IDENTIFIKASI AMFETAMIN SULFAT, BISAKODIL,

FENFLURAMIN HCl, ORLISTAT

DAN SIBUTRAMIN HCl
DALAM OBAT TRADISIONAL DAN SUPLEMEN
KESEHATAN SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI TANDEM SPEKTROMETRI MASSA
10/OTSK/MA-PPPOMN/19

I. RUANG LINGKUP

Metode ini digunakan untuk analisis kualitatif amfetamin sulfat, bisakodil,

fenfluramin HCl, orlistat dan sibutramin HCl dalam obat tradisional dan
suplemen kesehatan.

II. PUSTAKA

i. Anonim. 2012. Peraturan Menteri Kesehatan RI No. 007 Tentang

Registrasi Obat Tradisional, Jakarta.

ii. Anonim. 2019. Peraturan Badan Pengawas Obat dan Makanan No. 17
tentang Persyaratan Mutu Suplemen Kesehatan, Jakarta.

iii. Anonim. 2014. Analysis of illegal drugs and pharmaceutical ingredients,

2nd edition, Korean National Institute of Food and Drugs, Publication
Registration Number: 11-1471057-000020-14.

iv. Zeng, Y., et al. 2015. Analysis of 40 weight loss compounds adulterated
in health supplements by liquid chromatography quadrupole linear ion
trap mass spectrometry, Drug Testing and Analysis, DOI
10.1002/dta.1846.

III. PRINSIP

Amfetamin sulfat, bisakodil, fenfluramin HCl, orlistat dan sibutramin HCl

dipisahkan dari matriks sampel dan diidentifikasi secara Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi dengan detektor MS/MS.

IV. BAHAN/BAKU PEMBANDING

1. Bahan
-
 2. Baku Pembanding
Amfetamin sulfat BPFI, Bisakodil BPFI, Fenfluramin HCl BPFI, Orlistat
Sigma-Aldrich, Sibutramin HCl BPFI.

V. PEREAKSI

- Air bebas mineral; asetonitril derajat KCKT; metanol derajat KCKT;

asam formiat.
- Pembuatan larutan :
- Fase gerak A : Asam formiat 0,1% dalam air
- Fase gerak B : Asam formiat 0,1% dalam asetonitril
- Pelarut adalah metanol 80%
- Larutan Pengencer adalah fase gerak A

VI. PERALATAN

Seperangkat peralatan Kromatograf Cair Kinerja Tinggi yang dilengkapi

dengan detektor MS triple quadrupole, kolom C18 dengan dimensi 2.1 x 50
mm; ukuran partikel 5 µm (contoh : Agilent eclipse plus C18).

VII. PROSEDUR

1. Larutan Uji
a. Sampel Padat
Sampel obat tradisional/suplemen kesehatan dihomogenkan. Sejumlah
minimal 1 gram sampel ditimbang, dimasukkan ke dalam tabung
sentrifuga 15 ml, ditambahkan 10 ml Pelarut, divortex dan disonikasi
selama 15 menit. Larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm
selama 15 menit. Beningan diambil dan diencerkan dengan Larutan
Pengencer sejumlah 100 kali pengenceran atau disesuaikan. Larutan
disaring dengan penyaring membran 0,45 µm. Dibuat 2 (dua)
replikasi.

b. Sampel Cair
Sampel obat tradisional/suplemen kesehatan dihomogenkan. Sejumlah
minimal 1 ml sampel dipipet, dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga
15 ml, ditambahkan 9 ml Pelarut, divortex dan disonikasi selama 15
menit. Larutan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15
menit. Beningan diambil dan diencerkan dengan Larutan Pengencer
sejumlah 100 kali pengenceran atau disesuaikan. Larutan disaring
dengan penyaring membran 0,45 µm. Dibuat 2 (dua) replikasi.
2. Larutan Baku
a. Larutan Baku Induk
Ditimbang saksama masing-masing 5 mg baku amfetamin sulfat,
bisakodil, fenfluramin HCl, orlistat dan sibutramin HCl. Kemudian
dimasukkan ke dalam labu tentukur 10-ml terpisah, dilarutkan dan
diencerkan dengan Pelarut sampai tanda (konsentrasi masing-masing
larutan 500 µg/ml).

b. Larutan Baku Campur

i. Sejumlah 10 µl Larutan Baku Induk amfetamin sulfat, bisakodil,
fenfluramin HCl dan sibutramin HCl serta 500 µl Larutan Baku
Induk orlistat dipipet ke dalam sebuah labu tentukur 5-ml,
diencerkan dengan Pelarut sampai tanda (konsentrasi larutan
amfetamin sulfat, bisakodil, fenfluramin HCl dan sibutramin HCl 1
µg/ml; konsentrasi orlistat 50 µg/ml).
ii. Sejumlah 50 µl larutan di atas dipipet ke dalam labu tentukur 5-ml,
diencerkan dengan Larutan Pengencer sampai tanda (konsentrasi
larutan akhir amfetamin sulfat, bisakodil, fenfluramin HCl dan
sibutramin HCl 10 ng/ml; konsentrasi orlistat 500 ng/ml).

3. Larutan Spiked Sample

Sejumlah obat tradisional/suplemen kesehatan ditimbang 1 g atau dipipet
1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga 15 ml. Kemudian
ditambahkan masing-masing 20 µl Larutan Baku Induk amfetamin sulfat,
bisakodil, fenfluramin HCl dan sibutramin HCl serta 1000 µl Larutan
Baku Induk orlistat. Selanjutnya ditambah Pelarut hingga volume akhir
10 ml dan diberi perlakuan seperti Larutan Uji.

4. Cara Penetapan
Larutan Pengencer, Larutan Uji, Larutan Spiked Sample dan Larutan
Baku Campuran masing-masing disuntikkan secara terpisah ke dalam
LC-MS/MS dengan kondisi analisis sebagai berikut :
a. Kondisi LC
Fase Gerak : Fase gerak A dan Fase gerak B
Kolom : C18
Laju Alir : 0,4 ml/menit
Detektor : Spektrofotometri Massa (MS/MS)
Suhu : 40 ºC
Volume Penyuntikan : 20 µl
Teknik Analisis : teknik elusi gradien
 Waktu (Menit) Fase gerak A Fase gerak B
(%) (%)
0,50 80 20
2,00 5 95
4,00 5 95
4,20 80 20
6,00 80 20
6,10 STOP

b. Kondisi MS/MS
Ionisasi : Positif
Mode : MRM

Parent Ion
Nama Analit Daughter Ion (Q3) CE
(Q1)
Amfetamin sulfat 136,1 119,1 quantifier 13
91,1 qualifier 25
Bisakodil 362,2 184,1 quantifier 39
167,1 qualifier 69
Fenfluramin HCl 232,1 159,0 quantifier 33
109,0 qualifier 61
Orlistat 496,3 319,3 quantifier 20
160,0 qualifier 1 18
337,3 qualifier 2 20
Sibutramin HCl 280,2 125,1 quantifier 33
139,1 qualifier 23

Amati kromatogram, waktu retensi dan intensitas relatif ion (luas area
puncak) pada nilai m/z yang dipersyaratkan.

5. Interpretasi Hasil
Hasil uji dinyatakan positif jika :
a. Waktu retensi dan nilai m/z (quantifier ion dan qualifier ion) dari
puncak larutan uji sama dengan puncak larutan baku dan larutan
spiked sample.
b. Intensitas Relatif Ion (dihitung dengan cara membandingkan area
qualifier ion terhadap area quantifier ion) dari puncak larutan uji sama
dengan puncak larutan baku dan larutan spiked sample dengan nilai
rasio sebagai berikut :
 Relative intensity of LC-MS/MS
qualifier ion(s) (relative
compared to target ion deviation)
> 50 % ± 20 %
> 20 % to 50 % ± 25 %
> 10 % to 20 % ± 30 %
≤ 10 % ± 50 %

VIII. PERSYARATAN

Sediaan obat tradisional dan suplemen kesehatan tidak boleh mengandung

amfetamin sulfat, bisakodil, fenfluramin HCl, sibutramin HCl dan orlistat.
IX. HASIL VALIDASI

1. Selektivitas
a. Kromatogram Pelarut

b. Kromatogram Larutan Matriks Padat

c. Kromatogram Larutan Matriks Cair

d. Kromatoram Larutan Baku Amfetamin sulfat

e. Kromatogram Larutan Baku Bisakodil

f. Kromatoram Larutan Baku Fenfluramin HCl

g. Kromatogram Larutan Baku Sibutramin HCl

h. Kromatogram Larutan Baku Orlistat

 i. Kromatogram Larutan Spiked Sample Padat

j. Kromatogram Larutan Spiked Sample Cair

2. Penetapan Batas Deteksi (LOD)

a. Sediaan Padat
i. Amfetamin sulfat : 76,5 ng/g
ii. Bisakodil : 49,4 ng/g
iii. Fenfluramin HCl : 62,9 ng/g
iv. Sibutramin HCl : 83,9 ng/g
 v. Orlistat : 3,8 µg/g

b. Sediaan Cair
i. Amfetamin sulfat : 52,2 ng/ml
ii. Bisakodil : 43,4.ng/ml
iii. Fenfluramin HCl : 49,5 ng/ml
iv. Sibutramin HCl : 20,7 ng/ml
v. Orlistat : 2,9 µg/ml