IDENTIFIKASI BERBERINE HCl DALAM OBAT

TRADISIONAL DAN SUPLEMEN KESEHATAN SECARA TLC

INTERFACE – KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
TANDEM SPEKTROMETRI MASSA.
21/OTSK/MA-PPPOMN/19

I. RUANG LINGKUP

Metode ini digunakan untuk identifikasi berberine HCl dalam obat

tradisional dan suplemen kesehatan.

II. PUSTAKA

i. Anonim. 2014. Perka BPOM No. 10 tentang Larangan Memproduksi

dan Mengedarkan Obat Tradisional dan Suplemen Kesehatan yang
Mengandung Coptis sp, Berberis sp, Mahonia sp, Chelidonium majus,
Phellodendron sp, Arcangelica flava, Tinosporae radix dan
Cataranthus roseus.

ii. Liu G., et al. 2014. The simultaneous determination of berberine,

palmatine, coptisine, epiberberine and jatrorrhizine in rat plasma by
LC-MS/MS and a pharmacokinetic comparison after the oral
administration of Rhizoma coptidis and Jiao-Tai-Wan extract.,
Analytical Methods, 6, 2998-3008.

iii. M. Thompson, S.L.R. Ellison and R. Wood. “Harmonized Guidelines

For Single-Laboratory Validation of Methods Of Analysis” Pure Appl.
Chem., 74, (5) 835 – 855 (2002).

iv. Shailajan S., Patil Y., Joshi M. 2019. Simultaneous Quantification of

Pharmacological Markers Quercetin and Berberine Using High-
Performance ThinLayer Chromatography (HPTLC) and High-
Performance Liquid Chromatography (HPLC) from a Polyherbal
Formulation Pushyanuga Churna, Journal of AOAC International, 102,
p. 1003-1013.

III. PRINSIP

Berberine HCl dipisahkan dari sampel dan diidentifikasi secara

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) berdasarkan perbedaan polaritas dan
kelarutan serta dikonfirmasi secara Spektroskopi Massa.

1
IV. BAHAN DAN BAKU PEMBANDING

1. Bahan
Lempeng HPTLC silika gel 60 F254.

2. Baku Pembanding
Berberine HCl USPRS.

V. PEREAKSI
- Pelarut : Metanol
- Rinsing solvent (larutan pencuci) untuk penotolan dan autosampler LC
Asetonitril : Metanol : Air : n-Propanol (1:1:1:1)*)
- Eluen KLT : Toluen : Etil Asetat : Metanol : Asam formiat (6:6:2:1)
- Fase gerak TLC-MS Interface : asam formiat 0,1% dalam metanol
- Fase Gerak LC-MS/MS : asam formiat 0,1% dalam air (FG A) –0,1%
asam formiat dalam metanol (FG B)

*) Untuk menghindari kontaminasi silang dalam penotolan dikarenakan

sifat berberine yang rawan menempel pada syringe.

VI. PERALATAN

Tabung sentrifuga (baru), Seperangkat peralatan TLC System, TLC-MS

Interface; LC-MS/MS, Kolom C18 dengan dimensi 50 x 2,1 mm; ukuran
partikel 5 µm (contoh : Agilent eclipse plus C18).

VII. PROSEDUR

1. Larutan Uji
a. Sediaan padat
Penetapan bobot rata-rata terlebih dahulu dilakukan terhadap 10
bungkus/kapsul/tablet. Sejumlah obat tradisional/suplemen kesehatan
dihomogenkan kemudian ditimbang lebih kurang 1 g, dimasukkan ke
dalam tabung sentrifuga 15 ml, ditambah 10 ml metanol, divorteks
selama 5 menit dan disonikasi selama 1 jam. Selanjutnya disentrifus
dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Larutan disaring dengan
penyaring membran 0,45 µm. Filtrat di pipet 100 μl ke dalam vial dan
ditambahkan 900 μl metanol. Dilakukan 2 (dua) replikasi.

b. Sediaan Cair
Sejumlah obat tradisional/suplemen kesehatan dihomogenkan
kemudian dipipet lebih kurang 2 ml, dimasukkan ke dalam tabung
sentrifuga 15 ml, ditambah 8 ml metanol, divorteks selama 5 menit

2
 dan disonikasi selama 1 jam. Selanjutnya disentrifus dengan
kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Larutan disaring dengan
penyaring membran 0,45 µm. Filtrat di pipet 100 μl dan ditambahkan
900 μl metanol. Dilakukan 2 (dua) replikasi.

2. Larutan Baku Induk

Sejumlah baku berberine HCl ditimbang saksama 5 mg, dimasukkan ke
dalam labu tentukur 10-ml dan ditambahkan metanol sampai tanda.

3. Larutan Baku Kerja

Sejumlah 100 µl Larutan Baku Induk dipipet dan dimasukkan ke dalam
vial dan ditambahkan 900 µl metanol.

4. Larutan Spiked Sample

Sejumlah obat tradisional/suplemen kesehatan ditimbang 1 g atau dipipet
2 ml, ditambahkan 200 µl Larutan Baku Induk berberine HCl dan diberi
perlakuan seperti Larutan Uji.

5. Cara penetapan
a. Secara KLT
Larutan Uji, Larutan Spiked Sample dan Larutan Baku Kerja
ditotolkan secara terpisah dengan kondisi analisis secara KLT sebagai
berikut :
Fase diam : Lempeng HPTLC silika gel 60 F254
ukuran 20 x 10 cm
Eluen : Toluen : Etil Asetat : Metanol : Asam formiat
(6:6:2:1)
Penjenuhan : Dengan kertas saring 20 menit
Jarak rambat : 7,5 cm
Penotolan : 10µl, bentuk pita 6 mm, rinsing cycle : 3 kali
Deteksi bercak : UV366

Hitung dan bandingkan nilai Rf masing-masing bercak yang sejajar

dengan larutan baku.

3
b. Spektrofotodensitometri
Lempeng KLT hasil eluasi dilakukan pemindaian dengan spesifikasi
sebagai berikut :

c. TLC-MS Interface
Lempeng KLT hasil eluasi dilakukan penandaan terhadap bercak yang
sejajar dengan bercak berberine HCl, selanjutnya dianalisis
menggunakan alat TLC-MS Interface dengan spesifikasi sebagai
berikut :
Ion source : ESI
Ionisation : Positif
Mode : MRM
Fase Gerak : asam formiat 0,1% dalam metanol (FG B)

Analit Q1 Mass Q3 Mass CE

(Da) (Da)
Berberine HCl 336,2 320,1 42
336,2 292,1 42
336,2 278,3 57

Step Time Keterangan

Pengukuran sistem 1-2 menit Setiap pengukuran bercak
yang sejajar dengan bercak
Pengukuran blank plate 1 min baku berberine HCl
diselingi dengan
Pengukuran sampel 2 min pengukuran blank plate

Pengukuran baku 2 min

Pengukuran sistem 1-2 menit

4
 d. LC-MS/MS
Pelarut Metanol, Larutan Uji, Larutan Spiked Sample dan Larutan
Baku Kerja disuntikkan secara terpisah ke dalam LC-MS/MS dengan
kondisi sebagai berikut:
Fase gerak : Fase gerak A – Fase Gerak B
Sistem elusi : gradien
Kolom : C18
Laju alir : 0,4 ml/menit
Detektor : Spektrometri Massa (MS/MS)
Suhu kolom : 40 °C
Vol. Penyuntikan : 5 µl

Teknik Elusi Program Gradien :

Waktu (menit) Fase gerak Fase Gerak
A (%) B (%)
0,01 80 20
0,50 80 20
1,50 10 90
4,00 10 90
4,20 80 20
6,00 Stop

Analit Q1 Mass Q3 Mass CE

(Da) (Da)
Berberine HCl 336,2 320,1 42
336,2 292,1 42
336,2 278,3 57

6. Interpretasi Hasil
Hasil uji dinyatakan positif jika :
a. Waktu retensi dan nilai m/z dari puncak larutan uji sama dengan
puncak larutan baku dan larutan spiked sample.
b. Intensitas Relatif Ion (dihitung dengan cara membandingkan area
qualifier ion terhadap area quantifier ion) dari puncak larutan uji
sama dengan puncak larutan baku dan larutan spiked sample dengan
nilai rasio sebagai berikut :

Relative intensity of LC-MS/MS

qualifier ion(s) (relative
compared to target ion deviation)
> 50 % ± 20 %
> 20 % to 50 % ± 25 %
> 10 % to 20 % ± 30 %
≤ 10 % ± 50 %

5
VIII. PERSYARATAN

Sesuai peraturan yang berlaku

6
IX. HASIL VALIDASI

1. KLT dan Spektrofotodensitometri

a. Selektifitas Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

7
 b. Penetapan Batas Deteksi

LOD visual : LOD 5

LOD Spektrodensitometri = terbaca mulai dai LOD 6

2. TLC-MS Interface
a. Spesifisitas

8
Spike 1 Spike 2
Baku 1

Baku 2

9
b. Penetapan Batas Deteksi

10
11
3. LC-MSMS
a. Pelarut Metanol

b. Larutan Sampel

12
 c. Larutan Spiked sample

d. Larutan Baku Berberine HCl

4. Penetapan Batas Deteksi (LOD)

a. KLT : 0,57 μg/g
b. Spektrodensitometri : 0,46 μg/g
c. TLC-MS Interface : 0,09 μg/g
d. LC-MS/MS : 0,01 μg/g

13