1.

JUDUL PERCOBAAN : Penentuan Kadar Protein Kerang

Kepah dengan Metode Biuret
2. WAKTU PERCOBAAN : Rabu, 10 Oktober 2018
3. TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan kadar protein dalam sampel kerang
kepah (Polymedosa erosa) dengan menggunakan
metode biuret.
4. DASAR TEORI
Protein
Protein merupakan unit penyusun utama tubuh. Protein juga merupakan
suatu polimer yang mempunyai monomer suatu asam amino. Asam amino
sendiri merupakan senyawa kimia yang mengandung dua gugus fungsi yang
berbeda. Sehinggareaksi identifikasi suatu protein tidak jauh dari reaksi kedua
gugus fungsi tersebut. Salah satu identifikasi protein adalah dengan cara
denaturasi protein (perubahan struktur protein).

Protein merupakan suatu polipeptida dengan berat molekul yang sangat

bervariasi dari 5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang
besar, protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas
biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari
protein seperti panas, asam, basa, solven organik, garam, logam berat, radiasi
sinar radioaktif (Sudarmadji, 1996).
Protein berasal dari bahasa yunani yaitu proteos, yang bearti yang utama
atau yang di dahulukan. Kata ini diperkenalkan oleh ahli kimia Belanda,
Geraldus Mulder (1802-1880). Ia berpendapat bahwa protein adalah zat yang
paling penting dalam setiap organisme (Ellya, 2010).

Protein merupakan zat gizi yang sangat penting, karena yang paling erat
hubungannya dengan proses-proses kehidupan. Nama protein berasal dari
bahasa Yunani (Greek) proteus yang berarti “yang pertama” atau “yang
terpenting”. Seorang ahli kimia Belanda yang bernama Mulder, mengisolasi
susunan tubuh yang mengandung nitrogen dan menamakannya protein, terdiri
dari satuan dasarnya yaitu asam amino (biasa disebut juga unit pembangun
protein) (Suharjo & Clara, 1992).

1
 Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh,
karena zat ini disamping berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur,
Protein adalah sumber asam- asam amino yang mengandung unsur C, H, O
dan N yang tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat. Molekul protein
mengandung pula posfor, belerang dan ada jenis protein yang mengandung
unsur logam seperti besi dan tembaga (Budianto, 2009).

a) Struktur protein

Molekul protein merupakan rantai panjang yang tersusun oleh mata

rantai asam-asam amino. Dalam molekul protein, asam-asam amino saling
dirangkaikan melalui reaksi gugusan karboksil asam amino yang satu dengan
gugusan amino dari asam amino yang lain, sehingga terjadi ikatan yang
disebut ikatan peptida. Ikatan pepetida ini merupakan ikatan tingkat primer.
Dua molekul asam amino yang saling diikatkan dengan cara demikian disebut
ikatan dipeptida. Bila tiga molekul asam amino, disebut tripeptida dan bila
lebih banyak lagi disebut polipeptida. Polypeptida yang hanya terdiri dari
sejumlah beberapa molekul asam amino disebut oligopeptida. Molekul
protein adalah suatu polypeptida, dimana sejumlah besar asam-asam
aminonya saling dipertautkan dengan ikatan peptida tersebut (Garman, 1992).

Molekul protein tersusun dari satuan-satuan dasar kimia yaitu asam

amino. Dalam molekul protein, asam-asam amino ini saling berhubung-
hubungan dengan suatu ikatan yang disebut ikatan peptida (CONH). Satu
molekul protein dapat terdiri dari 12 sampai 18 macam asam amino dan dapat
mencapai jumlah ratusan asam amino (Suharjo & Clara, 1992).

1) Ciri-ciri molekul protein

Beberapa ciri molekul protein antara lain:

a) Berat molekulnya besar, hingga mencapai ribuan bahkan jutaan

sehingga merupakan suatu makromolekul.

2
 b) Umumnya terdiri dari 20 macam asam amino, asam amino tersebut
berikatan secara kovalen satu dengan yang lainnya dalam variasi urutan yang
bermacam-macam membentuk suatu rantai polipeptida.

c) Ada ikatan kimia lainnya

Ikatan kimia lainnya mengakibatkan terbentuknya lengkungan-

lengkungan rantai polipeptida menjadi struktur tiga dimensi protein, sebagai
contohnya yaitu ikatan hidrogen dan ikatan ion.

d) Struktur tidak stabil terhadap beberapa faktor, antara lain, pH, radiasi,
temperatur, dan pelarut organik.

b) Macam-macam Struktur protein

Struktur asam amino dapat dibagi menjadi beberapa bentuk yaitu struktur
primer, sekunder, tersier, dan kuartener.

 Struktur primer ( tingkat satu)

Pada struktur ini urutan asam amino yang menyusun protein

dihubungkan melalui ikatan peptida.

 Struktur sekunder

Merupakan struktur tiga dimensi lokal dari beberapa rangkaian asan

amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen.

 Struktur tesier

Bentuk penyusunan bagian terbesar rantai cabang disebut struktur tersier,

yaitu susunan dari struktur sekunder yang satu dengan struktur sekunder
bentuk lain. Contohnya adalah beberapa protein yang mempunyai bentuk α-
heliks dan bagian yang tidak berbentuk α-heliks. Biasanya bentuk-bentuk
sekunder ini dihubungkan dengan ikatan hidrogen, ikatan garam, interaksi
hidrofobik, dan ikatan disulfida.

 Struktur kuartener

3
 Struktur ini melibatkan beberapa polipeptida dalam membentuk suatu
protein. Ikatan-ikatan yang terjadi sampai terbentuknyaa protein sama dengan
ikatan-ikatan yang terjadi pada struktur tersier (Winarno, 1992).

Sedangkan berdasarkan bentuknya protein dapat dibedakan menjadi:

 Protein globular

Pada protein globular rantai-rantai polipeptida berlipat rapat-rapat

menjadi bentuk globular atau bulat yang padat dan larut dalam air.

Contoh: enzim, protein transport pada darah, antibodi

Gambar: protein globular

 Protein serabut

Pada protein serabut rantai polipetida memanjang pada satu sumbu dan
tidak larut dalam air.

Contoh: α-keratin, fibroin, kolagen

Gambar: protein serabut

4
 c) Fungsi protein

1) Sebagai enzim

Berperan terhadap perubahan-perubahan kimia dalam sistem biologis.

2) Alat pengangkut dan alat penyimpanan

Banyak molekul dengan BM kecil serta beberapa ion dapat diangkut atau
dipindahkan oleh protein-protein tertentu.

3) Pengatur pergerakan

Protein merupakan komponen utama daging, gerakan otot terjadi karena

adanya dua molekul protein yang saling bergeseran.

4) Penunjang mekanis

Kekuatan dan daya tahan robek kulit dan tulang disebabkan adanya
kolagen, suatu protein yang berbentuk bulat panjang dan mudah membentuk
serabut.

5) Pertahanan tubuh

Pertahanan tubuh biasanya dalam bentuk antibodi, yaitu suatu protein

khusus yang dapat mengenal dan menempel atau mengikat benda-benda asing
yang masuk kedalam tubuh seperti virus, bakteri, dan sel-sel asing lain.

6) Media perambatan impuls syaraf

Protein yang mempunyai fungsi ini biasanya berbentuk reseptor,

misalnya rodopsin, suatu protein yang bertindak sebagai reseptor/ penerima
warna atau cahaya pada sel-sel mata.

7) Pengendalian pertumbuhan

Protein ini bekerja sebagai reseptor (dalam bakteri) yang dapat

mempengaruhi fungsi bagian-bagian DNA yang mengatur sifat dan karakter
bahan (Winarno F. , 2004).

5
 d) Sumber protein

Sumber protein dibagi menjadi dua yaitu hewani dan nabati. Sumber
protein hewani dapat berbentuk daging dan alat-alat dalam seperti hati,
pankreas, ginjal, paru, jantung , jerohan. Yang terakhir ini terdiri atas babat
dan iso (usus halus dan usus besar). Susu dan telur termasuk pula sumber
protein hewani yang berkualitas tinggi. Ikan, kerang-kerangan dan jenis
udang merupakan kelompok sumber protein yang baik, karena mengandung
sedikit lemak, tetapi ada yang alergis terhadap beberapa jenis sumber protein
hasil laut ini. Jenis kelompok sumber protein hewani ini mengandung sedikit
lemak, sehingga baik bagi komponen susunan hidangan rendah lemak.
Namun kerang-kerangan mengandung banyak kolesterol, sehingga tidak baik
untuk dipergunakan dalam diet rendah kolesterol. Ayam dan jenis burung lain
serta telurnya, juga merupakan sumber protein hewani yang berkualitas baik.
Harus diperhatikan bahwa telur bagian merahnya mengandung banyak
kolesterol, sehingga sebaiknya ditinggalkan pada diet rendah kolesterol
(Sedioetama, 1985). Sumber protein nabati meliputi kacang-kacangan dan
biji-bijian seperti kacang kedelai, kacang tanah, kacang hijau, kacang koro,
kelapa dan lain-lain. Asam amino yang terkandung dalam protein ini tidak
selengkap pada protein hewani, namun penambahan bahan lain yaitu dengan
mencampurkan dua atau lebih sumber protein yang berbeda jenis asam amino
pembatasnya akan saling melengkapi kandungan proteinnya. Bila dua jenis
protein yang memiliki jenis asam amino esensial pembatas yang berbeda
dikonsumsi bersama-sama, maka kekurangan asam amino dari satu protein
dapat ditutupi oleh asam amino sejenis yang berlebihan pada protein lain.
Dua protein tersebut saling mendukung (complementary) sehingga mutu gizi
dari campuran menjadi lebih tinggi daripada salah satu protein itu.

2. Penetapan Kadar Protein

Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara

kualitatif dan secara kuantitatif. Analisis protein secara kualitatif terdiri atas
reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida,
dan reaksi Sakaguchi. Sedangkan analisis protein secara kuantitatif terdiri

6
dari metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode
spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV.

 Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)

Untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel dapat

menggunakan metode biuret. Metode ini merupakan salah satu cara terbaik
untuk menentukan kadar protein suatu larutan. Dalam larutan basa, Cu2+
membentuk kompleks dengan ikatan peptide suatu protein sehingga
menghasilkan senyawa kompleks Cu yang berwarna ungu dengan absorbansi
maksimum pada 540nm. Absorbansi ini berbanding langsung dengan
konsentrasi protein dan tidak bergantung pada jenis protein karena seluruh
protein pada dasarnya mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama persatuan
berat. Hal-hal yang dapat mengganggu ini adalah adanya urea (mengandung
gugus –CO-NH-) dan gula pereduksi yang bereaksi dengan Cu2+.

Reaksi yang terjadi :

 CuSO4.5H2O + 2 NaOH  Cu(OH)2 + Na2SO4 + 5 H2O

 Cu(OH)2 Cu2+ +2OH-

O C
O C

NH NH

H C R H C R
Cu2+
C O C O

NH NH

H C R H C R

a. Kelebihan

1. Murah

2. Cepat (30 menit)

7
 3. Penyimpangan warna jarang ditemukan dibandingkan dengan metode
lain.

4. Sangat sedikit substansi lain yang terdeteksi

5. N dari non peptide dan non peptide tidak terdeteksi

b. Kelemahan

1. Kurang sensitif dibandingkan lowry

2. Penyerapan warna dapat dipengaruhi oleh pigmen bila ada

3. Konsentrasi tinggi dari garam ammonium dapat menimbulkan reaksi

4. Terjadi variasi warna pada jenis protein yang berbeda, kurang sensitif
terhadap jenis protein karena absorpsi yang terjadi melibatkan ikatan peptida
yang ada di semua protein, bukan pada gugus samping spesifik.

5. Penyimpangan warna dapat terjadi pada larutan bila terdapat kadar

lemak dan karbohidrat yang tinggi

 Metode Spektrofotometri UV

Sifat protein jika dilarutkan dengan asam klorida dan enzim protease
akan menghasilakan asam amino karboksilat. Disisi lain protein dapat
mengalami denaturasi yaitu perubahan struktur protein yang menimbulakn
perubahan sifat fisika, kimia dan biologi bila Protein apabila dipanaskan
dapat mengakibatkan gelombang elektromagnetik tertentu contohnya bisa,
kokain kuman-kuman dan lain-lain.

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisis yang didasarkan pada

pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna
pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator
prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube (Yoky,
2009).Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran
menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut

8
dengan spektrofotometri. Spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah
tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm) dan menggunakan sumber
sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR).
Monokromator pada spektrofotometer menggunakan kisi atau prisma yang
daya resolusinya lebih baik sedangkan detektornya menggunakan tabung
penggandaan foton atau fototube.

Komponen utama dari spektrofotometer, yaitu sumber cahaya, pengatur

Intensitas, monokromator, kuvet, detektor, penguat (amplifier), dan indikator.
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual
dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh
suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh
suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk
komponen yang berbeda.

Metode Spektrofotokopi dengan untraviolet yang yang diserap bukan

cahaya tampak cahaya ultra ungu (Ultraviolet). Dalam Spektrofotokopi ultra
ungu energi cahaya tampak terserap digunakan untuk transfuse electron.
Karena energi Cahaya Ultraviolet dapat menyebabkan transfuse electron.

 Metode Kjeldahl

Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen

total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen.
Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator
yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah
pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara
kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.

1) Kelebihan :

i. Metode Kjeldahl digunakan secara luas di seluruh dunia dan masih

merupakan metode standar dibanding metode lain.

ii. Dapat diaplikasikan pada semua jenis makanan

9
 iii. Tidak mahal (Jika tidak menggunakan autosistem)

iv. Akurat untuk protein kasar

v. Dapat dimodifikasi untuk mengukur jumlah kecil protein

vi. Sifatnya yang universal, presisi tinggi dan reprodusibilitas baik

membuat metode ini banyak digunakan untuk penetapan kadar protein.

2) Kelemahan :

i. Mengukur total N organic, termasuk N yang bukan protein.

ii. Memakan waktu (2 jam)

iii. Protein yang berbeda memerlukan faktor koreksi yang berbeda karena
susunan residu asam amino yang berbeda.

iv. Menggunakan reagen-reagen yang sangat korosif dan prosesnya yang

lumayan berbahaya.

 Metode Titrasi Formol

Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan

formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini
berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi
antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan
tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi
perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.

a. Kelebihan

- Hanya tepat digunakan utnuk menentukan suatu proses terjadinya

pemecahan

- Murah, cepat dan tidak memerlukan keahlian khusus. (Ragensia yang

digunakan sudah sering dijumpai dan mudah untuk didapatkan. Selain itu
titrasi ini menggunakn prinsip titrasi asam-basa yang sudah sering digunakan)

10
 b. Kerugian

- Kurang tepat untuk menentukan jenis protein tertentu.

 Metode Lowry

Pembuatan reagen Lowry A :

Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam fosfomolibdat dengan

perbandingan (1 : 1)

Pembuatan reagen Lowry B :

Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml natrium hidroksida 0,1N.

Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1% dan 1 ml
kalium natrium tartrat 2%.

a. Kelebihan :

1. Sangat sensitive

- 50 – 100x lebih sensitive daripada metode biuret

- 10 – 20x lebih sensitive dari UV absorption method

2. Kurang dipengaruhi oleh turbiditas sampel

3. Lebih spesifik

4. Sederhana, dapat dilakukan 1 – 1,5 jam

b. Kekurangan :

1. Warna bervariasi dihasilkan pada protein yang berbeda

2. Warna tidak terbatas pada konsentrasi protein dan dengan senyawa

fenol dapat membentuk warna biru sehingga bisa menganggu hasil penetapan

3. Reaksi dapat dipengaruhi oleh sukrosa, lipid, buffer phosphate,

monosakarida dan heksoamin, Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan
dengan menghilangkan interferens tersebut. Sangat dianjurkan untuk

11
menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang
disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan
penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan
protein.

Kerang Kepah (Polymesoda erosa)

Kerang kepah merupakan Filum Moluska dalam kelas bivavia yang

hidup diekosistem magrove pada substrat lanau berpasir (sandy slit), dapat
hidup dengan kondisi pH rendah (5,35-6,04) serta flutuasi salinitas yang
besar. Kerang ini mampu bertoleransi pada suhu 0-40ºC. Polymesoda sp.
banyak dijumpai pada substrat yang didominasi vegetasi Derris trifoliata,
Acanthus ilicifolius dan Rhizphora sp. Polymesoda sp. umumnya terdapat
pada daerah beriklim sedang dan tropis (Darussalam, 2012).

Kingdom : Animalia

Phylum : Mollusca

Classis : Bivalvia

Sub Classis : Euheterodonta

Ordo : Veneroidae

Familia : Corbiculidae

Genus : Polymesoda

Species : Polymesoda erosa

Secara umum kerang merupakan kelompok hewan tidak bertulang

belakang dan bentuknya mudah untuk dikenali. Kerang Kepah (Polymesoda
erosa) merupaka salah satu jenis kerang yang bernilai ekonomi dan sangat
potensial untuk dikembangkan karena kerang ini memiliki nilai gizi yang
tinggi. Asikin (1982) dalam Suaniti (2007) menerangkan bahwa kelompok
kerang memiliki kandungan protein sebesar 7,06% - 16,87%, lemak sebesar

12
 0,40-2,47%, karbohidrat sebesar 2,36-4,95% serta memberikan energi sebesar
69-88 kkal/100 gram daging.

5. ALAT DAN BAHAN

ALAT : BAHAN :
1. Spektrofotometer UV-Vis 1 set 1. Larutan standar protein 5 mL
2. Tabung reaksi 7 buah 2. Reagen biuret secukupnya
3. Gelas ukur 10 mL 1 buah 3. Aquades secukupnya
4. Gelas kimia 400 mL 1 buah 4. Sampel kerang kepah 1 gram
5. Pipet volume 10 mL 1 buah
6. Waterbath 1 buah
7. Pipet tetes secukupnya
8. Sentrifuge 1 buah
9. Tabung sentrifuge 1 buah
10. Spatula 1 buah
11. Labu ukur 10 mL 1 buah
12. Mortal dan alu 1 buah

13
6. ALUR PERCOBAAN
a. Persiapan Sampel

1 gram sampel

- Dihancurkan dengan mortal & alu

- + 10mL aquades sedikit demi sedikit
- Dimasukkan dalam sentrifuge
- Disentrifuge pada kecepatan 3500 rpm selama 10 menit
- Didekantasi

Residu Filtrat

- Dimasukkan tabung reaksi

- Diamati
Larutan sampel

b. Pembuatan Larutan Standar

1 ml larutan standar protein denga

kadar 1, 2, 3, 4, 5 (mg)

- Dimasukkan dalam tabung reaksi 1, 2, 3, 4, 5

- + 5mL reagen biuret pada masing-masing tabung reaksi
- Dikocok hingga homogen
- Diinkubasi pada suhu 37ºC selama 10 menit
- Didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit
- Diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 540 nm
Hasil

c. Penentuan Absorbansi Larutan Blanko

14
 1 ml aquades

- Dimasukkan dalam tabung reaksi

- + 5mL reagen biuret
- Dikocok hingga homogen
- Diinkubasi pada suhu 37ºC selama 10 menit
- Didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit
- Diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 540 nm

Hasil

d. Penentuan Absorbansi Larutan Sampel

1 ml latutan sampel

- Dimasukkan dalam tabung reaksi

- + 5mL reagen biuret
- Dikocok hingga homogen
- Diinkubasi pada suhu 37ºC selama 10 menit
- Didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit
- Diukur absorbansinya dengan alat spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 540 nm

Hasil

15
7. HASIL PENGAMATAN
No.
Prosedur Percobaan Hasil Pengamatan Dugaan/Reaksi Kesimpulan
Perc.
1. Persiapan Sampel Sebelum Terbentuk filtrat dan redisu. Filtrat atau latutan
- Ikan kerang kepah: padatan Filtrat berwarna putih keruh sampel kerang
1 gram sampel
berwarna kuning dan residu berwarna kuning kepah berwarna
- Dihancurkan dengan mortal & alu - Aquades: larutan tidak berwarna pudar. putih keruh.
- + 10mL aquades sedikit demi sedikit
- Dimasukkan dalam sentrifuge
- Disentrifuge pada kecepatan 3500 rpm Sesudah
selama 10 menit - Ikan kerang kepih dihancurkan:
- Didekantasi
padatan berwarna kuning pudar
- + 10ml aquades: larutan berwarna
Residu Filtrat kuning pudar dan terdapat

- Dimasukkan endapan kerang kepah

tabung reaksi - Disentrifuge: terbentuk 2 fase
- Diamati yaitu filtrat sampel dan residu
Larutan sampel - Didekantasi:
Filtrat = latutan berwarna putih
keruh

16
 Residu= endapan berwarna
kuning pudar
2. Pembuatan Larutan Standar Sebelum Semakin besar kadar larutan Semakin besar
- Larutan standar protein dengan maka perubahan warnanya kadar larutan
1 mL larutan standar protein denga
kadar 1, 2, 3, 4, 5 (mg): larutan serta nilai absorbansi akan standar protein
kadar 1, 2, 3, 4, 5 (mg)
tidak berwarna semakin pekat dan tinggi. semakin besar juna
- Dimasukkan dalam tabung - Reagen biuret: larutan berwarna Reaksi pembuatan reagen nilai
reaksi 1, 2, 3, 4, 5
biru jernih (+) biuret: absorbansinya.
- + 5mL reagen biuret pada
masing-masing tabung reaksi - CuSO4.5H2O (aq) + 2NaOH Berdasarkan hasil
- Dikocok hingga homogen Sesudah (aq) → Cu(OH)2 (aq) + perhitungan
- Diinkubasi pada suhu 37ºC - Larutan standar protein dengan Na2SO4 (s) + 5H2O (l) diperoleh
selama 10 menit
kadar 1, 2, 3, 4, 5 (mg) + reagen - Cu(OH)2 (aq) ⇌ Cu2+ (aq) + persamaan larutan
- Didiamkan pada suhu ruang
selama 30 menit biuret: 2OH- (aq) standar protein
- Diukur absorbansinya dengan 1mg: lar. berwarna biru jernih yaitu :
alat spektrofotometer UV-Vis
2mg: lar. berwarna ungu jernih (+) Y=0,0416x+0,0474
pada panjang gelombang 540
nm 3mg: lar. berwarna ungu jernih (+) R2=0,9858
4mg: lar. berwarna ungu jernih
Hasil
(++)
5mg: lar. berwarna ungu jernih

17
 (++)
- Diinkubasi: tidak ada perubahan
warna
- Didiamkan: tidak ada perubahan ( aq) + Cu2+(aq) →
warna
- Diukur absorbansinya:
A(1mg) = 0,090
A(2mg) = 0,121
A(3mg) = 0,183
A(4mg) = 0,217
A(5mg) = 0,250
(aq)

18
3. Penentapan Absorbansi Larutan Blanko Sebelum Larutan blanko jika Larutan blanko
- Aquades: larutan tidak berwarna ditambahkan reagen biuret berwarna biru
1 mL aquades - Reagen biuret: larutan berwarna akan berwarna biru. setelah
biru jernih (+) penambahan
- Dimasukkan dalam tabung reagen biuret. Nilai
reaksi
Sesudah absorbansinya 0.
- + 5mL reagen biuret
- Dikocok hingga homogen - Aquades + reagen biuret: larutan
- Diinkubasi pada suhu 37ºC berwarna biru jernih
selama 10 menit ( aq) + Cu2+(aq) →
- Diinkubasi: larutan berwarna biru
- Didiamkan pada suhu ruang
jernih
selama 30 menit
- Diukur absorbansinya dengan - Didiamkan: larutan berwarna biru
alat spektrofotometer UV-Vis jernih
pada panjang gelombang 540
- Diukur absorbansinya:
nm
A=0
Hasil (aq)

19
4. Penetapan Absorbansi Larutan Sampel Sebelum Larutan sampel jika Larutan sampel
- Filtrat sampel: larutan putih keruh ditambahkan reagen biuret kerang kepah
1 mL larutan Sampel - Reagen biuret: larutan berwarna bereaksi positif yaitu memiliki
biru jernih (+) berwarna ungu. absorbansi sebesar
- Dimasukkan dalam tabung 0,123 dengan kadar
reaksi
Sesudah protein sebesar
- + 5mL reagen biuret
- Dikocok hingga homogen - Aquades + reagen biuret: larutan 1,8168%
- Diinkubasi pada suhu 37ºC berwarna biru (-) sedikit keruh
selama 10 menit
- Diinkubasi: larutan berwarna biru
- Didiamkan pada suhu ruang
(-) sedikit keruh ( aq) + Cu2+(aq) →
selama 30 menit
- Diukur absorbansinya dengan - Didiamkan: larutan berwarna biru
alat spektrofotometer UV-Vis (-) sedikit keruh
pada panjang gelombang 540
nm - Diukur absorbansinya:
A = 0,123
Hasil

(aq)

20
Kerang kepah memiliki
kandungan protein sebesar
7,06-16,78% (Suaniti,2007).

21
8. ANALISIS DAN PEMBAHASAN
Pada percobaan ini hal yang pertama dilakukan adalah :
a. Persiapan Sampel
Langkah pertama yaitu 1 gram sampel protein yang dalam percobaan
kali ini berasal dari kerang kepah, dihancurkan menggunkan mortal dan alu.
Kemudian dimasukkan ke tabung sentrifuge dan ditambahkan 10 mL
aquades. Dilanjutkan dengan mensentrifuge sampel dengan kecepatan 3500
rpm selama 10 menit. Lalu disaring agar memperoleh sampel yang murni
tanpa pengotor sehingga tidak mengganggu hasil absorbansinya. Dihasilkan
filtrat berwarna putih dan residu berupa endapan berwarna putih
kekuningan.

b. Pembuatan Kurva Standar

Pada pembuatan kurva standar dilakuka pengenceran menggunakan
rumus M1xV1=M2xV2. Pertama-tama yang dilakukan adalah mengencerkan
larutan standar dalam percobaan kali ini adalah albumin tidak berwarna
dengan konsentrasi 10 mg/mL, dengan cara mengambil 5 mL albumin tidak
berwarna kemudian dimasukkan ke labu ukur 10 mL dan ditambahkan
aquades hingga batas miniscus. Selanjutnya dimasukkan kedalam tabung
reaksi sebagai konsentrasi 5 mg/mL. Larutan pada konsentrasi 5 mg/mL
diambil 8 mL kemudian diencerkan dengan aquades pada labu ukur 10 mL.
Setelah itu dimasukkan kedalam tabung reaksi sebagai konsentrasi 4
mg/mL. Larutan pada konsentrasi 4 mg/mL diambil 7,5 mL kemudian
diencerkan dengan aquades pada labu ukur 10 mL. Setelah itu dimasukkan
kedalam tabung reaksi sebagai konsentrasi 3 mg/mL. Larutan pada
konsentrasi 3 mg/mL diambil 6,67 mL kemudian diencerkan dengan
aquades pada labu ukur 10 mL. Setelah itu dimasukkan kedalam tabung
reaksi sebagai konsentrasi 2 mg/mL. Larutan pada konsentrasi 2 mg/mL
diambil 5 mL kemudian diencerkan dengan aquades pada labu ukur 10 mL.
Setelah itu dimasukkan kedalam tabung reaksi sebagai konsentrasi 1
mg/mL. Dari kelima konsentrasi diambil 1 mL dimasukkan kedalam 5
tabung reaksi yang berbeda. Masing-masing tabung reaksi ditambahkan 5

22
mL reagen biuret. Dalam pereaksi biuret terkandung 3 macam reagen yaitu
reagen yang pertama adalah CuSO+ dalam aquades dimana reagen ini
berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan membentuk
kompleks dengan protein berwarna biru dimana ion kupri Cu2+ dari pereaksi
biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-
ikatan peptida yang menyusun protein dan membentuk senyawa kompleks
yang berwarna ungu atau violet. Reagen yang kedua adalah K-Na-Tartrat
yang berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak
mengendap. Reagen yang ketiga adalah NaOH dimana fungsinya adalah
membuat suasana basa. Suasana basa akan membantu pembentukan
Cu(OH)2 yang nantinya akan menjadi Cu2+ dan 2OH-Persamaan reaksinya
adalah:
CuSO4 (aq) + 2NaOH (aq) → Cu(OH)2 (aq) + Na2SO4(aq) + 5H2O
Cu(OH)2→ Cu2+ + 2OH-

(aq) + Cu2+ (aq) →

(aq)
Didapatkan warna biru jernih (+) pada konsentrasi 1, warna ungu
jernih (+) pada konsentrasi 2 dan 3 mg/mL dan warna ungu jernih (++) pada
konsentrasi 4 dan 5 mg/mL. Dilanjutkan dengan menginkubasi pada suhu
37˚C selama 10 menit. Fungsinya agar protein terdenaturasi dengan
melepasakan hydrogen pada strukturnya sehingga protein dapat bereaksi
secara optimum dengan ion Cu2+. Didapatkan warna biru jernih (+) pada
konsentrasi 1,warna ungu jernih (+) pada konsentrasi 2 dan 3 mg/mL dan

23
warna ungu jernih (++) pada konsentrasi 4 dan 5 mg/mL. Terakhir diukur
nilai absorbansinaya dengan alat spektrofotometer UV-Vis dengan panjang
gelombang 540 nm. Pada percobaan ini, panjang gelombang 540 nm
digunakan sebagai panjang gelombang untuk menganalisis kadar protein di
dalam sampel karena pada panjang gelombang ini terjadi penyerapan cahaya
maksimal pada sampel. Dengan kata lain, pada panjang gelombang ini, sinar
yang dipancarkan oleh spektrofotometer paling banyak diserap oleh sampel.
Oleh karena itu, pengukuran pada panjang gelombang 540 nm ini
menghasilkan pengukuran yang akurat. Semakin tinggi intensitas cahaya
(absorbansi) yang diserap oleh spektrofotometer maka semakin tinggi pula
kandungan protein yang terdapat dalam sampel kerang kepah. Data
absorbansi kelima larutan standar yang diukur dengan panjang gelombang
540 nm sebagai berikut :
Konsentrasi Nilai
Absorbansi
1 mg/mL
0,090
2 mg/mL
0,121
3 mg/mL
0,183
4 mg/mL
0,217
5 mg/mL
0,250
Diubah dalam bentuk grafik :

Grafik Larutan Standar Protein

sehingga didapatkan nilai y = 0,03777x + 0,0881
0.300
y = 0.0416x + 0.0474
0.250 R² = 0.9858
Absorbansi

0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
0 1 2 3 4 5 6
Konsentrasi (mg)

R2 = 0,9858

24
 Persamaan garis singgung tersebut nantinya akan digunakan untuk
menghitung kadar protein dalam larutan sampel.

c. Penetapan Absorbasi Larutan Blanko

Larutan blanko berfungsi sebagai faktor pengurang dari sampel,
karena standar dari sampel tidak murni namun hasil pengenceran. Pada
percobaan ini, 1 mL aquades yang ditambahkan 5 mL reagen biuret
berwarna biru. Setelah ditambahkan dengan reagen biuret larutan blanko
berwarna biru, yang menunjukkan bahwa pada larutan ini tidak terbentuk
senyawa kompleks sehingga tidak berwarna ungu. Tidak terbentuknya
senyawa kompleks ini karena pada larutan blanko tidak mengandung
protein. Kemudian larutan blanko diinkubasi pada suhu 37˚C selama 10
menit, hal ini agar kepekatan larutan maksimal. Selanjutnya larutan blanko
tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Dan
didapatkan absorbansi larutan blanko = 0,00.

d. Penentuan Absorbansi Larutan Sampel

Pada percobaan ini 1 mL filtrate sampel protein kerang kepah

dimasukkan ke tabung reaksi kemudian ditambahkan 5 mL reagen biuret .
Dalam pereaksi biuret terkandung 3 macam reagen yaitu reagen yang
pertama adalah CuSO+ dalam aquadest dimana reagen ini berfungsi sebagai
penyedia ion Cu2+ yang nantinya akan membentuk kompleks dengan protein
berwarna biru dimana ion kupri Cu2+ dari pereaksi biuret dalam suasana
basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang
menyusun protein dan membentuk senyawa kompleks yang berwarna ungu
atau violet. Reagen yang kedua adalah K-Na-Tartrat yang berfungsi untuk
mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Reagen
yang ketiga adalah NaOH dimana fungsinya adalah membuat suasana basa.
Suasana basa akan membantu pembentukan Cu(OH)2 yang nantinya akan
menjadi Cu2+ dan 2OH-Persamaan reaksinya adalah:
CuSO4 (aq) + 2NaOH (aq) → Cu(OH)2 (aq) + Na2SO4(aq) + 5H2O

Cu(OH)2→ Cu2+ + 2OH-

25
 (aq) + Cu2+ (aq) →

(aq)

Kemudian larutan sampel diinkubasi pada suhu 37˚C selama 10 menit

untuk memaksimalkan reaksi antara Cu2+ dengan protein. Kemudian larutan
sampel protein tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540
nm didapatkan absorbansi 0,123

Dari kurva larutan standar protein didapatkan persamaan kurva

standarnya yaitu y = 0,0416x + 0,0474. Persamaan ini yang akan kita
gunakan untuk menghitung kadar protein dalam larutan sampel, dengan
perhitungan :

y = 0,0416x + 0,0474

dimana y = absorbansi sampel

x = kadar protein dalam sampel

Y = 0,0377 x + 0,0881
0,265 = 0,0377 x + 0,0881
0,123 − 0,0474
𝑥= = 1,8173 𝑚𝑔/𝑚𝑙
0,0416

26
 Perhitungan %kadar protein pada sampel :
1,0003 𝑔𝑟𝑎𝑚 1000,3 𝑚𝑔
 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 = = = 100,03 𝑚𝑔/𝑚𝑙
10 𝑚𝑙 10 𝑚𝑙

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
 %kadar = 𝑥 100%
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

1,8173 𝑚𝑔/𝑚𝑙
%kadar = 𝑥 100%
100,03 𝑚𝑔/𝑚𝑙
= 1,8168%
Hal ini sesuai dengan teori dari kadar protein.
9. KESIMPULAN
Dari hasil percobaan diperoleh konsentrasi protein dalam sampel kerang kepah
sebesar 1,8173 mg/mL dan Kadar protein pada sampel tempe dalam persen
per 100 gram = 1,8168%.
10. JAWABAN PERTANYAAN
1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi! Dengan bantuan kurva
standar tersebut, tentukan kadar protein sampel!

Grafik Larutan Standar Protein

0.300
y = 0.0416x + 0.0474
0.250
R² = 0.9858
0.200
Absorbansi

0.150

0.100

0.050

0.000
0 1 2 3 4 5 6
Konsentrasi (mg)

Kadar protein pada sampel dapat ditentukan dengan menghitung dari

konsentrasi saat pengujian UV-Vis, dengan mensubstitisi persamaan
regresi yang telah didapat perhitungan sebagai berikut :
Y (absorbansi sampel) = 0,123
X (konsentrasi protein)

27
  Y = 0,0416x + 0,0474
0,123 = 0,0416x + 0,0474
0,123 − 0,0474
𝑥= = 1,8173 𝑚𝑔/𝑚𝑙
0,0416
1,0003 𝑔𝑟𝑎𝑚 1000,3 𝑚𝑔
 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 = = = 100,03 𝑚𝑔/𝑚𝑙
10 𝑚𝑙 10 𝑚𝑙

Perhitungan %kadar protein pada sampel :

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
%kadar = 𝑥 100%
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
1,8173 𝑚𝑔/𝑚𝑙
%kadar = 𝑥 100%
100,03 𝑚𝑔/𝑚𝑙
= 1,8168%

2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret?

Jika benar demikian, bagaimana menemukan kadar protein yang tercampur
dengan peptida ?
Jawab:
Peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret. Untuk
menemukan kadar protein yang tercampur dengan peptida yaitu dengan
melakukan uji protein dengan metode biuret. Metode biuret bertujuan
untuk menguji adanya ikatan peptida pada protein yang akan diuji. Dalam
reaksi ini sampel protein ditambahkan beberapa tetes larutan CuSO4 dan
ditambah larutan NaOH sehingga akan menghasilkan larutan yang
berwarna merah kemudian berubah menjadi warna ungu. Dalam keadaan
basa, dengan metode biuret akan memberikan warna violet dengan adanya
senyawa CuSO4.

11. DAFTAR PUSTAKA

Budianto, A. K. (2009). Dasar-dasar Ilmu Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka.
Ellya, E. S. (2010). Gizi Dalam Kesehatan Reproduksi. Jakarta: Trans Info
Media.
Garman, M. (1992). Ilmu Pangan. Yokyakarta: Gajah Mada University.
Handbook of Indigenous Fermented Foods, ed. K.H., Steinkraus dkk. Marcel-
Dekker Inc., NY. Hal 1-94.

28
Indrasti, N. S. (2003). Pedoman Pengolahan Kacang Tanah. Jakarta: Erlangga.
Ketaren, S. (1986). Minyak dan Lemak Pangan. Jakarta: Universitas Indonesia
Press.
Lehninger, Albert. 1982. Principles of Biochemistry third book. Maryland:
Worth Publisher. inc. (terj: Thenawijaya, Maggy. Dasar-Dasar Biokimia
jilid 3. Jakarta: Penerbit Erlangga).
RI, D. G. (1988). Daftar Komposisi Bahan Pangan. Jakarta: Universitas
Indonesia Press.
Sedioetama, A. D. (1985). Ilmu Gizi Jilid I. Jakarta: Penerbit Dian Rakyat.
Suaniti, N.M. 2007. Pengaruh EDTA Dalam Penentuan Kandungan Timbal
dan Tembaga Pada Kerang Hijau (Mytilus viridis). Laboratorium Kimia,
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universita Udayana Denpasar Bali. Vol.2 No. 1.
Sudarmaji, Slamet , dkk. 2007. Analisis bahan Makanan dan Pangan. Penerbit
Liberty.
Suharjo, & Clara, M. K. (1992). Prinsip-prinsip Ilmu Gizi. Yokyakarta:
Kasinius.
Suprapto, J. (2001). Stastik Teori dan Aplikasi. Jakarta: Erlangga.
Suryono H. 2006. Daya dan Kestabilan Buih Putih Telur Itik Tegal dengan
Penambahan Asam Asetat pada Umur Simpan yang Berbeda [skripsi].
Bogor: Program Studi Teknologi Hasil Ternak. Fakultas Peternakan
Institut Pertanian Bogor.
TIM. 2014. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: UNESA University Press.
Winarno, F. (2004). Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka.
Winarno. (1992). Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka.

29
12. Lampiran

Lampiran (Perhitungan)

1. Pembuatan laturan standar protein

a. 𝑉1 𝑥 𝑀1 = 𝑉2 𝑥 𝑀2 b. 𝑉1 𝑥 𝑀1 = 𝑉2 𝑥 𝑀2
𝑉1 𝑥 10 𝑚𝑔 = 10 𝑚𝑙 𝑥 5 𝑚𝑔 𝑉1 𝑥 5 𝑚𝑔 = 10 𝑚𝑙 𝑥 4 𝑚𝑔
10 𝑚𝑙 𝑥 5 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙 𝑥 4 𝑚𝑔
𝑉1 = 𝑉1 =
10 𝑚𝑔 5 𝑚𝑔
𝑉1 = 5 𝑚𝑙 𝑉1 = 8 𝑚𝑙

c. 𝑉1 𝑥 𝑀1 = 𝑉2 𝑥 𝑀2 d. 𝑉1 𝑥 𝑀1 = 𝑉2 𝑥 𝑀2
𝑉1 𝑥 4 𝑚𝑔 = 10 𝑚𝑙 𝑥 3 𝑚𝑔 𝑉1 𝑥 3 𝑚𝑔 = 10 𝑚𝑙 𝑥 2 𝑚𝑔
10 𝑚𝑙 𝑥 3 𝑚𝑔 10 𝑚𝑙 𝑥 2 𝑚𝑔
𝑉1 = 𝑉1 =
4 𝑚𝑔 3 𝑚𝑔
𝑉1 = 7,5 𝑚𝑙 𝑉1 = 6,67 𝑚𝑙

e. 𝑉1 𝑥 𝑀1 = 𝑉2 𝑥 𝑀2
𝑉1 𝑥 2 𝑚𝑔 = 10 𝑚𝑙 𝑥 1 𝑚𝑔
10 𝑚𝑙 𝑥 1 𝑚𝑔
𝑉1 =
2 𝑚𝑔
𝑉1 = 5 𝑚𝑙

2. Kadar protein dalam sampel kerang kepah

Diketahui:

larutan konsentrasi absorbansi

standar 1 1 mg 0,090
standar 2 2 mg 0,121
standar 3 3 mg 0,183
standar 4 4 mg 0,217
standar 5 5 mg 0,250

30
 Grafik Larutan Standar Protein
0.300
y = 0.0416x + 0.0474
0.250 R² = 0.9858
Absorbansi

0.200
0.150
0.100
0.050
0.000
0 1 2 3 4 5 6
Konsentrasi (mg)

Y (absorbansi sampel) = 0,123

X (konsentrasi protein)

Jawab:
 Y = 0,0416x + 0,0474
0,123 = 0,0416x + 0,0474
0,123 − 0,0474
𝑥= = 1,8173 𝑚𝑔/𝑚𝑙
0,0416

1,0003 𝑔𝑟𝑎𝑚 1000,3 𝑚𝑔

 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 = = = 100,03 𝑚𝑔/𝑚𝑙
10 𝑚𝑙 10 𝑚𝑙

𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
 %kadar = 𝑥 100%
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

1,8173 𝑚𝑔/𝑚𝑙
%kadar = 𝑥 100%
100,03 𝑚𝑔/𝑚𝑙
= 1,8168%

31
 Lampiran Foto

1. Persiapan alat dan bahan

Persiapan sampel

1. Sampel kerang dihancurkan 2. Ditambahkan 1 mL aquades

dimasukkan ke tabung
sentrifuge

3. Disentrifuge pada 3500 rom 4. Terdapat filtrate dan residu

32
Penentuan kurva standar

1. Larutan stadar protein mg/mL 2. Larutan standar protein 10

dimasukkan ke labu ukur 10 mL mg/mL diencerkan secara
lalu ditambahkan aquades bertingkat menjadi larutan
sampai batas meniscus protein dengan konsentrasi 1
mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4
mg/mL. 5 mg/mL

3. Ditambah 5mL reagen biuret 4. Diinkubasi pada suhu 37ºC

pada masing-masing tabung selama 10 menit. Lalu
reaksi
didiamkan selama 15 menit.

33
 5. Diukur absorbansinya pada λ
540 nm dengan
spektrofotometer UV-Vis

Pembuatan larutan blanko

1. 1 mL aquades dimasukkan ke 2. Ditambahkan 5mL reagen

tabung reaksi biuret

3. Diinkubasi pada suhu 37ºC 4. Dimasukkan ke

selama 10 menit. Lalu spektrofotometer UV-Vis untuk
didiamkan selama 15 menit. kalibrasi

Penentuan absorbansi larutan sampel

1. 1 mL filtrat sampel 2. Diinkubasi pada suhu 37ºC

34
 ditambahkan 5 mL reagen selama 10 menit. Lalu
biuret. Lalu dikocok. didiamkan selama 15 menit.

3. Diukur absorbansinya dengan

alat spektrofotometer UV-Vis
pada panjang gelombang 540
nm.

35