21

BAB III
METODE PENELITIAN

A. Alat dan Bahan
1. Bahan
Sampel Parfum, larutan standar DBP (dibuthyl phthalate) dan DEP (diethyl
phthalate) p.a (Sigma Aldrich), aquabidestt steril pro injection (Ikapharmindo
Putramas), metanol grade HPLC (Merck), asetonitril grade HPLC (J.T Baker), 2-
propanol p.a (J.T Baker), heksan p.a (J.T Baker).
2. Alat
Seperangkat alat HPLC (Waters e2695), detektor UV -Vis (Waters 2475),
kolom C
18
(150 mm x 4,6 mm) 5 m (Sunfire

), corong, erlenmayer (Iwaki pyrex),

timbangan analitik (Mettler Toledo 0,00001 g XS205), ultrasonic bath (Branson 5510),
seperangkat alat gelas (Iwaki pyrex), labu takar 500 mL (Iwaki pyrex), labu takar 50
mL (Iwaki pyrex), labu takar 25 mL (Iwaki pyrex), labu takar 10 mL (Iwaki pyrex),
pipet ukur 5 mL (Iwaki pyrex), pipet ukur 2 mL (Iwaki pyrex), pipet ukur 1 mL (Iwaki
pyrex), pipet tetes, propipet, kertas saring, solvent filtration membrane 0,45 m (MS

),
vakum (Gast) dan corong Buchner (semua alat dicuci dengan air dan metanol, tidak
digunakan alat berbahan plastik).

B. Cara Penelitian
1. Desain percobaan
Penelitian ini diawali dengan membuat desain percobaan. Proses ini dimaksud
untuk mendapatkan metode atau sistem yang baik agar mampu mendeteksi maupun
mengkuantifikasi campuran DEP dan DBP dalam sampel parfum. Modifikasi yang
pertama dilakukan adalah optimasi fase gerak. Desain yang dirancang didasari atas
desain faktorial 2
2
, yaitu dengan merancang empat kemungkinan komposisi fase gerak.
Selanjutnya akan dipilih sistem terbaik dan dapat dilakukan validasi.



22


Tabel I. Desain pengembangan metode
Desain Fase Gerak
Indeks
Polaritas
Desain
pengembangan 1
Aquabidestt : asetonitril : 2-propanol : methanol
(50 :34 : 13 : 3)

7,36
Desain
pengembangan 2
Aquabidestt : asetonitril : 2-propanol : methanol
(30 :45 : 20 : 5)

6,68
Desain
pengembangan 3
Aquabidest : asetonitril : 2-propanol : methanol
(25 :50 : 20 : 5)

6,54
Desain
pengembangan 4
Aquabidest : asetonitril : 2-propanol : methanol
(15 :55 : 25 : 5)

6,16
Sistem KCKT di atur dalam kondisi yang sama, kolom C
18
, kecepatan alir
1ml/menit, dan volume injeksi 20 L. Penentuan panjang gelombang dilakukan dengan
pembacaan standar DEP dan DBP dengan spektrofotometri UV.
2. Kondisi KCKT
Kolom : C
18
150 mm x 4,6 mm, 5 m (Sunfire

)
Detektor UV : DBP dan DEP dibaca pada panjang gelombang 230 nm
Fase gerak : aquabidest : asetonitril : 2-propanol : metanol (30:45:20: 5)
3. Pembuatan Fase Gerak
Larutan aquabidest : asetonitril : 2- propanol : metanol (30 : 45 : 20 : 5)
Dibuat Fase gerak sebanyak 500 mL dengan cara 150 mL aquabidest
dimasukkan dalam labu ukur 500 mL, ditambahkan asetonitril 225 mL, kemudian
tambahkan 100 mL 2- propanol, dan terakhir ditambahkan 25 mL metanol,
dihomogenkan dengan ultrasonicbath selama 5 menit tanpa degas dan pemanasan.
Kemudian, disaring dengan kertas saring membran 0,45 m.
4. Pembuatan Larutan Stok (DEP/ DBP 500 ppm/5 ppm)
Ditimbang DEP dan DBP masing-masing sebanyak 50 mg dan 10 mg. DBP
yang ditimbang kemudian dilarutkan dalam labu ukur 100 ml (kadar 100 ppm), dari
stok DEP ini dilakukan pengenceran agar konsentrasi menjadi 5 ppm dengan cara
dipipet 5 ml lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml yang didalamnya telah terisi
DEP 50 mg. Selanjutnya dilarutkan dengan heksan hingga tanda batas (larutan ini
mengandung 500 ppm DEP dan 5 ppm DBP).

23

5. Pembuatan seri kadar
Dibuat larutan seri kadar DEP dan DBP dengan konsentrasi 25/0,25 ppm; 50/0,5
ppm; 150/1,5 ppm; 250/2,5 ppm; 350/3,5 ppm, dengan menggunakan labu ukur 10 mL.
Konsentrasi didapat dengan memipet 0,5 mL; 1 mL; 3 mL; 5 mL; 7 mL dari larutan
stok dan dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan heksan sampai tanda batas.
Larutan seri kadar yang dibuat diinjeksikan sebanyak 20 L kedalam KCKT. Masing-
masing nilai AUC yang diperoleh untuk DEP dan DBP digunakan untuk membuat
persamaan garis Y= bx + a.
6. Penetapan waktu retensi (Rt)
Diambil campuran larutan baku dengan DEP/DBP konsentrasi 500 ppm/5 ppm.
Diinjeksi sebanyak 20 L kedalam KCKT. Kemudian ditentukan waktu retensi dari
DEP dan DBP.
7. Uji kesesuaian sistem
Uji kesesuaian sistem yang dilakukan dengan menghitung faktor kapasitas (k),
resolusi(R
s
), faktor tailing (T), dan perhitungan jumlah plat (N). Dari hasil perhitungan
yang didapatkan, dibandingkan dengan parameter yang direkomedasikan oleh
International Conference on Harmonitation (ICH) dan Food and Drug Administration
(FDA), yaitu : nilai k > 2, R
s
> 2, T 2, N > 2000.
8. Validasi Metode
8.1 Linieritas
Linearitas dapat diukur berdasarkan data yang diperoleh dari kurva baku,
kemudian ditentukan koefisien korelasinya (r).
8.2 Penetapan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitatif (LOQ)
LOD dan LOQ ditentukan melalui kurva baku yang didapat. Nilai LOD
setara dengan 3,3 x (S y/x)/b sedangkan nilai LOQ setara dengan 10 x (Sy/x)/b.
8.3 Penentuan presisi (keseksamaan)
Pengujian presisi dilakukan 6 kali replikasi. Dibuat campuran 50 ppm
DEP dan 0,5 ppm DBP dengan memipet 1 mL dari larutan stok 500 ppm DEP/5
ppm DBP. Dimasukkan dalam labu ukur 10 mL dan tambahkan heksan sampai
tanda batas. Diinjeksikan sebanyak 20 L kedalam KCKT. Dari nilai luas area
yang diperoleh, tentukan nilai rata-rata luas area, SD (standard deviation), dan
RSD (relative standard deviation).


24

8.4 Penentuan akurasi
Pengujian akurasi dilakukan dengan metode penambahan baku (standar
adisi). Diperkirakan masing-masing konsentrasi DEP dan DBP pada parfum .
a. Perolehan kembali 80 %
Dimasukkan 0,5 mL sampel kedalam labu ukur 10 mL, lalu dihomogenkan
dengan ultrasonifikasi. Diambil 1 mL dari labu tersebut, ditambahkan 2,4
mL larutan standar DEP dan DBP dari larutan stok, kemudian ditambahkan
heksan sampai tanda batas.
b. Perolehan kembali 100 %
Dimasukkan 0,5 mL sampel kedalam labu ukur 10 mL, lalu dihomogenkan
dengan ultrasonifikasi. Diambil 1 mL dari labu tersebut, ditambahkan 3 mL
larutan standar DEP dan DBP dari larutan stok, kemudian ditambahkan
heksan sampai tanda batas.
c. Perolehan kembali 120 %
Dimasukkan 0,5 mL sampel kedalam labu ukur 10 mL, lalu dihomogenkan
dengan ultrasonifikasi. Diambil 1 mL dari labu tersebut, ditambahkan 3,6
mL larutan standar DEP dan DBP dari larutan stok, kemudian ditambahkan
heksan sampai tanda batas
9. Preparasi dan penetapan kadar DEP dan DBP dalam parfum
Penentuan jumlah sampel bertujuan untuk meminimalkan varian sampel, pada
penelitian ini digunakan 2 jenis sampel dengan jumlah masing masing 3 buah.
Pengambilan sampel ditentukan dengan metode dengan metode non random.
Preparasi sampel dilakukan dengan, pertama 1 botol sampel parfum di ukur
volumenya. Diambil 0,5 mL sampel parfum dan dimasukan dalam labu ukur 10 mL
ditambahkan dengan heksan hingga tanda batas. Dihomogenkan dengan ultrasonicbath,
hingga membentuk dua fase yang terpisah jelas. Kemudian didiamkan beberapa menit
hingga bening. Dilakukan pengenceran 10 kali dengan, dipipet 1 mL, dimasukkan
kedalam labu 10 mL ditambahkan dengan heksan sampai tanda batas. Lalu, kembali
dihomogenkan dengan ultrasonicbath, kemudian didiamkan beberapa menit hingga
bening. Diambil beningan yang terletak diatas yaitu fase heksan secara perlahan
menggunakan pipet tetes, dimasukkan kedalam vial untuk diinjeksikan dengan injector
pada KCKT.


25

C. Analisis Hasil
Analisis hasil parameter verifikasi dapat dibandingkan dengan nilai parameter
validasi yang direkomendasikan International Conference on Harmonization (ICH) dan
Association of Official Analytical Chemist (AOAC). Data yang diperoleh pada
penetapan kadar dari sampel selanjutnya akan dihitung estimasi paparan DBP dan DEP
serta nilai MoS (Margin of Safety) kemudian dibandingkan dengan kadar DEP dan DBP
yang ditetapkan oleh Agency for Toxic Substance and Disease Registry dan
International Programme on Chemical Safety.
19