PENGEMBANGAN DAN VALIDASI

METODE PENENTUAN PESTISIDA

PADA KACANG KEDELAI
MENGGUNAKAN LC-MS / MS

OLEH :
INEKE AYUNINGSIH KAHA
YULINDA SEPRIANY BILI
YOVITA SURYANI
JUTAWANTI SAU
 PENDAHULUAN
Pestisida terdiri dari sejumlah besar senyawa,dengan
sifat fisikokimianya sangat beragam. Pestisida dapat
digunakan di berbagai tahap pada tanaman budidaya,
untuk memberikan perlindungan terhadap hama,
memperpanjang daya simpan selama pasca panen dan
melestariakn kualitasnya. Namun penggunaan pestisida
dapat menghasilkan residu yang melibatkan risiko
terhadap lingkungan dan kesehatan manusia. Untuk
menjamin keselamatan pangan dan pakan dan untuk
mengatur perdagangan Internasional, Uni Eropa secara
maksimal telah membentuk batas residu (MRL) untuk
meminimalkan adanya tingkat residu pestisida dalam
bahan makanan yang berbeda.
Penelitian ini meliputi pengembangan dan validasi
metode untuk penentuan pestisida pada kacang kedelai
menggunakan LC-MS/MS, dengan tujuan utamanya
yaitu untuk mencapai tingkat pengukuran
ketidakpastian yang tepat. Pestisida yang ditargetkan
yaitu metomil, imidakloprid, carbendazim, malaoxon,
thiodicarb, malathion, iprodione, tebuconazole,
diazinon dan klorpirifos. Pestisida ini dipilih dengan
memperhatikan sejumlah aspek seperti sifat
fisikokimia, representasi dari family pestisida yang
berbeda, dan frekuensi penggunaan atau ketersediaan
komersialnya. untuk meningkatkan kebersihan sampel
ekstrak yaitu dengan menggunakan metode QuEChERS
agar bisa beradaptasi terhadap pestisida yang dipilih.
 TINJAUAN PUSTAKA

Apa itu LC_MS ????

Liquid Chromatograpy – Mass Spectroscopy
adalah dua alat yang digabungkan menjadi satu,
yang berfungsi untuk memisahkan beberapa
senyawa atau campuran senyawa berdasarkan
kepolarannya (prinsip kerja kromatografi),
dimana setelah campuran senyawa tersebut
terpisah, maka senyawa yang murni akan
diidentifikasi berat molekulnya. Data yang
didapatkan adalah berat molekul ditambah
beberapa muatan dan berat molekul pelarut.
 Adapun cara kerja liquid chromatograpy adalah sama
dengan HPLC atau liquid chromatograpy lain, adalah :
1. Analit bersama dengan eluen dari syringe pump atau LC
masuk ke dalam cappilary. Di dalam cappilary terdapat
anoda (kutup negatif) pada taylor cone dan katoda
(kutup positif) di dekat masukan analit dan eluen. Kutub
ini berfungsi agar muatan yang berkumpul pada taylor
cone adalah muatan positif sehingga nantinya saat
terjadi penyemprotan dan terbentuk droplet (tetes –
tetes) tidak bergabung – gabung menjadi droplet yang
lebih besar lagi.
2. Analit dan solven(eluen) disemprotkan melalui taylor
cone.
3. Droplet yang mengalami coulombic exsploison
tersebut akan masuk ke dalam cone dimana di sisi
kiri dan kanannya sudah mengalir gas Nitrogen (N2)
Sedangkan kerja Mass spectroscopy metode
ESI adalah sebagai berikut :
1.
Proses pemisahan analite pada
Liquid Chromatograpy sampai
dengan sprayer (penyemprotan
oleh spray needle tip)
2.

Proses Setelah
analite dipisahkan
oleh Liquid
Cromatography
3.
Proses Droplet
berubah menjadi
analyte yang siap
untuk di mass
spectroscopy
4.

Contoh spektra dan

hasil
 BAHAN DAN METODE
a. Bahan dan pereaksi

 Zat kalibrasi metomil (99,5%),

 imidakloprid (99,0%),
 malaoxon (98,0%),
 thiodicarb (99,0%) Carbendazim (98,0%),
 malathion (97,2%),
 iprodione (99,3%),
 tebuconazole (99,6%),
 diazinon (98,3%) dan klorpirifos (99,5%)
 Asetonitril (MeCN) dan metanol (MeOH) untuk LC-MS
 Asam format (98%) dan senyawa isotop berlabel
 amonium format dan asetat (≥ 99%)
 NaCl
 asam asetat ( ≥99%) dan MgSO4
 Instrumen

Agilent HP-1200 series yang beresolusi cepat HPLC

(Agilent Technologies, Wald- Bronn, Jerman) dilengkapi
dengan pompa biner, degasser online, thermostated
autosampler, dan thermostatted kompartemen kolom
Pemisahan dilakukan menggunakan Kinetex-C18 dari 150
mm x 4,6 mm id, 2,6 µm ukuran partikel kolom analisa
sejalan dengan filter 0,5 µm porositas x 0,1 mm id (dari
Phenomenex, Bester B.V., Amstelveen, Belanda).
spektrometer massa kuadrupol tiga 3200 QTRAP (Applied
Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) yang dioperasikan
dalam konfigurasi kuadrupol tiga, dengan set Q1 dan Q2
pada resolusi satuan.
 Cara kerja
Pembuatan larutan
kalibrasi
prosedur perawatan
sampel
Analisis LC-MS/MS
a. Pembuatan larutan kalibrasi

1. Persediaan
larutan individual
dari kedua pestisida
asli dan isotop
berlabel
b. prosedur perawatan sampel
 c. Analisis LC-MS/MS

Untuk mengoptimalkan kondisi MS/MS pada setiap analit, percobaan

dilakukan dengan menginfus langsung larutan standar individu dari 1 µg mL-1
dari masing-masing pestisida (kecuali untuk iprodione, yang diresapi pada 5
µg mL-1) dalam air asetonitril-ultra murni 1:1 v/v, yang mengandung 0,1%
asam format. Infus dilakukan dengan menggunakan pompa jarum suntik
(Harvard Apparatus, Kent, UK) dengan laju alir 10 mL per 1 menit.
Instrumen parameter yang dijadwalkan MRMs dengan jendela deteksi 100 s,
pada target waktu 0,5 s, memungkinkan diperolehannya 15 poin data per
puncak, dan jeda antara rentang massa 5 ms. Sumber ion elektro
(Turboionspray) dioperasikan dalam modus positif. Antarmuka pemanas
ditetapkan pada 120 OC, suhu penyelidikan di 600 OC dan tegangan kapiler 3
kV sudah diterapkan. Nitrogen dan gas digunakan sebagai tirai nebulizer (GS1
dan GS2) masing-masing pada 20, 40 dan 50 psi, serta tabrakan gas (CAD)
berada di 9 psi.
Validasi metode
Lanjutan tabel
 HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimalisasi dari kondisi LC-MS / MS

Gambar 1. Gabungan kromatogram HPLC-MS dari campuran standar pestisida pada 0,1 mg kg-1 untuk metomil, thiodicarb dan
Tebuconazole; 0,05 mg kg-1 untuk Imidakloprid, Malaoxon, klorpirifos dan carbendazim; 0,02 mg kg-1 untuk malathion, iprodione
dan diazinon BMR (carbendazim 0.2 x BMR dan iprodione 2 x MRL). Merah: 0,1% asam format dan biru: 2.5 mM amonium format.
Kondisi yang lain seperti dijelaskan di bagian eksperimental.
Gambar 2. Pengaruh pengubah yang ditambahkan pada fase gerak
(H2O-MeOH) pada respon analitis.
Gambar 3. Kromatogram sampel kedelai dibubuhi pestisida yang dipilih (0,1 mg kg-1)
untuk metomil, thiodicarb dan tebuconazole; 0,05 mg kg-1 untuk imidacloprid, malaoxon,
klorpirifos dan carbendazim; 0,02 mg kg-1 untuk malathion, iprodione dan diazinon). pada
levels konsentrasi BMR.
LOD dan LOQ
 kesimpulan
Dalam penelitian ini metode LC-MS/MS yang sederhana dan
akurat akan menentukan 10 analit pestisida yang dipilih
dalam kacang kedelai yang telah dikembangkan dan
divalidasi. Sebuah langkah pembersihan menggunakan Florisil
dalam hubungannya dengan C18 dan PSA terbukti efisien
untuk meminimalkan efek matriks, dan penerapan
spektrometri massa cairan isotop memungkinkan kuantifikasi
yang akurat. Validasi yang penuh dilakukan sesuai dengan
standar ISO/IEC 17025 dan pedoman DG SANCO,
menunjukkan pemulihan yang sangat baik (86-103%) dan
presisi (U < 10,4%). Hasil ini mengkonfirmasikan bahwa
kesesuaian metode yang akan diterapkan untuk penilaian
homogenitas dan stabilitas selama penelitian karakterisasi
yang diperlukan dalam pengembangan bahan referensi yang
bersertifikat.
THANK YOU