PENGGUNAAN HIGH PEFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

(HPLC) DALAM ANALISA KADAR CAPSAICIN DARI SAMPEL

BONCABE (BPOM RI MD:255631002021)
Tami Diyah Nurani
Laboratorium Analisis Fisikokimia, Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran

1. PENDAHULUAN
Kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) merupakan sistem pemisahan
dengan kecepatan dan efisiensi yang
tinggi. Hal ini karena didukung oleh
kemajuan dalam teknologi kolom,
sistem pompa tekanan tinggi, dan
detektor yang sangat sensitif dan
beragam. KCKT mampu menganalisa
berbagai cuplikan secara kualitatif
maupun kuantitatif, baik dalam
komponen
tunggal
maupun
campuran. KCKT merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian
senyawa tertentu dalam suatu sampel
pada sejumlah bidang antara lain;
farmasi, lingkungan dan industriindustri makanan (Putra, 2004:8).
KCKT paling sering digunakan
untuk: menetapkan kadar senyawasenyawa tertentu seperti asam-asam
amino, asam-asam nukleat dan
protein-protein
dalam
cairan
fisiologis,
menentukan
kadar
senyawa-senyawa aktif obat dan lainlain. Beberapa senyawa organik yang
mudah
terurai
(labil)
pada pemanasan dapat dianalisis
dengan cara kromatografi cairan
kinerja tinggi atau HPLC karena HPLC
dilakukan pada suhu kamar. Selain

senyawa organic teknik HPLC juga

dapat
menganalisis
senyawa
anorganik,
cuplikan
yang
mempunyai berat molekul tinggi atau
titik didihnya tinggi seperti polimer
(Clark, 2007).
Prinsip kerja HPLC adalah
sebagai berikut dengan bantuan
pompa, fasa gerak cair dialirkan
melalui kolom ke detektor, cuplikan
dimasukkan ke dalam fasa gerak
dengan penyuntikan. Didalam kolom
terjadi
pemisahan
kompenenkomponen
campuran
karena
perbedaan kekuatan interaksi antara
solut-solut terhadap fasa diam. Solutsolut yang kurang kuat interaksinya
dengan fasa diam akan keluar dari
kolom terlebih dahulu, sebaliknya
solut-solut yang kuat interaksinya
dengan fasa diam akan keluar dari
kolom lebih lama. Setiap komponen
campuran yang keluar dideteksi oleh
detector kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram. Kromatogram
HPLC serupa dengan kromatogram
gas (Hendayana, 2006:69).
Capsaicin (8 metil N vanilil
6
nonenamida)
merupakan
komponen
aktif
cabai
yang
menghasilkan panas dalam cabai.

Capsaicin bersifat iritan terhadap

mamalia termasuk manusia, dan
menimbulkan rasa terbakar dan
panas pada jaringan manapun yang
tersentuh (Barbero et al, 2010).
Capsaicin mempunyai nilai ekonomis
yang tinggi pada bidang farmasi.
Semakin tinggi kadar capsaicin maka
semakin baik kualitasnya sebagai
sediaan farmasi. Dalam bidang
farmasi selain untuk meredakan rasa
sakit atau nyeri, capsaicin juga dikenal
memiliki aktivitas antikanker (Surh,
2002).
Capsaicin merupakan turunan
senyawa
fenilpropanoid
yang
memiliki aktifitas biologis yang tinggi,
memberikan efek fisiologi dan
farmakologis yang lebih dikenal
sebagai senyawakimia aktif, juga
sebagai antioksidan (Mori, 2006).
BonCabe adalah sebuah produk
dari Kobe berupa serbuk cabai kering.
BonCabe
mengklaim
bahwa
produknya menggunakan 100% cabai
alami dengan bahan tambahan
seperti penguat rasa sodium inosinate
dan guanilat (www.boncabe.com,
2012).
2. METODE PENELITIAN
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam
penelitian ini adalah botol vial, kertas
saring, mikropipet, mortir, stamper,
penangas air, tabung reaksi, tabung
sentrifuga, vortex,mikrosentrifugator,
ultrasonic vibrator dan instrumen
HPLC.

Bahan
Bahan-bahan yang digunakan
adalah sampel BonCabe, kloroform,
metanol,air, dan larutan standar
capsaicin.
Prosedur
1. Pembuatan kurva kalibrasi
Larutan standar dibuat dengan
variasi konsentrasi, yaitu 1 ppm, 2
ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 40
ppm dengan masing - masing
volumenya 1 ml. Pembuatan larutan
standar
dilakukan
dengan
pengenceran bertingkat dari stok
standar 2000 ppm. Kemudian larutan
standar tiap variasi konsentrasi
disuntikan ke instrumen HPLC.
Larutan blanko dibuat dari fase gerak
metanol:air (70:30).
2. Penentuan Kadar Capsaicin
Sampel digerus menggunakan
mortir dan stamper hingga halus,
kemudian ditimbang sebanyak 1 gram
dan dimasukkan ke dalam tabung
sentrifuga.
8
ml
kloroform
ditambahkan ke dalam tabung, lalu
disentrifugasi pada 3000 g selama 15
menit. Disaring menggunakan kertas
saring lalu dipindahkan ke dalam
tabung reaksi. Kloroform diuapkan
dengan cara memindahkan sampel ke
tabung reaksi dan memasukkan
tabung reaksi ke dalam penangas air.
Sampel bebas kloroform ditambahkan
2 ml metanol dan dimasukkan
kembali dalam vial kemudian
disonikasi dengan ultrasonic vibrator.
Diambil 10 l ke dalam tabung
eppendorf lalu ditambahkan fasa

gerak (metanol : air 70 : 30)

sebanyak 990 l. Tabung eppendorf
lalu divortex selama 20 detik dan

disentrifugasi pada 3000g selama 15

menit. Sampel kemudian disuntikan
ke dalam instrumen HPLC.

3. HASIL
3.1. Tabel data pengukuran larutan standar
Konsentrasi (ppm)
1
2
5
10
20
40

Panjang gelombang 227 nm

Waktu retensi
Luas area
4,242
39588
4,275
43097
4,267
96601
4,275
184000
4,275
372996
4,267
745599

Panjang gelombang 281 nm

Waktu retensi
Luas area
4,217
21304
4,275
16161
4,267
36443
4,275
71414
4,275
143008
4,267
285289

Kurva Konsentrasi Standar

terhadap Luas Area
800000
y = 18341x + 8551,2
R = 0,9993

700000
Luas area

600000
500000

227 nm

400000

281 nm

y = 6957,6x + 5154,7
R = 0,9978

300000
200000

Linear (227 nm)

Linear (281 nm)

100000
0
0

10

20

30

40

50

konsentrasi standar (ppm)

3.2. Tabel hasil pengukuran sampel

Panjang gelombang
227 nm
281 nm

Waktu retensi
4,5
4,208
4,492
4,592

Luas area
34797
1408
102
24

3.3. Perhitungan Pengenceran Larutan

Standar
M1.V1 = M2.V2
Konsentrasi 40 ppm
2000 . x = 40. 1 ml
X = 0,02 ml = 20 l
Jadi diambil 20 l dari larutan standar
2000 ppm, ditambah fase gerak
hingga 1 ml.
Konsentrasi 20 ppm
40 . x = 20 . 1 ml
X = 0,5 ml
Jadi diambil 0,5 ml dari larutan
standar 40 ppm, ditambah fase gerak
hingga 1 ml.
20 . x = 10 . 1 ml
X = 0,5 ml
Jadi diambil 0,5 ml dari larutan
standar 20 ppm, ditambah fase gerak
hingga 1 ml.
10 . x = 5 . 1 ml
X = 0,5 ml
Jadi diambil 0,5 ml dari larutan
standar 10 ppm, ditambah fase gerak
hingga 1 ml.
5 . x = 2 . 1 ml
X = 0,4 ml
Jadi diambil 0,4 ml dari larutan
standar 5 ppm, ditambah fase gerak
hingga 1 ml.
2 . x = 1 . 1 ml
X = 0,5 ml
Jadi diambil 0,5 ml dari larutan
standar 20 ppm, ditambah fase gerak
hingga 1 ml.

garis pada 227 nm karena

memberikan regresi paling tinggi.
Persamaan garisnya yaitu:
y = 18341x + 8551,2
R2 = 0,9993
Berdasarkan persamaan dari larutan
standar, maka dihasilkan:
y = 18341x + 8551,2
34797 = 18341x + 8551,2
18341 x = 26245,8
X = 1,431 ppm
Jadi, konsentrasi capsaicin dalam
1000 l larutan adalah 1,431 ppm.
Konsentrasi capsaicin dalam 10 ml
(sebelum pengenceran):
V1.M1 = V2.M2
10 . 1,431 = 1 . M2
M2 = 1431 ppm
Jadi konsentrasi capsaicin dalam 10 ml
(sebelum pengenceran) adalah 1431
ppm.
Massa capsaicin dalam sampel:
Ppm = mg/L
Massa (mg) = 1431 ppm x 10-2 L
Massa = 14,31 mg
Jadi, massa capsaicin dalam sampel
adalah 14,31 mg.
Kadar capsaicin dalam sampel:
% capsaicin = (massa capsaicin /
massa sampel) x 100%
% capsaicin = (14,31 mg / 103 mg) x
100%
% capsaicin = 1,431 %

3.4. Perhitungan Kadar Capsaicin

Berdasarkan
kurva
yang
dihasilkan, maka persamaan garis
yang digunakan adalah persamaan

Massa capsaicin dalam sampel

BonCabe
Massa BonCabe sachet = 7 gram

Massa capsaicin = 1,431% x 7 g

Massa capsaicin = 0,1 gr = 100 mg
4. PEMBAHASAN
Analisis sampel dimulai dengan
menyiapkan sampel, yaitu BonCabe dari
Kobe. Sampel digerus dalam mortar
hingga cukup halus, hal ini bertujuan
agar memudahkan saat ekstraksi.
Setelah itu ditimbang dengan timbangan
digital masing-masing 1 gr, lalu
dimasukkan ke dalam tabung sentrifuga.
Sampel diekstraksi dengan metode
ekstraksi cair-cair. Sampel dilarutkan
dengan 8 ml klorofom hingga sampel
terendam, lalu disentrifugasi pada 3000
g selama 20 menit.
Ekstraksi cair-cair adalah suatu
metode dimana solut dipisahkan dari
cairan pembawa (diluen) menggunakan
solven cair. Campuran diluen dan solven
ini adalah heterogen (immiscible / tidak
saling campur), jika dipisahkan terdapat
2 fase, yaitu fase rafinat dan fase ekstrak.
Perbedaan konsentrasi solut di dalam
suatu fasa dengan konsentrasi pada
keadaan
setimbang
merupakan
pendorong
terjadinya
pelarutan
(pelepasan) solut dari larutan yang ada.
Sehingga akan terbentuk 2 fase, dimana
fase atas (rafinat) mengandung residu
sedangkan fase
bawah
(ekstrak)
mengandung solven (kloroform) dan
solute (capsaicin).
Sentrifugasi yaitu metode yang
digunakan dalam untuk mempercepat
proses
pengendapan
dengan
memberikan gaya sentrifugasi pada
partikel-partikelnya.
Pemisahan
sentrifuga menggunakan prinsip dimana
objek diputar secara horizontal pada
jarak tertentu. Apabila objek berotasi di

dalam tabung atau silinder yang berisi

campuran cairan dan partikel, maka
campuran tersebut dapat bergerak
menuju pusat rotasi, namun hal tersebut
tidak terjadi karena adanya gaya yang
berlawanan yang menuju kearah dinding
luar silinder atau tabung, gaya tersebut
adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah
yang menyebabkan partikel-partikel
menuju bagian dasar tabung dan
terakumulasi membentuk endapan.
Kemudian disaring menggunakan kertas
saring dan corong gelas. Hasil saringan
(supernatant) dimasukkan dalam tabung
reaksi.
Setelah itu tabung reaksi disimpan di
atas penangas air untuk mempercepat
proses penguapan kloroform. Hasilnya
terdapat
ekstrak
sampel
yang
mengandung
capsaicin.
Lalu
ditambahkan 2 ml metanol sebagai
pembawa capsaicin dalam larutan.
Larutan tersebut kemudian dipindahkan
ke dalam vial dan dilakukan sonikasi
menggunakan ultrasonic vibrator untuk
menghomogenkan, lalu dipipet sebanyak
10 l ke dalam tabung eppendorf dan
ditambahkan 90 l fase geraknya, yaitu
metanol:air 70:30.
Fase gerak ini sebelumnya harus
dilakukan digessing (penghilang gas)
yang ada untuk menghindari kekacauan
analisis. Selain itu adanya pengotor
dalam solven juga menyebabkan
gangguan pada sistem. Oleh karena itu,
pada fase gerak ini harus disaring
terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil. Kemudian kolom
dipasangkan pada alat instrument yang
akan membawa hasil pemisahan ke
detektor. Kolom yang digunakan adalah
kolom fase balik C18 dimana fused silica

yang bersifat
polar dilapisi dengan
Oktadesil Silika (ODS atau C18) yang
bersifat nonpolar. R adalah gugus alkil
rantai lurus dan R biasanya adalah noktadesil (C-18). Hasil reaksi yang
diperoleh disebut dengan silica fase
terikat yang stabil terhadap hidrolisis
serta
mempunyai
karakteristik
kromatografik dan selektifitas yang
berbeda jika dibandingkan dengan silika
yang tidak dimodifikasi). Setelah semua
sudah disiapkan maka HPLC siap bekerja
yaitu mula-mula solven diambil melalui
pompa. Kemudian solven masuk ke
dalam katup injeksi berputar, yang
dipasang tepat pada sampel loop.
Dengan
mikro
syringe,
sampel
dimasukan ke dalam sampel loop yang
kemudian bersama-sama dengan solven
masuk ke dalam kolom. Setelah itu, hasil
pemisahan dideteksi oleh detektor, yang
penampakannya
ditunjukan
oleh
perekam berupa grafik. Elusi yang
digunakan adalah elusi isokratik dimana
fase gerak dari awal sampai akhir
memiliki perbandingan komposisi yang
tetap.
Sampel diukur pada 2 panjang
gelombang, yaitu 227 nm dan 281 nm
agar dapat mengetahui pada panjang
gelombang mana yang memberikan
serapan lebih baik. Pada panjang
gelombang 227 nm dihasilkan grafik
dengan 1 puncak area capsaicin dengan
waktu retensi 4,5 dan luas area 34797.
Sedangkan pada panjang gelombang 281
nm dihasilkan 3 puncak area capsaicin,
yaitu puncak tertinggi pada waktu
retensi 4,208; luas area 1408, puncak
kedua pada waktu retensi 4,492; luas
area 102, dan puncak ketiga pada waktu
retensi 4,592; luas area 24. Adanya

jumlah puncak yang lebih dari satu buah

menunjukan bahwa capsaicin yang
berada dalam sampel adalah asli dari
buah cabai, bukan capsaicin hasil
sintesis.
Sampel dibandingkan terhadap
larutan
standar
dengan
variasi
konsentrasi, yaitu 1 ppm, 2 ppm, 5 ppm,
10 ppm, 20 ppm, dan 40 ppm. Larutanlarutan
standar
dibuat
dengan
pengenceran bertingkat dari stok awal
2000 ppm. Larutan standar digunakan
untuk membuat kurva kalibrasi, diukur
pada panjang gelombang 227 nm dan
281 nm. Pengolahan data hasil
pembacaan menunjukan bahwa panjang
gelombang 227 nm memberikan regresi
yang lebih tinggi, sehingga persamaan
garisnya digunakan sebagai pembanding
terhadap penentuan kadar capsaicin
dalam sampel.
Berdasarkan perhitungan maka
didapatkan bahwa kadar capsaicin dalam
sampel yang dianalisis adalah sebesar
0,1431 %, atau setara dengan 10 mg
dalam sampel BonCabe sachet isi 7 gram.
5. KESIMPULAN
Kadar capsaicin dalam sampel
BonCabe produksi dari Kobe sebesar
1,431%. Pada kemasan sachet 7 gram,
kadar capsaicin setara dengan 100 mg.

DAFTAR PUSTAKA
Barbero, G.F.; Molinillo, J.M.G.; Varela, R.M.;
Palma, M.; Macias, F.A.; Barroso,C.G.
Application of Hanschs model to
capsaicinoids and capsinoids: a
studyusing the quantitative structureactivity relationship. A novel method for

thesynthesis of capsinoids. J. Agric.

Food Chem. 2010,58, 3342-3349.
Clark, Jim. (2007).Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi
(HPLC).*Online+.
Tersedia:
http://www.chem-istry.org
yang
direkam pada 6-10-2007. [ diakses 20
November 2014].
Hendayana, Sumar. (2006).
KIMIA
PEMISAHAN Metode Kromatografi dan
Elektroforensis Modern. Bandung : PT.
Remaja Rosdakarya.
Mori, A; Lehmann S, O'Kelly J et al. (2006)
"Capsaicin, a component of red
peppers,inhibits
the
growth
of
androgen-independent, p53 mutant
prostate cancer cells". Cancer Research
66, 6: 3222 3229.
Putra, Effendy De Lux. (2004). Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang
Farmasi. Sumatera Utara : Jurusan
Farmasi FMIPA USU.
Surh, Y.J., (2002). More than spice: capsaicin
in hot chili peppers makes tumor
cellscommit suicide, J. Natl. Cancer Inst.
94: 1263 1265.
http://www.boncabe.com/ [diakses 20
november 2014]