REVIEW TUGAS AKHIR VALIDASI METODE UJI

FASYA APRILIA
NIM 2118856
KELAS 3D

PROGRAM STUDI DIPLOMA TIGA

ANALISIS KIMIA

BADAN PENGEMBANGAN SUMBER DAYA MANUSIA

INDUSTRI PUSAT PENDIDIKAN DAN PELATIHAN
INDUSTRI POLITEKNIK AKA BOGOR
2023
 REVIEW VALIDASI METODE UJI

1. Penyusun Laporan : Ica Martina Br Bangun (1918363)

2. Reviewer : Fasya Aprilia (2118856)
3. Judul Laporan Tugas Akhir :
VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR PIRIDOSTIGMIN BROMIDA
DALAM TABLET SALUT SELAPUT PIRIDOSTIGMIN BROMIDA 60 mg
SECARA HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
DI PT NOVELL PHARMACEUTICAL LABORATORIES

Catatan : Pada penulisan judul laporan sudah baik

4. Metode Acuan/Standar :
• PT Novell Laboratories melakukan penetapan kadar piridostigmin bromida
yang mengacu pada Farmakope Edisi VI. Metode yang digunakan untuk
penetapan kadar piridostigmin bromida dalam tablet piridostigmin bromida
60 mg secara High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan
laju alir 2,0 mL/menit mengacu pada metode non-standar oleh perusahaan
drug master file (DMF) dari supplier bahan baku.
• Validasi penetapan kadar piridostigmin bromida mengacu pada UNITED
STATE PHARMACOPEIA (2018).

Catatan : Penulisan metode acuan sudah baik dan terdapat di bagian latar belakang

5. Ruang Lingkup :
Menurut KEMENTRIAN KESEHATAN RI (2020), Tablet piridostigmin bromida
mengandung piridostigmin bromida tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari
105,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

Catatan : Penulisan ruang lingkup sudah baik dan terdapat dibagian latar belakang

6. Matriks Sampel : Tablet Salut Selaput Piridostigmin Bromida 60 mg

Catatan : Penulisan matriks sampel sudah baik dan terdapat dibagian judul

7. Analit : Piridostigmin Bromida

Catatan : Penulisan analit sudah baik dan terdapat dibagian judul

8. Teknik : Secara High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Catatan : Penulisan metode teknik yang digunakan sudah baik dan terdapat
dibagian judul

9. Latar Belakang melakukan validasi :

a. Modifikasi : mengubah laju alir 2,0 menjadi 1,8 mL/menit
Menurut ROSYDIANTI & ELA (2019), tekanan yang tinggi dapat merusak
kolom sehingga dapat mempengaruhi waktu retensi dan hasil kromatogram.
Divisi Analytical Development PT Novell Pharmaceutical Laboratories mencoba
mengembangkan metode baru untuk penetapan kadar piridostigmin bromida
yaitu dengan mengubah laju alir 2,0 menjadi 1,8 mL/menit dengan pertimbangan
tekanan yang stabil, menghemat penggunaan fase gerak dan dapat
memperpanjang usia kolom. Adanya modifikasi terhadap metode penetapan
kadar tersebut, menyebabkan perlu dilakukannya validasi metode uji untuk
mengetahui keabsahan dari metode yang dimodifikasi tersebut (HARMITA,
2004).

Catatan : Modifikasi terdapat dalam latar belakang paragraf 4.

b. Gap Analysis : -
Catatan : Tidak ada Gap Analysis

c. Tujuan :
Percobaan ini bertujuan untuk memastikan bahwa metode analisis kadar
piridostigmin bromida dalam tablet salut selaput dengan modifikasi variabel
laju alir dari volume 2,0 mL/menit menjadi 1,8 mL/menit dapat memberikan
data yang handal. Hasil percobaan kemudian dibandingkan dengan syarat
keberterimaan PT Novell Pharmaceutical Laboratories yaitu protokol
perusahaan (Validation Master Plan) sehingga dapat digunakan dalam
analisis rutin.

Catatan : Tidak ditulis berapa rentang syarat keberterimaannya

10. Prosedur/Cara Kerja :

2.3.1 Tahap Persiapan
Pada tahap persiapan meliputi pembuatan fase gerak untuk HPLC (Larutan A),
pelarut untuk standar dan sampel (Larutan B), dan larutan lainnya yang akan
diuji.

2.3.1.1 Preparasi Larutan A

Larutan A digunakan sebagai fase gerak HPLC. Larutan A dibuat
dengan cara menimbang satu gram natrium 1-heptanasulfonat, kemudian
dilarutkan dalam 500 mL akuademin ke gelas piala 1.000 mL. Larutan tersebut
kemudian ditambahkan 5 mL trietilamina dan 100 mL asetonitril, lalu
ditambahkan asam fosfat 85% hingga pH 3,0. Larutan kemudian diencerkan
dengan akuademin hingga 1.000 mL dan disonikasi untuk menghilangkan gas.
2.3.1.2 Preparasi Larutan B
Larutan B digunakan sebagai pelarut standar dan sampel. Larutan B
dibuat dengan cara memipet asam fosfat sebanyak 6,59 mL, kemudian
dilarutkan dalam 500 mL akuademin. Larutan kemudian ditambahkan NaOH 1
N hingga pH 7,0 dan diencerkan dengan akuademin hingga 1.000 mL.

2.3.1.3 Preparasi Sampel Simulasi Piridostigmin Bromida

Sampel simulasi merupakan simulasi tablet piridostigmin bromida yang
terdiri dari matriks tablet (tambahan) dan bahan aktif dengan formula tertentu.
Sampel simulasi ini akan digunakan untuk pengujian akurasi. Jumlah bahan
yang diperlukan untuk pembuatan matriks dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Bahan yang Diperlukan untuk Pembuatan Sampel Simulasi
Piridostigmin Bromida 60 mg.
Simulasi Piridostigmin Matriks
(%) Bromida (mg) (mg)
80 240 1.560
100 300 1.500
120 360 1.440

Catatan : Bahan aktif yang digunakan tidak disebutkan

2.3.1.4 Preparasi Larutan Deret Standar Piridostigmin Bromida

Larutan deret standar piridostigmin bromida dengan konsentrasi 80%;
90%; 100%; 110% dan 120% dibuat dengan cara menimbang piridostigmin
bromida working standar masing-masing sebanyak 20,00 mg; 22,50 mg; 25,00
mg; 27,50 mg dan 30,00 mg, kemudian dimasukkan ke labu ukur 100 mL.
Sebanyak 50 mL pelarut (Larutan B) ditambahkan ke masing-masing labu ukur
kemudian disonikasi selama 20 menit hingga larut. Larutan tersebut kemudian
diencerkan dengan pelarut hingga tanda batas volume lalu dihomogenkan.
Larutan dimasukkan ke vial HPLC.

2.3.1.5 Preparasi Larutan Uji Kesesuaian Sistem (UKS)

Larutan deret standar piridostigmin bromida dengan konsentrasi 100%
digunakan sebagai larutan uji kesesuaian sistem.

2.3.1.6 Preparasi Larutan Sampel Akurasi Piridostigmin Bromida

Larutan sampel akurasi piridostigmin bromida dibuat dengan cara
menimbang serbuk sampel simulasi yang telah dibuat sebelumnya sebanyak 60
mg. Serbuk tersebut dimasukkan ke labu ukur 20 mL, lalu dilarutkan dengan
5,0 mL pelarut dan disonikasi selama 20 menit. Larutan diencerkan dengan
pelarut hingga tanda volume kemudian dihomogenkan. Larutan tersebut dipipet
sebanyak 5,0 mL ke labu ukur 10 mL lalu diencerkan dengan pelarut hingga
volume dan dihomogenkan dengan vortex mixer. Larutan disaring dengan
mikrofilter PVDF 0,45 μm dan dimasukkan ke vial HPLC.
2.3.1.7 Preparasi Larutan Sampel untuk Presisi (Repeatability)
Pada uji repeatability sampel yang digunakan adalah sampel obat jadi
yang telah diproduksi oleh PT Novell Pharmaceutical Laboratories. Tablet
sebanyak 20 dikupas salutnya lalu dihitung bobot reratanya, kemudian digerus
sampai menjadi serbuk. Bobot rerata tablet didapatkan 367,16 mg. Serbuk
ditimbang 1/6 bobot rerata tablet jadi sebanyak 61,20 mg dimasukkan ke labu
ukur 20 mL, lalu dilarutkan dengan 5,0 mL pelarut dan disonikasi selama 20
menit. Larutan diencerkan dengan pelarut hingga tanda volume, kemudian
dikocok homogen. Larutan tersebut dipipet sebanyak 5,0 mL ke labu ukur 10
mL, lalu diencerkan dengan pelarut hingga volume dan dihomogenkan dengan
vortex mixer. Larutan disaring dengan mikrofilter PVDF 0,45 μm. Larutan
dimasukkan ke vial HPLC.

2.3.1.8 Pengkondisian Operasional HPLC

Metode instrumen High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Shimadzu LC-2030C yang digunakan :
1. Kolom : LiChrosper 100 RP-18 (5μm), 250 mm x 4,0 mm
2. Detector : UV
3. Fasa gerak : Larutan A
4. Laju alir : 2,0 mL/menit (normal); 1,8 mL/menit (modifikasi)
5. Teknik alir fasa gerak : Isokratik
6. Panjang gelombang : 270 nm
7. Volume injeksi : 20 μL
Pengkondisian instrumen meliputi kolom kromatografi, detektor,
panjang gelombang detektor, laju alir, dan volume injeksi. Pengkondisian
kolom dilakukan dengan pencucian asetonitril 100%, kemudian dilanjutkan
dengan pencucian dengan perbandingan asetonitril dan air (1:1) dan diakhiri
dengan pencucian dengan fase gerak.
11. Rekap Hasil Validasi Metode Uji :

Tabel 2. Hasil Hasil Pengujian Syarat keberterimaan Simpulan

Uji Parameter (Validation Master
Plan PT Novell
Validasi Metode Pharmaceutical
Penetapan Kadar Laboratories)
Piridostigmin
Bromida secara
HPLC Parameter
Uji Kesesuaian %SBR luas area = %SBR luas area dan Memenuhi Syarat
Sistem (Terhadap 0,102% waktu retensi ≤
Larutan Standar %SBR waktu retensi 1,00%; Tailing
100%) = 0,065% factor ≤ 1,5
Tailing Factor =
1,162
Selektivitas Pada kromatogram Pelarut dan Matriks Memenuhi Syarat
(Terhadap Baseline, tidak terdapat peak tidak berpengaruh
Pelarut, Plasebo, yang signifikan pada terhadap kadar (Area
Standar dan Sampel waktu retensi sama ≥ 1%)
dengan zak aktif
Linieritas Deret Koefisien Korelasi r ≥ 0,995 Memenuhi Syarat
Standar (r) = 0,9972
Piridostigmin
Bromida
(80,90,100,100,120)
%
Uji Akurasi %Recovery = %Recovery = Memenuhi Syarat
(Terhadap sampel (99,07-99,98)% (98,00-102,00)%
simulasi
80,100,120)%
Uji Presisi % SBR = 0,50% %SBR ≤ 2,0% Memenuhi Syarat
(Terhadap sampel
obat jadi) dengan
kemurnian 100,54%
Uji Presisi Antara %Relatif Deviasi %Relatif Deviasi Memenuhi Syarat
Dua Analis Gabungan = 0,013% Gabungan ≤ 5,0%
(Terhadap sampel
simulasi
80,100,120)%
Uji Stabilitas % Bias pada larutan % Bias ≤ 2,0% Memenuhi Syarat
(Terhadap Larutan standar = 0,684%
deret standar dan % Bias pada sampel
sampel simulasi = 1,176%
100%)
Uji Ketegaran F hitung (80, 100, Fhitung < Ftabel Memenuhi Syarat
(Terhadap Laju alir 120)% = 6,366; t hitung < t table
1,8 mL/menit) 1,081;1,838
F tabel = 39,00
t hitung (80, 100,
120) =
3,599;1,630;0,106
t tabel = 3,747

Catatan : Tidak melakukan uji estimasi ketidakpastian, LoQ, LoD, konfirmasi

identitas, MDL.
12. Review Uji Kesesuaian Sistem (UKS)
a. Cara Kerja
Uji kesesuaian sistem digunakan larutan deret standar piridostigmin
bromida dengan konsentrasi 100% diinjeksikan HPLC menggunakan
autosampler sebanyak enam kali pengulangan, kemudian kromatogram dan
parameter yang meliputi waktu retensi, luas area, dan tailing factor. Sistem
dikatakan memenuhi syarat apabila simpangan baku relatif (SBR) pada waktu
retensi dan luas area kurang dari atau sama dengan 1,0% (SBR ≤ 1,0%) dan
tailing factor ≤ 1,5%.

b. Pengolahan Data
Data kromatogram yang dihasilkan dari pengukuran larutan standar piridostigmin
bromida dengan enam kali pengulangan ditampilkan berupa luas area, waktu
retensi, dan tailing factor (ICH, 2006). Syarat keberterimaan dengan parameter
simpangan baku relatif (SBR) luas area dan waktu retensi dari ulangan
penyuntikan diolah datanya dengan rumus sebagai berikut:

Keterangan:
xi = nilai luas area dan waktu retensi ke-i
x̅ = nilai rerata luas area dan waktu retensi
i = 1,2,3,…n
n = banyaknya ulangan
SB = simpangan baku
SBR = simpangan baku relatif (%)

c. Hasil
Tabel 3. Hasil Uji Kesesuaian Sistem (UKS) terhadap Standar Piridostigmin
Bromida 100% secara HPLC
Ulangan Luas Area Retensi Tailing Factor
1 2.655.854 3,200 1,159
2 2.655.133 3,200 1,160
3 2.653.158 3,200 1,161
4 2.653.079 3,202 1,161
5 2.648.784 3,203 1,164
6 2.650.420 3,205 1,165
Rerata 2.652.738 3,202 1,162
SB 2.710,919 0,002 0,002
%SBR 0,102 0,065 0,201
 Berdasarkan pengujian uji kesesuaian sistem dapat dilihat pada Tabel 3,
diperoleh %SBR dari rata-rata luas area standar piridostigmin bromida sebesar
0,102%, %SBR waktu retensi sebesar 0,065% dan nilai tailing factor sebsesar
1,162. Nilai %SBR menunjukan presisi (ketelitian) dari luas area, waktu retensi dan
tailing factor menunjukan bahwa metode sangat teliti (SUMARDI, 2002). Nilai ini
memenuhi kriteria keberterimaan % SBR luas area dan waktu retensi standar
piridostigmin bromida  1,0%, sedangkan nilai rerata tailing factor  1,5%.
Artinya, sistem pada HPLC berjalan dengan baik dan benar sesuai prosedur selama
proses analisis yang akan dilakukan selanjutnya sehingga data yang dihasilkan
dapat dipercaya untuk menyimpulkan suatu hasil pengujian dalam kondisi yang
baik dan siap digunakan untuk analisis. Data kromatogram dan hasil perhitungan
dapat dilihat pada Lampiran 3 dan Lampiran 4.
13. Review Uji Selektivitas terhadap Baseline, Pelarut, Plasebo, Standar dan
Sampel dengan Konsentrasi 100%
a. Cara Kerja
Uji selektivitas digunakan pelarut, plasebo, larutan deret standar dan
sampel simulasi piridostigmin bromida dengan konsentrasi 100% yang
diinjeksikan menggunakan autosampler. Hasil analisis kromatogram dari
baseline, pelarut, plasebo, larutan standar dan sampel dengan konsentrasi
100% dibandingkan dengan syarat keberterimaan selektivitas yang ditentukan
oleh PT Novell Pharmaceutical Laboratories yaitu pada kromatogram pelarut,
plasebo tidak terdapat peak yang signifikan (area ≥ 1,0%) pada waktu retensi
yang sama dengan zat aktif.

b. Pengolahan Data :

Catatan : Tidak ada pengolahan data

c. Hasil
Pada pengujian ini selektivitas metode ditentukan dengan
membandingkan kromatogram hasil analisis dari baseline, pelarut, plasebo,
larutan standar 100% dan sampel simulasi 100%. Evaluasi uji selektivitas
ditentukan dari kromatogram pelarut dan plasebo berdasarkan signifikansi area
peak pada waktu retensi yang sama terhadap zat aktif. Hasil uji selektivitas
dapat dilihat pada Gambar 3.
Berdasarkan hasil pengujian selektivitas terhadap baseline, pelarut,
plasebo, standar piridostigmin bromida konsentrasi 100%, dan sampel
piridostigmin bromida 100% dapat dilihat pada Gambar 2. Pengujian pada
baseline (a), pelarut (b) dan plasebo (c) tidak terdapat peak yang signifikan
pada waktu retensi yang sama dengan zat aktif sehingga metode ini spesifik
untuk analisis piridostigmin bromida. Dari hasil tersebut menunjukan
kemampuan bahwa metode penetapan kadar piridostigmin bromida dapat
mengukur secara akurat dan spesifik respon analit di dalam lingkungan
senyawa yang mungkin ada di dalam sampel sehingga dapat dikatakan bahwa
metode penetapan kadar piridostigmin bromida dapat mengukur secara akurat
dan spesifik respon analit di dalam lingkungan senyawa yang mungkin ada di
dalam sampel sehingga dapat dikatakan bahwa pada analisis tidak terdapat
gangguan dari pelarut maupun matriks/plasebo.
 Gambar 2. Hasil Pengujian Selektivitas terhadap Baseline (a), Pelarut (b),
Plasebo (c), Standar (d) dan Sampel (e) dengan Konsentrasi 100%
pada Sistem HPLC.

14. Review Uji Linearitas

a. Cara Kerja
Uji Linearitas digunakan larutan deret standar piridostigmin bromida (80,
90, 100, 110, 120)% diinjeksikan menggunakan autosampler. Hasil tersebut
kemudian dibandingkan dengan syarat keberterimaan linearitas yaitu hasil
koefisien korelasi (r) ≥ 0,995.

Catatan : Tidak dijelaskan berapa kali pengulangan yang dilakukan

b. Pengolahan Data
Pada uji linearitas dilakukan sebanyak lima kali pengulangan. Data kromatogram
yang dihasilkan yaitu luas area standar diolah menggunakan persamaan
linearitas. Persamaan linearitas untuk standar tersebut sebagai berikut (ICH,
2006):
y = a + bx
 Keterangan
a = intercept kurva regresi linier
b = slope kurva regresi linier
r = koefisien korelasi
xi = konsentrasi ke-i (mg/L)
yi = luas area standar ke-i
i = 1,2,3, ...n
n = banyak pengulangan

Catatan : Tidak ada satuan slope dan intercept

c. Hasil
Hasil pengujian linearitas dapat dilihat pada grafik, sedangkan data
kromatogram pengujian linearitas dan contoh perhitungan linearitas dapat
dilihat pada Lampiran 5 dan Lampiran 6.

Gambar 3. Grafik Hubungan Antara Konsentrasi Standar Piridostigmin

Bromida dengan Luas Area
 Berdasarkan hasil pengujian linearitas, koefisien korelasi (r) sebesar
0,9972. Hasil tersebut menyatakan bahwa hubungan antara konsentrasi standar
linearitas piridostigmin bromida dengan luas area mempunyai korelasi yang
positif dan kuat. Korelasi positif menunjukkan bahwa semakin tinggi
konsentrasi maka luas area akan semakin bertambah besar. Korelasi positif
menyatakan bahwa setiap kenaikan konsentrasi piridostigmin bromida maka
luas area juga akan semakin naik (NURYADI dkk, 2017). Hasil dari koefisien
korelasi (r) memenuhi syarat keberterimaan yang ditetapkan oleh PT Novell
Pharmaceutical Laboratories yaitu r ≥ 0,995. Persamaan regresi yang
didapatkan ialah y = 10.525,167x – 43.107,233 dapat diinterpretasikan bahwa
ketika konsentrasi piridostigmin bromida sebesar nol maka luas area yang
diperoleh sebesar -43.107,233 sedangkan untuk slope sebesar 10.525,167 dapat
dikatakan bahwa jika variabel konsentrasi piridostigmin bromida naik satu
satuan maka variabel luas area juga akan naik sebesar 10.525,167 dikalikan
dengan variabel konsentrasi piridostigmin bromida. Berdasarkan pengujian
didapatkan nilai R2 sebesar 0,9943 artinya 99,43% menunjukkan sinyal dari
piridostigmin bromida.
15. Review Uji Akurasi
a. Cara Kerja
Uji akurasi digunakan larutan sampel simulasi sebanyak tiga replikasi
dengan tiga konsentrasi (80, 100, 120)% masing-masing diinjeksikan
menggunakan autosampler. Pada akurasi, hasil uji tersebut kemudian
dibandingkan dengan syarat keberterimaan % recovery yang ditetapkan oleh
perusahaan, yaitu % recovery bernilai antara (98- 102)%.

Catatan :
• Tidak dijelaskan berapa kali ulangan yang dilakukan
• Tidak menjelaskan menggunakan metode simulasi

b. Pengolahan Data
Pada uji akurasi ini dilakukan sebanyak sembilan kali pengulangan. Data
kromatogram yang dihasilkan dari penyuntikan larutan sampel berupa luas area
kadar piridostigmin bromida (PB) yang diperoleh kemudian diolah secara
statistika, ditetapkan kadar hasil analisis dan dibandingan dengan kadar hasil
teoritis (FARMAKOPE INDONESIA IV, 2020).

Catatan : Lebih baik ditambahkan satuan kadar hasil analisis dan satuan kadar
teoritis
Pada uji akurasi dilakukan sebanyak sembilan kali pengulangan dengan
konsentrasi yang berbeda-beda. Data kromatogram yang dihasilkan dari
penyuntikan larutan sampel berupa luas area kadar piridostigmin bromida yang
diperoleh kemudian diolah secara statistika, ditetapkan nilai rata-rata,
simpangan baku (SB), dan persen simpangan baku relatif (%SBR) (UNITED
STATES PHARMACOPEIA, 2018). Data hasil uji akurasi diolah dengan
rumus sebagai berikut:
 Keterangan:
x̅ = nilai rerata luas area dan waktu retensi
SB = simpangan baku
SBR = simpangan baku relatif (%)
xi = nilai luas area dan waktu retensi ke-i
i = 1,2,3, ...n
n = banyak pengulangan

c. Hasil
Akurasi dapat ditetukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-
placebo recovery) atau metode penambahan standar baku (standard addition
method) (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2018). Dalam percobaan
ini akurasi dilakukan dengan metode simulasi. Dalam metode simulasi,
sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam matriks/plasebo (semua
campuran reagen kecuali analit), lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya
dibandingkan dengan kadar standar yang sebenarnya. Hasil uji akurasi dapat
dilihat pada Tabel 4 sedangkan data kromatogram dan contoh perhitungan
dapat dilihat pada Lampiran 7 dan Lampiran 8.

Tabel 4. Hasil Uji Parameter Akurasi Validasi Metode Penetapan Kadar

Piridostigmin Bromida (PB) secara HPLC

Konsentrasi Bobot
Kadar PB Kadar PB
Sampel Sampel Rerata
Teoritis Luas Area Analisis %Recovery
Simulasi PB Simulasi %Recovery
(µg/mL) (µg/mL)
(%) (mg)

60,04 201,265 2.067.082 200,490 99,61

80 60,03 201,231 2.046.366 198,522 98,65 99,13
60,03 201,231 2.055.970 199,434 99,11
60,03 251,490 2.568.822 248,160 98,68
100 60,01 251,406 2.585.056 249,703 99,32 99,98
60,01 251,406 2.654.400 256,291 101,94
60,07 302,012 3.107.844 299,373 99,13
120 60,07 302,012 3.106.859 299,279 99,10 99,07
60,05 301,912 3.102.475 298,863 98,99

Berdasarkan hasil pengujian akurasi dapat dilihat pada Tabel 4 pada

konsentrasi 80% diperoleh %recovery sebesar 99,13%; konsentrasi 100%
diperoleh sebesar 99,98% sedangkan konsentrasi 120% diperoleh sebesar
99,07%. Rentang hasil pengujian diperoleh (99,07 - 99,98)%. Hasil akurasi
pada percobaan ini memenuhi syarat keberterimaan yang telah ditetapkan oleh
PT Novell Pharmaceutical Laboratories yaitu %recovery berada pada rentang
(98- 102)%. Maka dapat disimpulkan bahwa metode penetapan kadar
piridostigmin bromida memiliki akurasi yang baik karena metode memiliki
ketepatan yang cukup baik. Akurasi menunjukkan kesalahan sistematis
(RIYANTO, 2014). Kesalahan yang terjadi yaitu ketidakstabilan dari HPLC
dan kolom menyebabkan pengujian membutuhkan waktu yang lama.
16. Review Uji Presisi (Repeatability)
a. Cara Kerja
Uji presisi digunakan larutan sampel obat jadi masing-masing diinjeksikan
menggunakan autosampler sebanyak enam kali pengulangan. Hasil uji tersebut
kemudian dibandingkan dengan syarat keberterimaan simpangan baku relatif
(SBR) yang ditetapkan oleh perusahaan, yaitu %SBR ≤ 2%.

b. Pengolahan Data
Pada uji presisi dilakukan sebanyak enam kali pengulangan pada penyuntikan
sampel obat jadi. Data kromatogram hasil penyuntikan berupa luas area kemudian
diolah secara statistika, ditetapkan nilai rata-rata, simpangan baku (SB), dan
persen simpangan baku relatif (%SBR). Data hasil uji presisi diolah dengan rumus
sebagai berikut (FARMAKOPE INDONESIA IV, 2020) :

Pada uji presisi dilakukan sebanyak enam kali pengulangan. Data

kromatogram yang dihasilkan dari penyuntikan larutan sampel berupa luas area
kadar piridostigmin bromida yang diperoleh kemudian diolah secara statistika,
ditetapkan nilai rata-rata, simpangan baku (SB), dan persen simpangan baku
relatif (%SBR) (ICH, 2006). Data hasil uji akurasi diolah dengan rumus
sebagai berikut:

Keterangan:
x̅ = nilai rerata luas area dan waktu retensi
SB = simpangan baku
SBR = simpangan baku relatif (%)
xi = nilai luas area dan waktu retensi ke-i
i = 1,2,3, …n
n = banyak pengulangan

Catatan : Pemborosan kalimat , pada paragraph sebelumnya sudah dijelaskan

berapa kali pengulangan.
c. Hasil
Pada uji presisi dilakukan pada sampel obat jadi dengan cara
menyuntikkan sampel dengan enam replikasi sebanyak masing-masing satu
kali. Hasil repeatability ditentukan dari nilai %recovery yang didapat Hasil uji
presisi dapat dilihat pada Tabel 5, sedangkan data kromatogram dan contoh
perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 9 dan Lampiran 10.
Tabel 5. Hasil Uji Presisi Metode Penetapan Kadar Piridostigmin Bromida
(PB) secara High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kadar PB Kadar PB
Penimbangan
Ulangan Luas Area Teoritis Analisis %Recovery
(mg)
(µg/mL) (µg/mL)

1 61,20 2.727.531 250,034 263,239 105,28

2 61,26 2.701.549 250,279 260,771 104,19
3 61,22 2.701.885 250,116 260,803 104,27
4 61,20 2.728.284 250,034 263,311 105,31
5 61,26 2.728.328 250,279 263,315 105,21
6 61,27 2.728.374 250,320 263,319 105,19
Rerata 104,91
SB 0,53
%SBR 0,50

Berdasarkan pengujian presisi dapat dilihat pada Tabel 5 diperoleh rerata

%recovery sebesar 104,91% dengan nilai %SBR sebesar 0,50%, maka artinya
hasil tersebut memenuhi syarat keberterimaan yang ditetapkan oleh PT Novell
Pharmaceutical Laboratories yaitu %SBR ≤ 2,0%. Perbedaan hasil yang
diperoleh dari pengulangan penetapan kadar piridostigmin bromida dapat
disebabkan oleh kesalahan yang terjadi tanpa disengaja dalam setiap
pelaksanaan pengujian. Hal yang menunjukan adanya kesalahan acak
(RIYANTO, 2014). Kesalahan yang terjadi seperti kondisi ruang timbang
yang fluktuasi sehingga menyebabkan neraca tidak stabil.
17. Review Presisi Antara
a. Cara Kerja
Presisi Antara dilakukan pada hari yang berbeda oleh analis yang berbeda.
Presisi antara dilakukan dengan menginjeksikan larutan standar linearitas
piridostigmin bromida pada lima konsentrasi (80, 90, 100, 110, 120)% masing-
masing sebanyak satu kali penginjeksian, sampel simulasi dengan konsentrasi
(80, 100, 120)% sebanyak tiga kali pengulangan masing-masing dilakukan satu
kali penginjeksian. Hasil uji tersebut menghasilkan data koefisien korelasi,
%recovery dan nilai %relatif deviasi gabungan. Syarat keberterimaan %relatif
deviasi yang ditetapkan oleh perusahaan yaitu %relatif deviasi gabungan ≤ 5%.

Catatan :
• Sebaiknya ditulis %relatif deviasi gabungan
• Tidak dijelaskan berapa kali ulangan yang dilakukan

b. Pengolahan Data
Pada presisi antara dilakukan oleh analis yang berbeda pada hari yang berbeda.
Larutan standar dengan konsentrasi 100% diinjeksikan sebanya enam kali,
larutan linearitas dengan lima konsentrasi diinjeksikan masing-masing
sebanyak satu kali dan penginjeksian sampel simulasi (80,100,120)% dengan
masing-masing pengulangan sebanyak tiga kali dan penyuntikan masing-
masing satu kali. Data kromatogram yang dihasilkan berupa luas area yang
akan diolah secara statistika, nilai koefisien korelasi (r), %recovery, nilai
rerata, simpangan baku (SB), %simpangan baku relative (%SBR) (ICH, 2006).
Data hasil uji presisi antara diolah dengan rumus berikut :

Keterangan:
x̅ = nilai rerata luas area dan waktu retensi
SB = simpangan baku
SBR = simpangan baku relatif (%)
xi = nilai luas area dan waktu retensi ke-i
i = 1,2,3, …n
n = banyak pengulangan
 Keterangan:
Y = Luas area peak zat aktif pada kromatogram larutan sampel
x = Kadar zat aktif pada larutan sampel
b = Slope kurva regresi linear`
a = Intersep kurva regresi linear

Catatan :
• Terdapat kesalahan penulisan seharusnya “sebanyak”
• Lima konsentrasi seharusnya dijelaskan konsentrasi berapa saja
• Di rumus % Recovery yang bisa dimasukan satuan kadar dan satuan di
keterangan

c. Hasil
Hasil pengujian presisi antara dapat dilihat pada Tabel 6, sedangkan data
kromatogram dan hasil perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 11 dan Lampiran
12.
Presisi antara merupakan presisi yang diperoleh dari pengukuran ulangan
yang dilakukan di laboratorium dalam kondisi yang lebih bervariasi (RIYANTO,
2004). Berdasarkan Tabel 6, diperoleh nilai %relatif deviasi gabungan oleh analis
1 dan analis 2 sebesar 0,021% artinya, telah memenuhi syarat keberterimaan yang
ditetapkan oleh PT Novell Pharmaceutical Laboratories yaitu %relatif deviasi
gabungan ≤ 5%. Berdasarkan hasil analisis yang dilakukan oleh analis 1 dan analis
2, hasil memiliki tingkat kesesuaian yang tinggi antara hasil individual dengan
hasil rata-rata pengukuran yang dilakukan secara berulang. Hasil tersebut dapat
disimpulkan bahwa penetapan kadar piridostigmin bromida memberikan presisi
yang memenuhi syarat.
Tabel 6. Hasil Pengujian Presisi Antara terhadap Dua Analis
Penetapan KadarPiridostigmin Bromida secara HPLC
%Recovery
Konsentrasi Sampel Hari 1 Hari 2
SimulasiPiridostigmin
Bromida (%) Analis 1 Analis 2

99,61 100,68
80 98,65 100,08
99,11 99,51
98,68 99,12
100 99,32 99,15
101,94 98,39
99,13 98,20
120 99,10 100,80
98,99 98,79

Rerata 99,39 99,41

SB 1,001 0,937
%SBR 1,01 0,94
%Relatif Deviasi 0,021
Gabungan
18. Review Uji Stabilitas Larutan
a. Cara Kerja
Uji stabilitas larutan adalah uji yang dilakukan untuk mengukur kestabilan
suatu larutan standar dan sampel selama waktu analisis. Uji stabilitas dilakukan
dengan menginjeksikan larutan deret standar dan larutan sampel simulasi
piridostigmin bromida dengan konsentrasi 100% pada awal analisis jam ke-0,
jam ke-2, jam ke-6, jam ke-8, jam ke-10, jam ke-12, jam ke-16, jam ke-20, dan
jam ke-24. Data hasil stabilitas yang didapatkan dihitung %relatif deviasi.
Hasil uji tersebut kemudian dibandingkan dengan syarat keberterimaan %bias
yang ditetapkan oleh perusahaan yaitu %bias ≤ 2%.

Catatan : Tidak disebutkan berapa kali ulangan yang dilakukan

b. Pengolahan Data
Pada uji stabilitas dilakukan dengan penyuntikan sebanyak enam kali pada
larutan deret standar piridostigmin bromida dengan konsentrasi 100%. Dari
hasil kromatogram berupa luas area yang akan diolah secara statistika,
ditetapkan nilai relatif deviasi (ICH, 2006). Data hasil uji stabilitas larutan
diolah dengan rumus sebagai berikut :

c. Hasil
Hasil uji stabilitas larutan standar terhadap waktu injeksi dapat dilihat pada
Tabel 7 sedangkan data kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 13 dan
contoh perhitungan pada Lampiran 14.
Tabel 7. Hasil Uji Stabilitas terhadap Waktu Injeksi Piridostigmin Bromida
pada Larutan Standar 100%
Kadar Analisis
Waktu (Jam) Luas Area Piridostigmin %Bias
Bromida (µg/mL)
0 2.656.707 256,510 0,0000
2 2.657.726 256,607 0,0384
4 2.653.472 256,203 0,1218
6 2.664.657 257,266 0,2992
8 2.676.901 258,429 0,7601
10 2.679.023 258,631 0,8400
12 2.683.360 259,046 1,0032
16 2.692.353 259,897 1,3417
20 2.656.256 256,467 0,0170
24 2.674.883 258,237 0,6842

0,6842 (pada jam

%Bias
ke-24)
 Berdasarkan hasil uji stabilitas dapat dilihat pada tabel 7 bahwa %bias
yang dihasilkan oleh larutan standar piridostigmin bromida pada jam ke -2, ke-
4, ke-6, ke-8, ke-10, ke-12, ke-16, ke-20, ke-24 sebesar 0,6842% sehingga
memenuhi syarat yang ditetapkan oleh PT Novell Pharmaceutical Laboratories
yaitu %bias ≤ 2% sehingga dapat disimpulkan bahwa larutan standar stabil saat
analisis hingga 24 jam.

Gambar 4. Grafik Hubungan antara Jam Injeksi dengan Kadar Larutan Standar
Piridostigmin Bromida
Berdasarkan hasil uji stabilitas standar dengan konsentrasi 100% dapat dilihat
pada Gambar 4 bahwa kadar piridostigmin bromida memiliki kadar yang
fluktuatif. Berdasarkan hasil uji stabilitas tersebut diketahui bahwa analit
piridostigmin bromida dalam matriks tablet salut selaput tidak mengalami
degradasi melebihi dari batas yang ditentukan. Hal ini dapat disebabkan oleh
ketidakstabilan fase gerak, ketidakstabilan suhu maupun larutan standar.
Berdasarkan hasil uji stabilitas tersebut diketahui bahwa analit piridostigmin
bromida dalam matriks tablet salut selaput tidak mengalami degradasi melebihi
dari batas yang ditentukan dapat dilihat pada Tabel 8.
Berdasarkan hasil uji stabilitas pada larutan sampel dengan konsentrasi 100%
dapat dilihat pada Tabel 8 bahwa %bias yang dihasilkan oleh larutan sampel
piridostigmin bromida pada jam ke -2, ke-4, ke-6, ke-8, ke-10, ke-12, ke-16, ke20,
ke-24 sebesar 1,1759% sehingga memenuhi syarat yang ditetapkan oleh PT Novell
Pharmaceutical Laboratories yaitu %bias ≤ 2% sehingga dapat disimpulkan bahwa
larutan sampel stabil saat analisis hingga 24 jam.
Tabel 8. Hasil Uji Stabilitas terhadap Waktu Injeksi Piridostigmin Bromida
pada Larutan Sampel 100%
Kadar Analisis
Waktu (Jam) Luas Area Piridostigmin %Bias
Bromida (µg/mL)
0 2.652.566 256,117 0,0000
2 2.675.670 258,312 0,8710
4 2.655.311 256,378 0,1035
6 2.669.344 257,711 0,6325
8 2.675.204 258,268 0,8534
10 2.684.484 259,149 1,2033
12 2.682.073 258,920 1,1124
16 2.695.484 260,195 1,6180
20 2.678.100 258,543 0,9626
24 2.683.757 259,080 1,1759

1,1759 (pada jam

%Bias
ke-24)

Data kromatogram dan contoh hasil perhitungan uji stabilitas larutan standar
dengan konsentrasi 100% dapat dilihat pada Lampiran 13.

Gambar 5. Grafik Hubungan antara Jam Injeksi dengan Kadar Larutan Sampel
Piridostigmin Bromida
Berdasarkan hasil uji stabilitas pada larutan sampel piridostigmin bromida
dapat dilihat dapa Gambar 5 bahwa kadar piridostigmin bromida memiliki
kadar yang fluktuatif. Hal ini dapat disebabkan oleh ketidakstabilan fase gerak,
ketidakstabilan suhu maupun larutan sampel. Namun hal ini masih memenuhi
syarat keberterimaan yang ditetapkan oleh perusahaan yaitu %bias ≤ 2%
sehingga uji stabilitas pada parameter validasi metode penetapan kadar
piridostigmin bromida dianggap memenuhi spesifikasi yang ditetapkan. Data
kromatogram dan contoh hasil perhitungan uji stabilitas larutan sampel dengan
konsentrasi 100% dapat dilihat pada Lampiran 14.
Catatan :
• Hasil ke-24 sebesar 1,1759% tidak ada diperhitungan lampiran
• Terdapat kesalahan penulisan seharusnya “dapat”

Catatan : Perhitungan di Lampiran 14 bisa dicantumkan sampai jam ke-24 tidak

hanya sampai jam ke-2
19. Review Uji Ketegaran (Robustness)
a. Cara Kerja
Uji ketegaran dilakukan dengan cara membandingkan variabel laju alir
yang ada dalam metode analisis yaitu laju alir 2,0 mL/menit menjadi 1,8
mL/menit. Larutan standar linearitas piridostigmin bromida pada lima
konsentrasi (80, 90, 100, 110, 120)% dengan masing-masing satu kali
pengulangan diinjeksikan dengan autosampler, dan sampel simulasi pada
konsentrasi (80, 100, 120)% dengan tiga kali pengulangan diinjeksikan
sebanyak satu kali. Uji ketegaran dilanjutkan dengan perhitungan statistika
yaitu uji T dan uji F.

b. Pengolahan Data
Pada uji ketegaran dilakukan dengan menyuntikan larutan standar
piridostigmin bromida dengan lima konsentrasi masing-masing sebanyak satu kali
dan penyuntikan sampel simulasi dengan konsentrasi (80,100,120)% dengan
masing-masing pengulangan sebanyak tiga kali pengulangan sebanyak satu kali
(ICH, 2006). Data kromatogram yang dihasilkan berupa luas area yang akan
diolah secara statistika, ditetapkan nilai konsentrasi hasil analisis dan
dibandingkan dengan laju alir sebelum modifikasi menggunakan uji F dan uji t
(SUGIYONO, 2006).
• Hipotesis uji F penetapan kadar piridostigmin bromida dengan laju alir fase
gerak 1,8 mL/menit dan 2,0 mL/menit :
H0: σ12 = σ22 (ragam kadar piridostigmin bromida dengan laju alir fase gerak 1,8
mL/menit tidak berbeda nyata dengan ragam kadar piridostigmin bromida
dengan laju alir 2,0 mL/menit).
H1: σ12 ≠ σ22 (ragam kadar piridostigmin bromida dengan laju alir fase gerak 1,8
mL/menit berbeda nyata dengan ragam kadar piridostigmin bromida dengan
laju alir 2,0 mL/menit).

• Statistik Hitung :

• Keterangan :
SB1 : simpangan baku kadar piridostigmin bromida laju alir 2,0 mL/menit
SB2 : simpangan baku kadar piridostigmin bromida laju alir 1,8 mL/menit
ɑ : taraf nyata ; α = 5%
db1 : derajat bebas kelompok data laju alir 2,0 mL/menit
db2 : derajat bebas kelompok data laju alir 1,8 mL/menit
db1 : n1-1
db2 : n2-1

• Simpulan uji F penetapan kadar piridostigmin bromida dengan laju alir fase
gerak 1,8 mL/menit dan 2,0 mL/menit :
Jika F hitung < F tabel maka terima H0, artinya ragam kadar piridostigmin
bromida dengan laju alir 1,8 mL/menit tidak berbeda nyata dengan ragam kadar
kadar piridostigmin bromida dengan laju alir fase gerak 2,0 mL/menit.
 Jika F hitung > F tabel maka tolak H0, artinya artinya ragam kadar piridostigmin
bromida dengan laju alir 1,8 mL/menit berbeda nyata dengan ragam kadar
piridostigmin bromida dengan laju alir fasa gerak 2,0 mL/menit.

• Uji t digunakan untuk mengetahui perubahan laju alir fase gerak 1,8 mL/menit
menjadi 2,0 mL/menit berpengaruh secara signifikan atau tidak terhadap kadar
kadar piridostigmin bromida dalam tablet. Hal tesebut dapat dilihat dari
hipotesis sebagai berikut :

• Hipotesis uji t penetapan kadar piridostigmin bromida dengan laju alir fase
gerak 1,8 mL/menit dan 2,0 mL/menit :
H0: μ12 = μ22 (perubahan laju alir fase gerak 1,8 mL/menit dan 2,0 mL/menit
tidak berpengaruh secara signifikan terhadap kadar piridostigmin bromida
dalam tablet)
H1: μ12 ≠ μ22 (perubahan laju alir fase gerak 1,8 mL/menit dan 2,0 mL/menit
berpengaruh secara signifikan terhadap kadar kadar piridostigmin bromida
dalam tablet). Jika ragam populasi tidak berbeda nyata, maka:

• Statistik hitung :

• Jika ragam populasi berbeda nyata, maka :

• Kesimpulan :
Jika t hitung < t tabel, maka terima H0, artinya rataan kedua perlakuan
tidak berbeda nyata.
Jika t hitung > t tabel, maka terima H1, artinya rataan kedua perlakuan
berbeda nyata.

• Keterangan :
n = banyaknya ulangan
 = ragam populasi
μ = rataan populasi
 = taraf nyata
 db = derajat bebas
x̅1 = kadar rata-rata kadar piridostigmin bromida dengan laju alir fase gerak
1,8 mL/menit
x̅2 = kadar rata-rata kadar piridostigmin bromida dengan laju alir fase gerak
2,0 mL/menit
S gab = simpangan baku gabungan (%)

c. Hasil
Pada uji ketegaran tersebut dilakukan dengan cara mengubah variabel laju
alir yang digunakan di dalam analisis sehingga menyebabkan perubahan waktu
retensi pada zat aktif. Laju alir yang lebih kecil (1,8 mL/menit) memiliki waktu
retensi yang semakin lambat dikarenakan interaksi yang terjadi lebih lambat.
(PUTRIYANI, 2011). Berdasarkan hasil uji ketegaran setelah digunakan
pengolahan data secara statistik dengan uji F dan uji t, didapatkan ragam hasil
konsentrasi piridostigmin bromida untuk laju alir 1,8 mL/menit tidak berbeda
nyata terhadap kedua perubahan kondisi yang dilakukan karena memiliki F
hitung untuk konsentrasi berturut-turut (80, 100, 120)% yaitu (4,20; 1,08; 1,84)
lebih kecil dari F tabel yaitu 39,00. Berdasarkan uji t didapatkan rata-rata hasil
konsentrasi piridostigmin bromida tidak berbeda nyata terhadap kedua
perubahan karena memiliki t hitung untuk konsentrasi berturut-turut (80, 100,
120)% yaitu (2,855; 1,510; 0,353) lebih kecil dari t tabel yaitu 3,747.
Berdasarkan hasil uji f dan uji t dapat dikatakan bahwa perubahan kondisi laju
alir fasa gerak pada HPLC dari kondisi normal 2,0 mL/menit menjadi 1,8
mL/menit tidak memberikan pengaruh pada hasil analisis.
Tabel 9. Hasil Uji Ketegaran Validasi Metode Penetapan Kadar Piridostigmin
Bromida secara HPLC

Ulangan Laju Alir 1,8 mL/menit Laju Alir 2,0 mL/menit

Konsentrasi Piridostigmin Konsentrasi Piridostigmin
Bromida (%) Bromida (%)
80 100 120 80 100 120
1 198,37 246,77 296,66 200,17 249,15 296,34
2 199,23 248,42 302,53 201,32 249,28 304,12
3 198,44 246,68 298,43 201,57 247,45 298,11
Rerata 198,68 247,29 299,21 201,35 248,62 299,52
SD 0,47 0,98 3,01 1,20 1,02 4,08
F Hitung 6,36 1,08 1,84
F Tabel 39,00
Kesimpulan
uji F TBN Syarat Keberterimaan:
t Hitung 3,599 1,630 0,106 F hitung < F tabel |
t Tabel 3,747 t hitung| < t tabel
Kesimpulan
uji T TBN

Keterangan: TBN = Tidak Berbeda Nyata

20. Simpulan
Berdasarkan hasil validasi metode penetapan kadar piridostigmin bromida
dalam tablet salut selaput secara High Performance Liquid Chromatography
dengan parameter uji kesesuaian sistem (UKS), uji selektivitas, uji linearitas,
akurasi, presisi (repeatability), presisi antara, uji stabilitas dan ketegaran
(robustness) dapat disimpulkan bahwa semua parameter memenuhi syarat
keberterimaan yang ditetapkan oleh PT Novell Pharmaceutical Laboratories yang
mengacu pada protokol perusahaan (validation master plan). Dengan demikian,
metode penetapan kadar piridostigmin bromide dengan laju alir 2,0 mL/menit
dinyatakan valid dan dapat digunakan untuk analisis rutin di PT Novell
Pharmaceutical Laboratories.

Catatan : Modifikasi menggunakan laju alir 1,8 mL/menit karena percobaan ini
bertujuan untuk memastikan bahwa metode analisis kadar piridostigmin bromida
dalam tablet salut selaput dengan modifikasi variabel laju alir dari volume 2,0
mL/menit menjadi 1,8 mL/menit dapat memberikan data yang handal. Hasil
percobaan kemudian dibandingkan dengan syarat keberterimaan PT Novell
Pharmaceutical Laboratories yaitu protokol perusahaan (Validation Master Plan)
sehingga dapat digunakan dalam analisis rutin.

21. Saran
Pada pengujian dapat dilakukan pada laju alir yang berbeda dan data
diolah secara statistika untuk memastikan tetap memenuhi syarat keberterimaan.
Catatan : Pada pengujian ini alangkah lebih baiknya dilengkapi dengan
estimasi ketidakpastian, pembuatan fishbone, LoD, LoQ, MDL, konfirmasi
identitas.