PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

I. JUDUL PERCOBAAN : Penentuan jenis Asam Amino Dalam Sampel.

II. TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan Asam Amino Yang terdapat dalam
Sampel dengan kromatografi Lapis Tipis
III. TANGGAL PERCOBAAN
HARI/TGL PERCOBAAN : Rabu/ 26 September 2018 , Pukul 13.00 WIB
SELESAI PERCOBAAN : Rabu/ 26 September 2018 , Pukul 15.30 WIB
IV. DASAR TEORI :
Asam Amino

Asam asmino adalah senyawa organik yang memiliki gugus fungsional

karboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2). Dalam biokimia seringkali
pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon (C) yang sama
(disebut atom C "alfa" atau α). Atom C pusat tersebut dinamai atom Cα ("C-alfa")
sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan
langsung dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom
Cα ini, senyawa tersebut merupakan asam α-amino. Gugus karboksil memberikan
sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam
amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi
basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi
zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang paling banyak
dipelajari karena salah satu fungsinya sangat penting dalam organisme, yaitu
sebagai penyusun protein termasuk enzim, kerangka dasar sejumlah senyawa
penting dalam metabolisme (terutama vitamin, hormon dan asam nukleat) dan
pengikat ion logam penting yang diperlukan dalam dalam reaksi enzimatik
(kofaktor). Hal itu dapat dibuktikan apabila protein dihidrolisis maka akan
menghasilkan asam amino. Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C
yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil (COOH), atom
hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau
rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya.
Gambar asam amino adalah sebagai berikut :
H
R C COOH

NH2

1
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

Sedangkan dari berbagai macam asam amino penyusun protein, yang dapat
dijadikan pembeda antara asam amino yang satu dengan yang lain adalah
perbedaan gugus R yang disebut rantai samping. Rantai samping inilah yang
memberikan sifat khusus pada masing-masing asam amino. Terdapat dua puluh
asam amino alami yang lazim. Kedua puluh asam amino alami yang lazim,
memiliki rangka yang terdiri dari gugus asam karboksilat dan gugus yang terikat
secara kovalen pada atom pusat (karbon alfa). Dua gugus lainnya pada karbon alfa
ialah hidrogen dan gugus R yang merupakan rantai samping asam amino. Sifat
kimia gugus rantai sampinglah yang menyebabkan perbedaan sifat asam amino
(Fessenden dan Fessenden, 1997). Asam amino penyusun protein dapat
digolongkan berdasarkan berbagai kategori. Berdasarkan komposisi kimia gugus
R, asam amino dapat digolongkan menjadi asam amino alifatik (glisin, alanin,
valin, leusin, isoleusin), asam amino hidroksil (serin, treonin), asam amino sulfur
(sistein, metionin), asam amino aromatik (fenilalanin, tirosin, triptofan), asam
amino asam (asam aspartat, asparagin, asam glutamat, glutamin), asam amino basa
(arginin, histidin, lisin) dan asam amino imino (prolin). Sedangkan pembagian
asam amino berdasarkan polaritas molekulnya, yaitu asam amino polar dengan
gugus R polar (C-O, C-N, O-H) seperti glisin, sistein, asam glutamat, serin, tirosin,
treonin, asam aspartat, glutamin, histidin, arginin, asparagin dan lisin. Sedangkan
golongan asam amino nonpolar dengan gugus R nonpolar (C-C, C-H) seperti valin,
alanin, leusin, metionin, prolin, isoleusin, fenilalanin dan tirosin. Asam-asam
amino juga dapat digolongkan berdasarkan kemampuan sintesis tubuh manusia
dan hewan yaitu asam amino non-esensial (alanin, prolin, glisin, serin, sistein,
tirosin, asparagin, glutamin, asam aspartat dan asam glutamat) dan asam amino
esensial (arginin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, treonin,
triptofan dan valin) (Toha dan Hamid, 2001). Selain itu, asam amino dapat
digolngkan berdasarkan polaritas kandungan gugus R (pada pH 7) (Lehninger,
1982) :

2
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

Dalam molekul asam amino, karena atom C α (alfa) masih mengikat gugus lain
yang tidak sama dengan gugus asam amino, maka atom C ini bersifat asimetris,
sehingga asam amino memiliki sifat optis aktif (artinya dapat memutar bidang
sinar terpolarisasi), baik secara positif maupun negatif. Mengingat sifat-sifat asam
amino yang dapat larut dalam air, dapat membentuk kristal, harga konstanta
dielektrikum yang tinggi, memiliki panas netralisasi seperti pada H+ dan OH- dan
dalam medan listrik (misal: dengan elektrophoresa) tak bergerak (dalam keadaan
tertentu), maka asam amino dipercaya memiliki sifat amphoter atau dalam keadaan
zwitter ion yang memiliki muatan (+) dan (-) yang seimbang (Wilbraham, 1992).

Telah diketahui bahwa beberapa molekul asam amino dapat berikatan satu
dengan yang lain membentuk suatu senyawa yang disebut dipeptida. Apabila
jumlah asam amino yang berikatan tidak lebih dari sepuluh molekul disebut
oligopeptida. Peptida yang dibentuk oleh dua molekul asam amino disebut
dipeptida.Selanjutnya tripeptida dan tetrapeptida adalah peptide yang terdiri atas
3
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

tiga molekul dan empat molekul asam amino. Delapan molekul asam amino
dengan demikian akan membentuk oktapeptida. Polipeptida adalah peptide yang
molekulnya terdiri dari banyak molekul asam amino. Protein adalah suatu ikatan
polipeptida yang terdiri atas lebih dari seratus asam amino (Poedjiadi, 1994).

1. Sifat Keasaman dan Kebasaan Asam α-Amino

Karena asam amino mengikat gugus amino (NH2) dan gugus karboksil
(COOH) di dalam satu molekul, maka asam amino mempunyai sifat ion
ammonium (+NH3) dan sifat ion karboksilat (COO-), dengan perkataan lain dapat
bersifat amfoter yaitu dapat bersifat asam atau memberikan proton pada basa kuat
dan bersifat basa atau menerima proton dari asam kuat (Matsjeh, Sabirin, dkk,
1996).
Persamaan keseimbangan secara umum dari asam amino dapat dilukiskan
sebagai berikut :
+ OH- OH-
H
R C CO2H R CHCOO- R CHCOO-
+ +
H H
+NH3 NH2
+NH3

asam amino pada bentuk ion dipol asam amino pada

pH rendah (netral) pH tinggi
(bersifat asam) (1) (bersifat basa)
(2) (3)

pH makin tinggi

Dari persamaan di atas terlihat jelas keamfoteran asam amino. Dalam suasana
asam (PH rendah) struktur (1) mengikat H+ menghasilkan suatu kation (2)
sehingga (1) bersifat basa dan dalam suasana basa (PH tinggi) struktur (1)
mengikat OH- menghasilkan anion (3), sehingga (1) bersifat asam (Matsjeh,
Sabirin, dkk, 1996).
Keasaman gugus +NH3 lebih kuat dari pada kebasaan gugus COO-, maka
jumlah anion lebih banyak dari pada jumlah kation, sehingga larutan akan bersifat
agak asam dan muatan netto adalah negatif (Matsjeh, Sabirin, dkk, 1996).
A. Metode Kromatografi
Kromatografi dalam bidang kimia merupakan sebuah teknik analisis yang
digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-
komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama.
Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang
didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir
4
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-

sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda
pula (Adnan, 1997).

1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Cara pemisahan dengan adsorbsi pada lapis tipis adsorben yang sekarang
dikenal dengan kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatography atau TLC)
telah dipakai sejak tahun 1983. Teknik ini bertujuan untuk memisahkan
komponen kimia secara cepat berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi. TLC atau
KLT dapat digunakan untuk memisahkan berbagai senyawa seperti ion-ion
anorganik, kompleks senyawa-senyawa organik dengan senyawa-senyawa
anorganik, dan senyawa-senyawa organik baik yang terdapat di alam maupun
senyawa-senyawa organik sintetik (Adnan, 1997).
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan sampel
berdasarkan perbedaan tingkat kepolaran antara sampel dengan pelarut yang
digunakan. Pada hakekatnya KLT merupakan metode kromatografi cair yang
melibatkan dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase geraknya berupa
campuran pelarut pengembang dan fasa diamnya dapat berupa serbuk halus yang
berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair-padat) atau berfungsi
sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair). Fase diam pada
KLT sering disebut penyerap walaupun berfungsi sebagai penyangga untuk zat
cair di dalam sistem kromatografi cair-cair. Hampir segala macam serbuk dapat
dipakai sebagai penyerap pada KLT, contohnya silika gel (asam silikat), alumina
(alumunium oksida), kiselgur (tanah diatomae) dan selulosa. Silika gel merupakan
penyerap paling banyak dipakai dalam KLT (Iskandar, 2007).
Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan
kromatografi kertas adalah karena dapat dihasilkannya pemisahan yang lebih
sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan lebih cepat
(Adnan, 1997).
2. Kromatografi Kertas
Teknik kromatografi kertas diperkenalkan oleh Consden, Gordon dan Martin
(1994), dimana fase diam yang digunakan adalah kertas saring yang sangat
seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Yazid,
2005).

5
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

Untuk mengetahui jenis dari asam amino yang terkandung dari suatu
bahan/sampel, biasanya digunakan metode kromatografi kertas. Kromatografi
kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino karena asam amino
memiliki sifat yang larut dalam air dan tidak mudah menguap sehingga dapat
dipisahkan melalui perpindahan fasa gerak (eluen) pada fasa diam (adsorben).
Asam amino akan terbawa oleh fasa gerak dan akan mengendap atau menempel
pada fasa diam (adsorben) setelah menempuh jarak tertentu (Yazid, 2005).
Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa.
Sampel yang akan dianalisis ditotolkan pada kertas yang kemudian digantung
pada wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan ke dalam pelarut yang
mengisi dasar wadah. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak
tertentu. Setiap jenis asam amino akan selalu menempuh jarak yang khas dari
masing-masing asam amino asalkan jenis kertas, eluen, dan pelarutnya sama
(Yazid, 2005).
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang
ditempuh pelarut, beberapa lainnya tetap lebih dekat pada garis dasar. Jarak
tempuh relatif pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda
menjaga segala sesuatunya tetap sama, misalnya jenis kertas dan komposisi
pelarut yang tepat. Jarak relatif pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap
senyawa berlaku rumus sebagai berikut :

Posisi pelarut depan ditandai dengan pensil dan kromatogram lalu

dikeringkan dan disemprot dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan
asam amino menghasilkan senyawa berwarna, utamanya coklat atau ungu (Yazid,
2005).
Asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk yang
disebut ungu Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk
mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi (Yazid, 2005).
Adapun reaksi umum secara keseluruhan, adalah sebagai berikut :
O
O O
H
C
OH
C + H2N C COO- N + RCHO + CO2 + 3H2O +H+
OH
C
R
-
O O O

Ninhidrin Asam Amino Anion Ungu

6
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

Tabel Daftar Rf Standart 20 Asam Amino

Asam Amino Rf Asam Amino Rf
Alanin 0,38 Leusin 0,73
Arginin 0,20 Lisin 0,14
Asparagin 0,50 Metionin 0,55
Asam Aspartat 0,24 Fenilalanin 0,68
Sistein 0,4 Prolin 0,43
Glutamin 0,13 Serin 0,27
Asam Glutamat 0,30 Treonin 0,35
Glisin 0,26 Triptofan 0,66
Histidin 0,11 Tirosin 0,45
Isoleusin 0,72 Valin 0,61

Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf yaitu (Day dan Underwood,

2002):
1. Strukur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

2. Sifat dari penyerapan dan derajat aktifitasnya.

3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.

4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase gerak.

5. Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang digunakan.
6. Teknik percobaan.

7. Jumlah cuplikan yang digunakan.

8. Suhu.

9. Kesetimbangan
Kromatografi lapis Tipis pada Asam Amino
Asam-asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk
yang disebut ungu Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak
untuk mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi.
Adapun reaksi umum secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :

7
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

Alanin
Semua asam amino, kecuali glisin dapat dianggap sebagai derivat alanin. Alanin
diperoleh untuk pertama kalinya oleh Weyl dari hasil hidrolisis fibroin, yaitu
protein yang terdapat pada sutera. Struktur alanin :

Treonin
Treonin adalah homolog yang lebih besar dari erin dan termasuk dalam golongan
asam amino esensial. Mula-mula treonin diisolasi dari hasil hidrolisis fibrin darah.
Berikut struktur treonin :

Glisin
Glisin adalah asam amino yang paling sederhana dan terdapat pada skleroprotein.
Pada tahun 1820 Braconnot menemukan glisin dari hasil hidrolisis gelatin. Adapun
struktur glisin adalah :

8
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

V. ALAT DAN BAHAN

Alat-alat :

 Plat KLT 1 buah

 Labu pemisah 1 buah
 Kaca kapiler 1 buah
 Gelas kimia 1 buah
 Botol semprot 1 buah
 Oven 1 buah
 Gelas ukur 1 buah

Bahan-bahan :
 Asam asetat glasial 6 mL
 Aquades 25 mL
 n-butanol 25 mL
 Larutan standar A (Sistein) secukupnya
 Larutan standar B (Histidin) secukupnya
 Larutan standar C (Glisin) secukupnya
 Larutan sampel secukupnya
 Ninhidrin secukupnya

9
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

VI. ALUR PERCOBAAN

1. Pembuatan Larutan Pengemulsi (fasa gerak)
25 mL n-butanol + 6 mL asam asetat + 25 mL aquades

- Dicampur sambil dikocok

- Diletakkan dalam lemari kromatografi
- Dijenuhkan dengan uapnya

Fasa gerak

2. Menentukan Komponen Asam Amino

Kertas kromatografi 4x10 cm

- Diberi batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1 cm

- Diberi tanda untuk penotolan noda(A,B,C,dan S) dengan jarak 1 cm antar noda dan 0,5 cm jarak
antara noda paling luar dengan batas samping plat KLT
- Dioven 5 menit
- Ditotolkan 4 macam larutan (A, B, C, S) menggunakan pipa kapiler dengan jarak 1 cm
- Dikeringkan tiap-tiap tetesan sebelum tetesan berikutnya diletakkan diatasnya(besar noda < 0,4 cm)
- Dikeringkan tiap-tiap tetesan sebelum tetesan berikutnya diletakkan diatasnya (besar noda < 0,4
cm)

Kertas kromatografi yang ditetesi sampel

- Digantung diatas dalam lemari kromatografi beberapa jam guna

dijenuhkan dengan uap eluen, sampai tanda batas atas
- Dielusi

Kertas kromatografi setelah dielusi

- Dikeluarkan kertas kromatografi

- Dikeringkan pada suhu 110⁰ C selama 5 menit (sampai kering)
- Disemprot dengan ninhidrin
- Dikeringkan kembali selama 5 menit

Noda-noda asam amino yang berwarna akan terlihat

- Dicatat warnanya
- Dihitung Rf pada tiap-tiap noda
- Ditetapkan komponen-komponen asam amino dalam sampel dengan
membandingkan harga Rf yang diperoleh dengan Rf asam-asam amino
standar

Komponen asam amino

10
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

VII. HASIL PENGAMATAN

Hasil Pengamatan
No. Alur Percobaan Dugaan Reaksi Kesimpulan
Sebelum Sesudah
1. Pembuatan Larutan Pengemulsi (fasa gerak) -Larutan n- -N-butanol + -Asam asetat + n- Eluen yang dibuat
buanol : larutan butanol 𝐻+↔ n-butil jenuh dalam
as.asetat glasial:
25 mL n-butanol + 6 mL asam asetat + asetat
25 mL aquades tidak berwarna tidak berwarna CH3COOH (aq) + chamber
-Larutan asam dan larutan berbau Reaksi antara asam
glasial : larutan CH3CH2CH2OH n-butanol dan asam
- Dicampur sambil dikocok menyengat(asam
𝐻+↔
- Diletakkan dalam lemari tidak berwarna asetat). asetat menghasilkan
CH3COOCH2CH2-
kromatografi -Aquades :
- Dijenuhkan dengan uapnya -N-butanol + CH2CH2CH3(aq) + n-butil asetat.
tidak berwarna H2O(l)
as.asetat glasial+ Senyawanya bersifat
-Eluen : bersifat
Fasa gerak aquades: larutan polar polar
tidak berwarna. -N-butanol : bersifat
non polar
-Asam asetat glasial :
bersifat polar
-Aquades : bersifat
polar
-Urutan kepoaran :
aquadest > n-butanol
> asam asetat

11
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

2. Menentukan Komponen Asam Amino -plat KlT silica -kertas Rf teori : Nilai Rf pada sampel
berwarna putih. kromatografi -Sistein = 0,40 adalah 0,22
Kertas kromatografi 4x10 cm
-larutan diberi jarak -Histidin = 0,11 mendekati Rf pada
- Diberi batas atas 0,5 cm dan batas bawah standart A -dikeringkan: noda -Glisin = 0,26 glisin sehingga dapat
1 cm
- Diberi tanda untuk penotolan
(histidin) kering. Reaksi asam amino + dikatakan bahwa
noda(A,B,C,dan S) dengan jarak 1 cm larutan tidak -diberi totolan : ninhidrin sampel merupakan
antar noda dan 0,5 cm jarak antara noda
berwarna.  Totolan 1 asam amino glisin.
paling luar dengan batas samping plat
KLT -larutan larutan
- Dioven 5 menit standart B tidak
- Ditotolkan 4 macam larutan (A, B, C, S)
menggunakan pipa kapiler dengan jarak 1 (glisin) larutan berwarna.
cm tidak berwarna.  Totolan 2
- Dikeringkan tiap-tiap tetesan sebelum
-larutan larutan
tetesan berikutnya diletakkan
diatasnya(besar noda < 0,4 cm) standart C tidak
- Dikeringkan tiap-tiap tetesan sebelum
(sistein) larutan berwarna
tetesan berikutnya diletakkan diatasnya
(besar noda < 0,4 cm) tidak berwarna.  Totolan 3
-larutan larutan
Kertas kromatografi yang ditetesi sampel standart sampel tidak
- Digantung diatas dalam lemari tidak berwarna. berwarna
kromatografi beberapa jam guna -eluen tidak  Totolan 4
dijenuhkan dengan uap eluen, sampai
tanda batas atas berwarna larutan
- Dielusi -ninhidrin tidak tidak

12
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

berwarna. berwana
Kertas kromatografi setelah dielusi -digantung dalam

- Dikeluarkan kertas kromatografi chamber : noda

- Dikeringkan pada suhu 110⁰ C selama 5 belum terlihat
menit (sampai kering) -setelah dielusi
- Disemprot dengan ninhidrin
- Dikeringkan kembali selama 5 menit selama 2,5 jam
kertas basah
Noda-noda asam amino yang berwarna belum terlihat.
akan terlihat
-keringkan 1100C
- Dicatat warnanya terdapat noda pada
- Dihitung Rf pada tiap-tiap noda
KLT.
- Ditetapkan komponen-komponen
asam amino dalam sampel dengan -disemprot dengan -Glisin bersifat
membandingkan harga Rf yang ninhidrin sedikit nonpolar
diperoleh dengan Rf asam-asam ada bercak noda -Histiidine bersifat
amino standar nonpolar
berwarna jingga.
Komponen asam -Cystein bersifat
-dioven 5 menit
polar
noda terlihat.
Reaksi glisin dengan
-Jarak noda :
ninhidrin:
 A = 1,2 cm
 B = 1,4 cm
 C = 0,8 cm

13
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

 S = 1,9 cm
-nilai Rf :
 A =
0,141176
-Reaksi alanin
 B =
dengan ninhidrin:
0,164705
 C =
0,094117
 S = 0,2235
-warna noda :
Reaksi Cytein dengan
 A =
ninhidrin :
jingga(++)
 B = jingga
pudar
 C = jingga
(+)
 S = jingga
pudar.

14
PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

15
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

VIII. ANALISIS PEMBAHASAN

Percobaan ini bertujuan untuk menentukan asam amino yang terdapat dalam
sampel dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Kromatografi lapis tipis (KLT)
merupakan metode pemisahan sampel berdasarkan perbedaan tingkat kepolaran
antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Kelebihan penggunaan kromatografi
lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas ialah karena dapat
dihasilkannya pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan
dapat dilaksanakan dengan lebih cepat.Banyak pemisahan yang memakan waktu
berjam-jam bila dikerjakan dengan kromatografi kertas, tetapi dapat dilaksanakan
hanya beberapa menit saja bila dikerjakan dengan TLC (Adnan, 1997).
Suatu metode pemisahan komponen kimia Dengan KLT ini berdasarkan
prinsip partisi dan adsorpsi antara fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen),
komponen kimia bergerak naik mengikuti cairan pengembang karena daya serap
adsorben (silika gel) terhadap komponen-komponen kimia tidak sama sehingga
komponen dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda berdasarkan
tingkat kepolarannya dan hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan.
Teknik ini melibatkan 2 fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak dimana fase diamnya
yaitu berupa plat silica (KLT) dan fase geraknya disini menggunakan campuran n-
butanol, asam asetat glasial dan aquades. Campuran larutan ini disebut eluen yang
dibuat dari larutan yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda. Asam amino
adalah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam amino sebagai
komponen protein mempunyai gugus amina (-NH2) pada atom karbon α dari posisi
gugus karboksil (-COOH). Rumus umum asam amino adalah (Poedjiadi, 1994):
H
R C COOH

NH2

1. Pembuatan Larutan Pengemulsi (Fase gerak)

Langkah yang harus dilakukan yaitu pembuatan larutan pengemulsi atau
eluen yang digunakan sebagai fase gerak. Dalam percobaan ini, kami
mencampurkan 25 ml n-butanol (jernih tidak berwarna) bersifat non polar, 6 ml
asam asetat glasial (jernih tidak berwarna) bersifat semi polar dan 25 ml aquades
(jernih tidak berwarna) bersifat polar, kemudian larutan tersebut dikocok dan
menghasilkan dua lapisan larutan yang jernih tidak berwarna. Dalam proses ini

16
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

terjadi reaksi esterifikasi, dimana n-butanol bereaksi dengan asam asetat glasial
menghasilkan ester.
Reaksi yang terjadi:
O

H2 H2 H2
3HC C C C OH + 3HC C + H2O
(aq) (l) (l)

OH

n-butanol Asam asetat Air

H2 H2 H2
3HC C C C C CH3 + H2O
(aq) (l)

Ester Air

Selanjutnya larutan dimasukkan ke dalam chamber/lemari kromatografi dan

ditutup rapat dengan kaca yang. Fungsi chamber ditutup agar suasana dalam
chamber menjadi jenuh oleh uap dari larutan eluen.Tujuan dari penjenuhan ini
adalah agar proses elusi oleh fasa gerak berjalan dengan baik/sempurna. Jika
proses penjenuhan belum sempurna atau uap eluen belum memenuhi seluruh
bagian chamber, maka distribusi pada fasa diam tidak akan berjalan dengan baik
sehingga proses elusi akan berjalan lebih lama dan hasilnya kurang teliti. Sehingga
dapat disimpulkan eluen yang dibuat jenuh dalam chamber berasal dari reaksi
antara n-butanol dengan asam asetat menghsilkan n-butil asetat yang senyawanya
bersifat polar. Reaksi yang terjadi :

CH3CH2CH2CH2OH(aq)+CH3COOH(aq) → CH3CH2CH2CH2COOCH3(aq) +
H2O(l).

2. Menentukan Komponen Asam Amino

Langkah selanjutnya adalah menentukan komponen asam amino dengan
menghitung nilai Rf dan membandingkan dengan nilai Rf pada beberapa larutan
standart yang mengandung asam amino. Dalam percobaan ini menggunakan 3
jenis larutan standart, yaitu histidin (A), glisin (B), sistein (C) dan satu larutan
sampel (S). Dari ketiga jenis larutan standart tersebut dan satu larutan sampel,
semua jernih tidak berwarna.
17
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

Dalam percobaan ini pertama yang harus kami siapkan adalah plat KLT
berukuran (4x10) cm, kemudian diberi batas atas sebesar 0,5 cm dan batas bawah
sebesar 1 cm dan diberi tanda titik A, B, C, dan S dengan pensil sebagai tanda
tempat menotolkan larutan (tiap titik berjarak 1 cm), fungsinya diberikan tanda
batas bawah dan batas atas adalah agar ketika mencelupkan plat KLT pada eluen
tidak melebihi batas bawah yang telah ditentukan agar tidak mengganggu arah
pergerakan sampel dan dapat mempermudah pengukuran jarak yang ditempuh
pelarut untuk menghitung harga Rf, dan pemberian tanda dengan menggunakan
pensil karena pensil tidak akan bereaksi dengan sampel dan pelarut, sedangkan
apabila kita menggunakan bolpoin maka tintanya akan dapat bereaksi dan dapat
menggangu proses kromatografi. Kemudian plat KLT dioven pada suhu 1100C
selama 5 menit. Tujuan dilakukan pengovenan adalah agar plat KLT kering dan
untuk menghilangkan zat pengotor yang dapat mempengaruhi proses kromatografi.
Selanjutnya, setelah plat KLT dikeluarkan dari oven kemudian plat KLT ditotoli 4
macam larutan yang sudah disiapkan (A, B, C, dan S) dengan menggunakan pipa
kapiler dengan jarak tiap sampel 1 cm. Pentotolan dilakukan sebanyak 3 kali
dengan diameter noda < 0,4 cm, dan pada setiap pentotolan noda dikeringkan
terlebih dahulu sebelum pentotolan berikutnya. Tujuan dilakukan pentotolan
berulang kali adalah agar noda tampak lebih jelas untuk mempermudah dalam
identifikasi warna. Setiap totolan pada titik A, B, C, dan S menghasilkan noda-
noda tak berwarna. Noda-noda pada plat KLT ini berfungsi sebagai fasa diam yang
akan dielusi oleh eluen yang sudah dibuat pada percobaan pertama.

Setelah selesai persiapan plat KLT, selanjutnya kami memasukkan plat KLT
yang sudah diberi tali pada bagian ujungnya ke dalam chamber/lemari
kromatografi hingga bagian bawah kertas kromatografi telah tercelup eluen tetapi
tidak sampai melebihi batas bawah yang telah diberikan tanda sebelumnya, karena
apabila melebihi batas bawah eluen dapat mengganggu arah pergerakan sampel
dan menggantungkan tali pada mulut chamber kemudian menutup kembali
chamber dengan kaca sampai rapat. Tujuannya adalah agar proses elusi oleh eluen
(fasa gerak) dapat berjalan dengan baik/sempurna. Selanjutnya mengamati proses
kromatografi, yaitu terjadinya perambatan eluen pada plat KLT hingga mencapai
batas atas. Setelah eluen mencapai batas atas plat KLT, maka selanjutnya plat KLT
dikeluarkan dari chamber dan kemudian dimasukkan kedalam oven pada suhu
1100C selama 5 menit (sampai kering), setelah 5 menit plat KLT dikeluarkan dari

18
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

oven lalu disemprot dengan larutan ninhidrin. Langkah ini dilakukan berulang kali
sampai noda asam amino yang berwarna dapat terlihat jelas. Namun dalam
percobaan kami kali ini, kami melakukannya dua kali penyemprotan dikarenakan
warna pada penyemprotan pertama belum tampak jelas sehingga kami semprotkan
lagi terus dioven lagi. Dengan hasil yang kedua baru kita mendapat warna jingga
Pengeringan yang kedua tersebut untuk menyempurnakan reaksi yang terjadi
selama deteksi noda dan mengoptimalkan pemunculan kompleks biru-violet yang
dihasilkan dari amina dari asam amino yang bereaksi dengan ninhydrin selain itu
lamanya waktu pengeringan juga menjadi factor penting bahwa pemunculan noda
akan semakin terlihat, muncul noda-noda asam amino berwarna jingga hal ini
tidak sesuai teori yang ada karena kontaminasi yang terjadi pada eluen karena
sedikit saja perubahan yang terjadi pada eluen maka sehingga warna yang
dihasilkan tidak muncul dan hasilnya tidak sesuai dengan teori dan kemungkinan
kontaminan asam amino karena ninhydrin akan membentuk kompleks warna
jingga ketika bereaksi dengan asparagine. Warna jingga ini dihasilkan dari prolin
karena adanya substitusi gugus α-amino..Fungsi dari penyemprotan larutan
ninhidrin adalah sebagai penampak noda, karena disini ninhidrin akan bereaksi
dengan asam amino menghasilkan senyawa berwarna ungu ruherman. Kompleks
biru-violet ini disebabkan karena molekul ninhidrin dan hidrindantin yang yang
bereaksi dengan NH3 setelah asam amino tersebut dioksidasi. Asam amino bereaksi
dengan ninhidrin membentuk aldehida dengan satu atom C lebih rendah dan
melepaskan molekul NH3.

Reaksi :
O
O O
H
C
OH
C + H2N C COO- N + RCHO + CO2 + 3H2O +H+
OH
C
R
-
O O O

Ninhidrin Asam Amino Anion Ungu

Langkah selanjutnya adalah menghitung nilai Rf, pertama memberi tanda pada
noda yang terdapat pada plat KLT dengan menggunakan pensil untuk
mempermudah proses pengukuran. Selanjutnya mengukur jarak tempuh noda dan
jarak tempuh pelarut dengan menggunakan penggaris. Setelah diperoleh hasil
pengukuran, kemudian dihitung nilai Rf pada tiap-tiap noda dengan menggunakan
rumus berikut :
19
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

Dari hasil pengukuran dan perhitungan diperoleh data sebagai berikut :

Noda Jarak tempuh Jarak tempuh Nilai Rf Nilai Rf
noda pelarut dalam dalam teori
percobaan
Titik A 1,2 cm 8,5 cm 0,141176 0,11
(histidin)
Titik B 1,4 cm 8,5 cm 0,164705 0,26
(glisin )
Titik C 0,8 cm 8,5 cm 0,094117 0,4
(sistein)
Titik sampel 1,9 cm 8,5 cm 0,2235 -

IX. KESIMPULAN
1. Pada pembuatan larutan pengemulsi terjadi reaksi esterifikasi, dimana n-
butanol bereaksi dengan asam asetat glasial menghasilkan ester.
2. Larutan sampel yang diuji mengandung asam amino glisin, karena memiliki
nilai Rf 0,164705 yang besarnya mendekati Rf pada asam amino glisin yaitu
0,2235
X. JAWABAN PERTANYAAN
1. Apakah keuntungan dan kerugian dalam metode pemisahan dengan kromatografi
lapis tipis (KLT)?
 Keuntungan metode pemisahan dengan kromatografi lapis tipis (KLT):
- Dihasilkannya pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi,
dan dapat dilaksanakan dengan lebih cepat (Adnan, 1997).
- KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis
- Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,
fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
- Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau
dengan cara elusi 2 dimensi.
- Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
- Hanya membutuhkan sedikit pelarut.

20
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

- Biaya yang dibutuhkan terjangkau

- Jumlah perlengkapan sedikit
- Preparasi sampel mudah
- Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipit dan hidrokarbon) yang
tidak dapat dilakukan dengan metode kromatografi kertas (Gandjar dan
Rohman, 2007).
 Kerugian metode pemisahan dengan kromatografi lapis tipis (KLT):
- Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak noda
yang diharapkan.
- Butuh sistem trial and error untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
- Memerlukan waktu yang cukup lama (Gandjar dan Rohman, 2007).

2. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisis kuantitatif?

Kromatografi lapis tipis (KLT) dapat digunakan untuk analisis kualitatif maupun
analisis kuantitatif. Mekanisme pemisahan komponen berdasarkan adsorbsi atau
partisi. Penentuan kadar analit dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT.
Penetapan kadar dapat dilakukan dengan cara:
1. Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding yang
diketahui konsentrasinya.
2. Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap konsentrasi
dari satu seri larutan baku pembanding. Kurva yang terbentuk harus linear,
kemudian dengan persamaan garis regresi dapat ditentukan kadar analit
(Sastroharmidjojo, 1985).
3. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf?
- Pelarut
Disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang
sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan harga Rf.
- Suhu
Perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
- Ukuran dari bejana
Volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi
mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut. Jika
bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan-
perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas atau pelat, maka koefisien partisi

21
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan komposisi mempengaruhi
harfa Rf.
- Komponen penyusun kertas atau pelat kromatografi
Komponen penyusun kertas atau pelat dapat mempengaruhi kecepatan aliran dan
juga mempengaruhi keseimbangan partisi.
- Sifat dari campuran
Berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari
dari fase diam dan fase gerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik
dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf (Sudjadi, 1998).
.
XI. DAFTAR PUSTAKA
Adnan M. 1997. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Yogyakarta :
ANDI

Anna, Poedjiadi. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : UI-Press.

Gandjar, IG dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka

Pelajar.

Iskandar, Yusuf. 2007. Karakteristik Zat Metabolit Sekunder dalam Ekstrak Bunga
Krisan (Chrysanthemum cinerariaefolium) Sebagai Bahan Pembuatan
Biopestisida. Semarang : FMIPA.

Matsjeh, Sabirin, Hardjono Sastrihamidjojo dan Respati Sastrosajdono. 1996. Kimia

Organik II. Jakarta : Depdikbud.

Sastroharmidjojo H. 1985. Kromatografi. Yogyakarta : Penerbit Liberty.

Sudjadi. 1998. Metode Pemisahan. Yogyakarta : Penerbit Kanisius

Tim Dosen Kimia. 2017. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya : Unesa.

Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisik untuk Paramedis. Yogyakarta : ANDI.

22
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

LAMPIRAN FOTO

No. Foto Keterangan

1. Alat yang digunakan dalam
praktikum

2. Larutan asam amino yang

digunakan

. 3. chamber yang digunakan untuk

mengelusi kertas kromatografi

4. Kertas kromatografi setelah diberi

tanda dengan 4 titik yang berbeda

23
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

5. Setelah diberi tanda kertas

kromatografi di oven selama 5
menit pada suhu 105-1100 C

6. Proses penotolan pada kertas

kromatografi

7. Kertas kromatografi yang sudah

ditotoli 4 larutan masing-masing
sebanyak 3x

8. Kemudian kertas kromatografi

dijepit dan dimasukkan ke dalam
chamber

24
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

9. Ditunggu hingga mengalami elusi

sampai tanda batas

10. Setelah sampai tanda batas

kemudian dioven selama 5 menit
pada suhu 105-1100 C

11. Kertas kromatografi setelah di

keringkan dalam oven selama 5
menit

25
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

12. Kemudian disemprotkon ninhidrin

hingga rata

13. Kemudian dikeringkan kembali

14. Terbentuk noda setelah di oven

26
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

15. Noda setelah diberi tanda agar

terlihat untuk penghitungan nilai
Rf.

27
 PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

LAMPIRAN PERHITUNGAN

Diketahui :

Jarak tempuh pelarut = 8,5 cm

Jarak tempuh noda pada titik A = 1,2 cm

Jarak tempuh noda pada titik B = 1,4 cm

Jarak tempuh noda pada titik C = 0,8 cm

Jarak tempuh noda pada titik S = 1,9 cm

Jawab :

- Pada titik A (larutan sistein)

- Pada titik B (larutan histidin)

- Pada titik C (larutan glisin)

- Pada titik S (larutan sampel)

28
PENENTUAN JENIS ASAM AMINO DALAM SAMPEL

29