BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi dan Laboratorium

Penelitian di Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Riau sejak bulan April hingga bulan

Agustus 2021.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah blender (Philips® HR2223),

penyaring sampel PTFE 0,2 µm, pH meter, timbangan analitik (Shimadzu® AUW-

320), sentrifugator, vortex, micropipet (Nesco®), Spektrofotometer UV-Vis

(Shimadzu® UV-1900), seperangkat alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(Shimadzu® 20820), dan alat-alat gelas.

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan adalah jus daun seledri, akuabidest, buffer fosfat

0,05 M pH 6.8 (Kalium Hidrogen Fosfat 0,2 M dan dan Natrium Hidroksida 0,2

N), kaptopril (Phapros®), fenobarbital (Indofarma®), metanol for HPLC (Merck®),

asetonitril for HPLC (Merck®), dan plasma darah manusia (PMI Pekanbaru).

3.3 Rancangan Penelitian

1. Pembuatan jus segar buah pare

2. Pembuatan buffer fosfat 0,05 M pH 6.8

3. Penetapan panjang gelombang analisis menggunakan spektrofotometer UV-

Vis

4. Optimasi kondisi analisis KCKT

5. Validasi metoda analisis

a. Uji spesifisitas

b. Uji linearitas

c. Uji limit deteksi dan limit kuantitasi

d. Uji presisi dan akurasi

e. Pengumpulan data analisis

3.1 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pembuatan jus segar buah pare

Jus daun seledri dibuat dari ± 75 gram daun seledri kemudian diambil

sarinya menggunakan alat blender tanpa penambahan air, kemudian disaring

dengan penyaring PTFE 0,2 µm untuk diambil sarinya, sehingga diperoleh jus

seledri sebanyak ± 40 mL. Jus seledri yang digunakan adalah jus segar yang

dibuat setiap hari selama intervensi.

3.4.2 Pembuatan Buffer Fosfat 0,05 M pH 6.8

Larutan buffer fosfat dibuat dengan melarutkan Kalium Dihidrogenfosfat

sebanyak 6,8 gram dengan aquabidest hingga 1000 mL dan ditambahkan Natrium

Hidroksida 0,2 N hingga pH larutan menjadi pH 6.8.

3.4.3 Penetapan Panjang Gelombang Analisis Menggunakan

Spektrofotometer UV-Vis

Kaptopril dan fenobarbital masing-masing sebanyak 10 mg dilarutkan

dalam masing-masing 10 mL metanol hingga diperoleh larutan 1000 ppm.

Selanjutnya dibuat konsentrasi 10 ppm dengan mengambil 0,1 mL larutan 1000

ppm dan dimasukkan kedalam labu 10 mL, diencerkan dengan metanol sampai

tanda batas. Panjang gelombang diukur masing-masing dengan spektrofotometer

UV-Vis. Setelah diperoleh spektrum kaptopril dan internal standar gabungkan

kedua spektrum tersebut sehingga terlihat garis perpotongan antara kaptopril dan

fenobarbital.

3.4.4 Optimasi Kondisi Analisis KCKT

3.4.4.1 Pemilihan Komposisi Fase Gerak

Kaptopril dan fenobarbital masing-masing sebanyak 10 mg dilarutkan

dalam masing-masing 10 mL metanol hingga diperoleh larutan 1000 ppm.

Selanjutnya dibuat konsentrasi 1 ppm dengan mengambil 0,01 mL larutan 1000

ppm dan dimasukkan kedalam labu 10 mL, diencerkan dengan metanol sampai

tanda batas. Pemilihan fase gerak dipilih berdasarkan penelitian yang telah

dilakukan oleh Wulandari (2018), yang menyatakan bahwa kondisi optimum

untuk penetapan kadar campuran kaptoprl dan fenobarbital menggunakan KCKT

adalah dengan menggunakan fase gerak asetonitril:metanol:dapar fosfat

(60:20:20) dan dilakukan variasi komposisi fase gerak. Selanjutnya larutan,

disaring dengan PTFE 0,2 µm dan dimasukkan 20 µL ke kolom KCKT

menggunakan fase gerak asetonitril:metanol:buffer fosfat 0,05 M pH 6.8 dengan

perbandingan komposisi fase gerak (60:20:20), (60:25:15) dan (60:15:25).

Kemudian, dipilih komposisi fase gerak terbaik untuk digunakan pada prosedur

selanjutnya.

3.4.4.2 Pemilihan Kecepatan Alir

Kaptopril 1 ppm dan fenobarbital 1 ppm masing-masing sebanyak 20 µL

disuntikkan ke kolom KCKT dengan fase gerak terpilih. Pemilihan laju alir dipilih

berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Wulandari (2018), yang

menyatakan bahwa kondisi optimum laju air pada penetapan kadar campuran
kaptopril dan fenobarbital menggunakan KCKT adalah 1 mL/menit. Kemudian

divariasikan menjadi 0,8 mL/menit dan 1,2 mL/menit. Dicatat waktu retensi,

faktor ikutan (Tf), jumlah plat teoritis (N), HETP dan resolusi. Kemudian dipilih

kecepatan alir terbaik untuk digunakan pada prosedur selanjutnya.

3.4.5 Validasi Metoda Analisis

3.4.5.1 Uji Spesifisitas

Sebanyak 1 mL plasma ditambah 12 mL asetonitril kemudian divorteks

selama 20 detik dan disentrifus 10 menit pada kecepatan 4.000 RPM. Supernatan

diambil kemudian disaring dan disuntikkan sebanyak 20 µL ke dalam kolom

KCKT pada kondisi terpilih, amati adanya gangguan pada kromatogram disekitar

waktu retensi kaptopril dan fenobarbital sebagai internal standard. Langkah yang

sama dilakukan pada plasma yang mengandung kaptopril 1 ppm sebanyak 1 mL

dan ditambah internal standard 1 ppm sebanyak 1 ml. Begitu juga pada plasma

yang mengandung kaptopril pada konsentrasi tersebut ditambah internal standard

1 ppm sebanyak 1 mL dan jus daun seledri 1 mL.

3.4.5.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi

a. Pembuatan Larutan Induk Kaptopril

Sebanyak 10 mg kaptopril dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL dan

dilarutkan dengan metanol sampai tanda batas dan diperoleh larutan kaptopril

1000 ppm. Kemudian dilakukan pengenceran untuk mendapat konsentrasi 10

ppm. Dari konsentrasi 10 ppm ini dibuat berbagai seri konsentrasi 0,25 ; 0,5 ; 1 ;

2; 4 ; 8 ; dan 16 ppm.

b. Pembuatan Kurva Kalibrasi

Sebanyak 1 mL dari masing-masing seri konsentrasi larutan kaptopril 0,25 ;

0,5 ; 1 ; 2 ; 4 ; 8 ; dan 16 ppm yang mengandung plasma ditambah 1 mL internal

standard (10 ppm). Ekstraksi dilakukan seperti pada cara penyiapan sampel

spesifisitas. Sebanyak 20 µL dari masing-masing konsentrasi yang telah

diekstraksi disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi analisis terpilih. Kemudian

dari data pengukuran dibuat kurva kalibrasi dengan menggunakan persamaan

garis regresi (y=a+bx) dimana y adalah luas puncak dan x adalah konsentrasi

kaptopril.

3.4.5.3 Uji Linearitas

Dari data pengukuran pada pembuatan kurva kalibrasi, linearitas

diperoleh dengan menghitung koefisien korelasi (r) dari persamaan garis regresi

menggunakan perangkat lunak komputer microsoft office excel.

3.4.5.4 Uji Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi

LOQ dihitung melalui persamaan garis regresi linier dari kurva kalibrasi

dengan rumus :

Sy
10 ( )
x
LOQ=
b

Nilai batas deteksi (LOD) diperoleh dengan rumus :

Sy
3( )
x
LOD=
b

Dimana (Sy/x) adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari persamaan

regresi menggunakan perangkat lunak komputer microsoft office excel.

3.4.5.5 Uji Akurasi dan Presisi

Sebanyak 20 µL dari larutan kaptopril dalam plasma pada konsentrasi

rendah, sedang dan tinggi dengan penambahan 1 mL internal standard (10 ppm)
pada masing-masing konsentrasi disuntikkan kedalam kolom KCKT pada kondisi

terpilih. Pengulangan dilakukan sebanyak 5 kali untuk masing-masing

konsentrasi. Kemudian hitung % diff dan KV pada masing-masing konsentrasi.

Uji akurasi dan presisi ini dilakukan secara intra-day dan inter-day selama 3 hari.

3.4.5.6 Analisa Data

a. Analisa dengan perhitungan kalibrasi standar dan internal standard

menggunakan persamaan regresi y = a + bx.

b. Analisa akurasi dan presisi

B-A
% diff = ×100%
A

¿
Simpangan Baku ( SD )= √∑ (x- x ¿ n-1
B
Uji Perolehan Kembali= ×100 %
A

SD
Koefisien Variasi = ×100%
x

Keterangan :

B = konsentrasi sampel hasil penyuntikan setelah luas area diplotkan pada kurva

kalibrasi

A = konsentrasi sampel yang di timbang n = jumlah data

𝑥̅ = rata-rata konsentrasi data “X”