Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

LEMBAR KERJA PRAKTIKUM

Konsultasi

Konsultasi

Konsultasi

Konsultasi

ke-1*)

ke-2*)

ke-3*)

ke-4*)

Lulus /

Lulus /

Lulus /

Lulus /

Gagal
Lulus /

Gagal
Lulus /

Gagal
Lulus /

Gagal
Lulus /

Gagal
Lulus /

Gagal
Lulus /

Gagal
Lulus /

Gagal
Lulus /

Gagal
Gagal
pengamatan
Nilai Pre-test
100
90
Keterangan : *) lingkari salah satu pilihan yang sesuai
** )lingkari salah satu nilai terakhir waktu konsultasi

Gagal
80

Gagal
60

Penilaian Pre-test

Pemahaman teori

Kesesuaian skema kerja

Kesesuaian form data

Nilai
Laporan
Akhir

ANALISIS PIRENOXINE DAN PENGAWET PARABEN DENGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

KELOMPOK 2
Alim Wijaya

G1F014039

Bina Maraya L

G1F014051

Raras Ravenisa

G1F014055

Rizki Amalia H

G1F014059

Laksmi Ayu K

G1F014067

ASISTEN PRAKTIKUM
DOSEN JAGA PRAKTIKUM
Hendri Wasito, M.Sc.,Apt
LABORATORIUM KIMIA FARMASI
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS ILMU-ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
Page 1 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

2016

Page 2 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

SKEMA KERJA
1. Pembuatan Larutan Standar dan Sampel serta Larutan Fase Gerak
Larutan Standar
a. Larutan standar Pirenoxine Sodium
Larutan Standar Pirenoxine Sodium
- Disiapkan secara terpisah dan ditimbang secara akurat
- Diencerkan masing-masing larutan dengan asetonitril 25% hingga
didapatkan konsentrasi 1,0-20,0 g/ml
- Disaring menggunakan nilon syringe filter 0,22 m
- Di degassing dalam sonikator 1 menit sebelum diinjeksikan ke dalam
instrument KCKT
Hasil
b. Larutan Standar Methylparaben
Larutan Standar Methylparaben
- Disiapkan secara terpisah dan ditimbang secara akurat
- Diencerkan masing-masing larutan dengan asetonitril 25% hingga
konsentrasi 5,0-150g/ml
- Disaring menggunakan nilon syringe filter 0,22 m
- Di degassing dalam sonikator 1 menit sebelum diinjeksikan ke dalam
instrument KCKT
Hasil
c. Larutan standar Propylparaben
Larutan Standar Propylparaben
- Disiapkan secara terpisah dan ditimbang secara akurat
- Diencerkan masing-masing larutan dengan asetonitril 25% hingga
konsentrasi 1,0-75,0 g/ml
- Disaring menggunakan nilon syringe filter 0,22 m
- Di degassing dalam sonikator 1 menit sebelum diinjeksikan ke dalam
instrument KCKT
Hasil

Larutan Sampel
Larutan Sampel Pirenoxine dan Pengawet Paraben
-

Disiapkan dan diambil sebanyak 2,0 mL ke dalam labu ukur 10 mL

Dilarutkan dengan asetonitril 25% hingga tanda batas
Disaring menggunakan nilon syringe filter 0,22 m
Di degassing dalam sonikator 1 menit sebelum diinjeksikan ke dalam
instrument KCKT

Hasil

Larutan Fase Gerak

Larutan Asetonitril dan TBAH 5% dalam Deionize Water
Page 3 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

Diatur pH 6,0 dengan phosphoric acid

Disaring filter nilon 0,22 m dengan mobile phase filter apparatus
Di degassing dengan sonicator waterbath selama 30 menit
Ditunggu hingga dingin dan fase gerak dapat digunakan pada KCKT

Hasil
2. Persiapan, Pencucian Dan Pengkondisian Fase Gerak/Kolom KCKT
Fase Gerak yang telah disaring dan didegasing
- Dialirkan fase gerak asetonitril 100% (v/v) dalam kolom dengan laju 1
ml/mnt selama 90 menit
- Dialirkan asetonitril 50% (v/v) selama 30 menit
- Dialirkan deionize water selama 90 menit
- Dikondisikan kolom KCKT dengan fase gerak pencucian selanjutnya selama
120 menit
- Dilanjutkan pencucian kembali dengan urutan terbalik dimulai dari deionize
water, asetonitril 50% dan asetonitril 100% dengan waktu yang sesuai
sebelumnya
3. Pembuatan Hasil
Kurva Kalibrasi Standar dan pengukuran sampel
Larutan standar

Larutan Sampel

Disiapkan dan diinjeksikan kedalam sistem KCKT

Direplikasi 3 kali pada larutan sampel
Diamati dan dibuat kurva kalibrasi

Hasil

Page 4 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

FORM DATA PENGAMATAN

Metode Analisis

: Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Bahan Sampel

: Obat tetes mata

1. Data Sifat fisika-kimia

Sifat Fisika-Kimia
Bentuk
Rumus Molekul
Berat Molekul
Titik Lebur
Ph
Kelarutan

Pirenoxine
Sodium
Serbuk oranye
C16H7N2NaO5
330,2
247-248 o C
5.7-6.7
Mudah
larut
dalam air; etanol
95% dan tidak
larut
dalam
kloroform P dan
dalam eter P

Methylparaben

Propylparaben

Serbuk hablur putih

C8H8O3
152,15
125-128 o C
6-9
Larut dalam 500
bagian air; 20
bagian air panas;
3,5 bagian etanol; 3
bagian
aseton;
mudah larut dalam
eter P dan dalam
larutan
alkali
hidroksida

Serbuk hablur putih

C10H12O3
180,21
95-98 o C
6.5-7.0
Sangat sukar larut
dalam air; larut
dalam 3,5 bagian
etanol (95%) P;
dalam 3 bagian
aseton P; mudah
larut dalam larutan
alkali hidroksida

2. Data Optimasi KCKT

Instrument
Data Processing
Column
Mobile Phase
Flow Rate
Detector
Column Temperature
Injection Volume

HPLC Thermo Separation Spectra System

Clarity
Symmetry C-8 (150 x 4.6 mm i.d., 5 m)
5 % TBAH in DI Water, pH 6.0 and acetonitrile (50:50,
v/v)
1.0 mL/min
UV 240 nm
Room temperature
5,0 L

3. Data AUC dan Waktu retensi :

Standar pineroxine sodium

Konsentrasi
(g/ml)
1,06
5,3
10,6
Page 5 of 12

Waktu retensi
(menit)
2,032
2,032
2,032

AUC
(mv.s)
12,422
105,759
234,422

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

Standar methyl paraben

Standar propyl paraben

Sampel 1
Pirenoxine sodium
Methyl paraben
Propyl paraben
Sampel 2
Pirenoxine sodium
Methylparaben
Propylparaben
Sampel 3
Pirenoxine sodium
Methylparaben
Propylparaben

15,9
21,2

2,032
2,032

370,035
503,971

5,19
25,95
51,9
77,85
103,8

2,748
2,748
2,748
2,748
2,748

49,27567
259,433
537,238
816,93
1084,31

5,2
10,4
20,8
26
52

4,516
4,516
4,516
4,516
4,516

26,11
64,884
132,94
167,636
343,569

Waktu retensi
(menit)

AUC
(mv.s)

Konsentrasi
(g/ml)

2,036
2,748
4,512

251,732
418,3
129,993

55,366
202,546
101,782

2,036
2,748
4,512

262,713
414,4
130,304

57,604
200,698
102,012

2,036
2,748
4,152

252,301
413,218
128,704

55,482
201,127
100,827

Penentuan kurva kalibrasi standar

Page 6 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

kurva standar sodium pirenoxine

600
500

f(x) = 24.54x - 20.02

R = 1

400
Luas Puncak

300
200
100
0
0

10

15

20

25

konsentrasi

Kurva standar methylparaben

1200
1000

f(x) = 10.55x - 9.07

R = 1

800
Luas puncak

600
400
200
0
0

20 40 60 80 100 120
konsentrasi

kurva standar prophylparaben

400
f(x) = 6.75x - 7.41
R = 1

300
luas puncak

200
100
0
0

10

20

30

40

50

60

konsentrasi

Page 7 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

Gambar 1 : Profil kromatogram larutan standar

Gambar 2 : Profil kromatogram hasil analisis sediaan tetes mata pirenoxine yang
mengandung pengawet paraben

Persamaan regresi linier standar sodium pirenoxine:

Y = 24,541x 20,018
R2 = 0,999
ya
Perhitungan kadar sampel: X (g/ml) b fp

Sampel sodium pirenoxine

1. Kadar replikasi
pertama (g/ml)

251,732+20,018
5
24,541

= 55,366 g/ml
262,713+20,018
2. Kadar replikasi kedua

5
24,541
(g/ml)
= 57,604 g/ml
3. Kadar replikasi ketiga
(g/ml)

252,301+20,018
5
24,541

= 55,482 g/ml
Page 8 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

Rata-rata

= 56,151 g/ml

Persamaan regresi linier standar methylparaben:

Y = 10,55x 9,0731
R2 = 0,9999
ya
Perhitungan kadar sampel: X (g/ml) b fp

Sampel methylparaben
1. Kadar replikasi
pertama (g/ml)

418,3+9,0731
5
10,55

2. Kadar replikasi kedua

(g/ml)

= 202,546 g/ml
414,4+9,0731

5
10,55

3. Kadar replikasi ketiga

(g/ml)

= 200,698 g/ml
413,218+9,0731

5
10,55

Rata-rata

= 200,138 g/ml
= 201,127 g/ml

Persamaan regresi linier prophylparaben:

Y = 6,7499x 7,4101
R2 = 0,999
ya
Perhitungan kadar sampel: X (g/ml) b fp

Sampel prophylparaben
1. Kadar replikasi
pertama (g/ml)

129,993+7,4101
5
6,7499

2. Kadar replikasi kedua

(g/ml)

= 101,782 g/ml
130,304 +7,4101

5
6,7499

3. Kadar replikasi ketiga

(g/ml)

= 102,012 g/ml
128,704 +7,4101

5
6,7499

Page 9 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

= 100,827 g/ml
Rata-rata

Page 10 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

Pembahasan
Pada praktikum ini dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa Pirenoxine
dan pengawet paraben dalam sediaan tetes mata dengan metode Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi(KCKT)/ High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Metode ini didasarkan
pada perbedaan kecepatan migrasi solut yang dipengaruhi oleh perbedaan afinitas solut
terhadap fase gerak dan fase diam (Gandjar dan Rohman,2007). Jika ditinjau dari polaritas
fase gerak dan fase diam kromatografi dikelompokkan menjadi 2 yaitu : Kromatografi fase
normal dimana fase diam lebih polar dibandingkan dengan fase geraknya dan Kromatografi
partisi fase terbalik yang tentunya kebalikan dari kromatografi fase normal (Soebagio, 2000).
Dalam praktikum ini digunakan instrumen HPLC dengan jenis kolom
reverse phase. Kolom reverse phase kolom yang fase diamnya bersifat nonpolar sedangkan
fase geraknya bersifat polar. Fase diam nonpolar yang paling banyak digunakan adalah jenis
C18, C8, dan C2 (Mulja dan Suharman, 1995), dan pada praktikum digunakan fase diam C8.
Sedangkan fase gerak yang digunakan terdiri dari campuran asetonitril dan TBAH dalam
deionize water. Dalam system fase gerak ini digunakan tertrabutil ammonium hidroksida
yang berfungsi sebagai ion-pairing agent yang berfungsi untuk memperbaiki bentuk puncak
(Wasito dan Chutima, 2014). Tetrabutilamonium hidroksida akan melapisi fase diam
mengakibatkan lapisan fase diam bermuatan positif. Senyawa pineroxine pada pH tinggi
akan terionisasi menghasilkan ion pirenoxine yang bermuatan negatif. Ion yang
bermuatan negatif akan tertarik pada lapisan fase diam yang bermuatan positif
akibatnya senyawa akan lebih lama tertahan dalam kolom (Harahap et al, 2012).
Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan kualitatif. Untuk analisis
kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram baku
pembanding berdasarkan waktu retensinya. Data waktu retensi khas tetapi tidak spesifik
artinya terdapat lebih dari satu komponen zat yang mempunyai waktu retensi yang
sama(Gandjar dan Rohman,2007). Pada praktikum ini didapatkan waktu retensi standar
pirenoxine; methylparaben dan propylparaben berturut-turut adalah 2,032; 2,748; dan 4,516
dengan waktu retensi sampel pirenoxine; methylparaben dan propylparaben berturut-turut
adalah 2,036; 2,748; dan 4,512. Hal ini menunjukkan tidak adaperbedaan signifikan antara
waktu retensi sampel dengan waktu retensi standar.
Untuk analisis kuantitatif, penetapan kadar Pineroxine dan pengawet paraben dalam
sediaan obat tetes mata dibuat 3 buah sampel dengan masing-masing dilakukan 3 kali
replikasi. Berdasarkan data pengamatan, didapatkan kadar rata-rata sampel sodium
pirenoxine; methylparaben; dan propylparaben berturut-turut adalah 56,151 g/ml; 201,127
g/ml; 101,54 g/ml.

Kesimpulan
Analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa Pirenoxine dan pengawet paraben dalam
sediaan tetes mata dapat dilakukan dengan metode Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi(KCKT)/ High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Hasil analisis kualitatif
didapatkan waktu retensi standar pirenoxine; methylparaben dan propylparaben berturut-turut
Page 11 of 12

Lembar Kerja Praktikum Kimia Analisis Instrumen 2016

adalah 2,032; 2,748; dan 4,516 dengan waktu retensi sampel pirenoxine; methylparaben dan
propylparaben berturut-turut adalah 2,036; 2,748; dan 4,512. Sedangkan untuk analisis
kuantitatif, didapatkan kadar rata-rata sampel sodium pirenoxine; methylparaben; dan
propylparaben berturut-turut adalah 56,151 g/ml; 201,127 g/ml; 101,54 g/ml.

Referensi
Gandjar, I. G., dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Cetakan II. Yogyakarta:
Pustaka pelajar.
Soebagio, dkk, 2000, Kimia Analitik II. JICA, Malang.
Mulja, M., Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Air Langga, Surabaya.
Wasito, Hendri dan Chutima M., 2014. Development And Validation Of High Performance
Liquid Chromatographic Method For Quantitation Of Pirenoxine In Ophthalmic
Solution. The 2nd Nong Khai Campus International Conference.
Harahap et al. 2012. Optimasi Dan Validasi Metode Analisis Asam Nikotinat Serta Stabilitas
Inositol Heksanikotinat. Jurnal Farmasi Indonesia. Vol 6(1): 13-20.

Page 12 of 12