Benzen
2,6-Dinitrotoluen
2-Nitrotoluen
4-Nitrotoluen
3-Nitrotoluen
Toluen
2-Nitro-1,3-xylene
4-Nitro-1,3Xylene
m-Xylene

59
Hubungan antara k’ dan persentase pelarut
organik (B%)

 Log [ k’ ] = a [B%] + b (a dan b = koefisien)

For small
molecules, a 10%
increase in
percent organic
solvent (B%)
decreases the k’
of every band by
a factor of about
3.

60
How to improve α ?

Dengan mengubah:
 Fase gerak dan komposisinya
 pH
 Konsentrasi buffer
 Temperatur kolom
 Packing material (to C8, CN and Phenyl)

61
 Perubahan Fase Gerak

Although one organic solvent can not provide good resolution, 3

combination of mobile phase has a possibility to provide good
resolution, if critical pair of resolution has been changed

62
Efek pH fase gerak pada
pemisahan senyawa ionic
1: asam benzoat
2: asam sorbat
3: metilparaben

[analytical conditons]
1 mL/min
Kolom ODS
Dapar fosfat 10 mM 75%
ACN 25%
400C
UV-240 nm

63
 pH Fase Gerak

 For samples that contain acidic or basic compounds,

retention time vary with pH
R-COO- and R-NH3+

 Adjusting pH of mobile phase is very important to get

good repeatability
 Buffer solution must be selected correctly

64
Hubungan antara k’ dan pH

 Nilai k’ asam organik dan amin bervariasi tergantung

pH fase gerak

Pada rentang pKa +/- 1,5,

terdapat hubungan linear
antara k’ dan pH

65
 Precaution of pH Adjustment
 Ketika pH fase gerak sangat dekat dengan pKa analit,
adjustment pH harus sangat hati2, karena pH fase gerak
akan mempengaruhi k’
 Normalnya dipilih pH yang tidak mempengaruhi k’

66
Relationship between pH and pKa of Buffer
solution

67
 pKa of organic acid for buffer

Phosphate buffer Acetate buffer Citrate buffer

(conc. Unit: mM)

68
Effect of Packing material Characteristics on
Separation

1: asam benzoat
2: asam sorbat
3: metilparaben

[analytical conditons]
1 mL/min
Dapar fosfat 10 mM 75%
ACN 25%
400C
UV-240 nm

69
 Penambahan Pelarut Organik Lain

 Addition of co-solvent besides methanol, acetronitrile and

THF is sometimes effective to get better separation

Etil eter
Isopropil eter
Dioksan
Dimetoksietana
Sikloheksana oksida

Around 10% can be

added to normal
mobile phase for
reversed phase mode
70
Calibration methods in HPLC

External
calibration
method

Correction Internal
normalization calibration
method method

Standard
additive
method

71
External Standard Calibration
Preparation of Standards

72
External Standard Calibration
Analysis of Nevirapin (NVP)

N
V
P
N
N N V
V V P
P P

73
External Standard Calibration
Peak Area ( x 102)

74
External Standard Calibration
Calculation of Results

75
Internal Standard Calibration
Preparation of Standards

76
Internal Standard Calibration
Analysis of Nevirapin (NVP)

N
N V
V P
N P
V
N
P
V
P

77
Internal Standard Calibration

Konsentrasi

78
Internal Standard Calibration
Calculation of Results

79
Advantage of external
Standard Calibration method
 Only the target compound separation is focused

80
Disadvantage of external
Standard Calibration method
 Injection error will directly influence the quantitative
result

81
Advantage of Internal
Standard Calibration method
 Injection error can be eliminated

82
Advantage of Internal
Standard Calibration method
 Recovery in the pretreatment process can be
estimated

83
Disadvantage of Internal
Standard Calibration method
 Separation is slightly dificult

84
Disadvantage of Internal
Standard Calibration method
 It is difficult to look for the IS
compound

The chemical structure of IS compound is

similar with one of target compound
IS sample is not existent in the actual
sample

85
External standard vs Internal
Standard
 External standard calibration
 Seperation is not difficult
 Injection error will directly influence the quantitative
result

 Internal Standard Calibration

 Injection error can be eliminated
 Recovery in the pretreatment procedure can be
estimated
 Separation in slightly difficult
 Difficult to look of the IS compound

86
Standard Additive
Calibration method

87
Standard Additive
Calibration method

88