1

Parameter Uji Validasi Metode Analisis

1. Kesesuaian Sistem (System Suitability) :

Validasi dari sebuah metode analisis dapat menunjukkan kinerja

parameter dari sebuah instrumen analisis. Dalam rangka

mengkonfirmasi kesesuaian sistem suatu instrumen analisis maka

dibutuhkan parameter uji yang dilakukan berdasarkan studi

ketahanan sistem/instrumen (Robustness studies of

system/instrument). Beberapa parameter yang harus dipenuhi dalam

uji kesesuaian sistem yaitu daya pisah (Resolution),

Reprodusibilitas (RSD) dan faktor ikutan (Tailing Factor).

a. Daya Pisah (Resolution)

Daya pisah merupakan uji kemampuan alat untuk

memisahkan dua puncak analit. Syarat daya pisah adalah memiliki

nilai tidak kurang dari 2,0.

b. Reprodusibilitas (RSD)

Reprodusibilas merupakan nilai penyimpangan hasil

pengukuran analit pada instrumen yang memiliki batas nilai

tidak lebih dari 2,0 %.

c. Faktor ikutan (Tailling Factor)

Faktor ikutan merupakan uji kesimetrisan suatu

puncak kromatogram dan memiliki nilai tidak lebih dari 2,0.

 2

2. Spesifisitas (Selektivitas)

Spesifitas adalah kemampuan suatu alat untuk mendeteksi

secara tegas analit dalam suatu komponen, pengukuran biasanya

meliputi kemurnian (standar maupun uji), plasebo, pelarut dan

fase gerak. Kriteria penerimaan dari uji ini adalah plasebo, pelarut

dan fase gerak tidak boleh memberikan puncak pada waktu retensi

yang spesifik dengan standar maupun uji.

3. Linearitas

Linearitas adalah kemampuan suatu alat untuk memperoleh

hasil tes yang sebanding dengan konsentrasi analit dalam komponen.

Sedikitnya dibutuhkan lima konsentrasi standar untuk dianalisis.

Selain mengevaluasi secara visual sinyal analitik, perhitungan secara

statistik juga dibutuhkan, seperti perhitungan regrasi linear, slope,

intercept dan koefisien korelasi. Untuk memastikan bahwa alat sudah

memenuhi syarat linearitas, maka hasil perhitungan kofisien

korelasinya (r2) tidak boleh kurang dari 0,998.

4. Akurasi

Akurasi dalam sebuah prosedur analisis merupakan pembuktian

kedekatan nilai yang dihasilkan dari hasil perhitungan dengan nilai

dari referensi yang sudah ditetapkan. Karakteristik parameter ini

adalah indikasi adanya bias atau penyimpangan. Untuk pendekatan

secara kuatitatif, dibutuhkan sedikitnya sembilan data pada kisaran

 3

tertentu yang harus ditentukan. Contohnya tiga penetapan terhadap

tiga konsentrasi standar dengan penambahan sejumlah tertentu

plasebo seperti Tabel 1 berikut ini.

Tabel 1 Penambahan plasebo untuk parameter akurasi

Konsentrasi Konsentrasi Volume Volume Vol.

(%) (µg/mL) Plasebo standar akhir
(mL) (mL) (mL)
80 40,0 5,0 4,0 50
100 50,0 5,0 5,0 50
120 60,0 5,0 6,0 50

Kriteria penerimaan antara 98,0 % sampai 102,0 %

5. Presisi

Presisi merupakan pengukuran uji derajat penyebaran dari

sebuah serangkaian pengukuran yang diperoleh dari sampling

beberapa analit homogen dalam kondisi yang yang sama. Presisi

juga mengukur kesalahan acak dari sebuah analit. Parameter presisi

dipertimbangkan dari dua level yaitu keterulangan (Repeatibility)

dan Presisi antara (Intermediet Precision).

1. Keterulangan (Repeatability)

Keterulangan mencerminkan variasi hasil analisis uji

dengan prosedur yang sama pada rentang waktu yang singkat.

 4

Keterulangan dilakukan dengan mengulang minimal 10 kali

pengujian dengan kondisi yang sama. Hasil pengulangan tersebut

harus menghasilkan standar deviasi yang tidak lebih dari 2,0 %.

2. Presisi Antara (Intermediet Precision)

Presisi antara adalah pengukuran pengaruh perbedaan

kondisi lingkungan terhadap variasi hasil analisis pada analit.

Presisi antara dilakukan oleh dua analis yang berbeda dengan

prosedur yang sama. Standar deviasi keduanya tidak

boleh lebih dari 2,0 %.

6. Limit Kuantitasi (QL)

Limit kuantitasi adalah perhitungan nilai terendah dari

analit yang dapat dihitung secara kuantitatif. QL dihitung dengan

rumus berikut ini :

QL = 10 (Sy/x) / b

Keterangan : Sy/x = Standar deviasi

b = Slope

7. Limit Deteksi (DL)

Limit deteksi (DL) adalah jumlah minimum analit yang

dapat dideteksi olah alat secara kualitatif. DL dihitung dengan rumus

berikut ini :

DL = 3 (Sy/x) / b

Keterangan : Sy/x = Standar deviasi

b = Slope
 5

8. Kekuatan (Robustness)

Kekuatan dalam validasi metode analisis adalah suatu parameter

untuk menguji kestabilan komponen yang digunakan dalam metode

analisis tersebut, contohnya kestabilan pH pelarut, laju alir dan

kolom dengan nomor lot yang berbeda. Kriteria penerimaan ini

adalah penyimpangan tidak boleh lebih dari 2,0 %.

METODE

1. Larutan Stok Baku Pembanding (500 ppm)

Buat stok standar baku pembanding dengan konsentrasi 500 ppm

2. Pembuatan Larutan Baku Pembanding (50 ppm)

Encerkan dari larutan stok baku pembanding 500 ppm

3. Pembuatan Larutan Sampel

Timbang sample setara dengan 500 ppm standar baku pembanding yang
dibuat
4. Pembuatan Larutan Stok Plasebo

Timbang stok plasebo sesuai dengan 1 formulasi setara standar baku

pembanding 500 ppm

 6

PROSEDUR

1. Uji Kesesuaian Sistem (System Suitability)

Uji Kesesuaian sistem dilakukan dengan disuntikkan 1 µL larutan standar 50

ppm ke GC yang sudah dikondisikan sebanyak 6 kali, diamati respons alat.

Kriteria penerimaan uji ini adalah nilai RSD tidak lebih dari 2,0 % dan

nilai faktor ikutan (tailing faktor) tidak lebih dari 2,0.

2. Spesifisitas (Selektivitas)

Uji Spesifitas dilakukan dengan disuntikkan 1 µL larutan fase gerak, pelarut,

plasebo, larutan baku pembanding 50 ppm, larutan sampel GC dan

diamati respons yang diberikan alat. Kriteria penerimaan uji ini adalah plasebo,

pelarut dan fase gerak tidak boleh memberikan puncak pada waktu retensi

yang spesifik dengan standar maupun sampel.

3. Linearitas

Uji linearitas dilakukan dengan dibuat seri larutan baku pembanding dengan

konsentrasi 80%, 90%, 100%, 110%, dan 120% dari larutan stok baku

pembanding yang diambil dengan menggunakan buret. Lalu disuntikkan ke

dalam GC. Masing-masing konsentrasi dan dibuat linearitasnya. Kemudian dari

data yang didapat, dibuat perhitungan regresi linearnya dan ditentukan slope

serta interceptnya. Jumlah yang diambil dan pengenceran yang

dilakukan sesuai dengan Tabel 2 berikut ini.

 7

Tabel 2 Penambahan Volume Larutan Stok Baku Pembanding

Konsentrasi Konsentrasi Larutan Volume Akhir

(%) (µg/mL) Stock (mL) (mL)
80 40,0 4,0 50
90 45,0 4,5 50
100 50,0 5,0 50
110 55,0 5,5 50
120 60,0 6,0 50

Dihitung hasil Detection Limit (DL) dan Quantitation Limit (QL)

dengan rumus berikut ini.

DL = 3 (Sy/x) / b

QL = 10 (Sy/x) / b

Keterangan : Sy/x = Standar deviasi

b = Slope

Kriteria penerimaan r2 ≥ 0,998

4. Uji Akurasi (spiked placebo recovery)

Uji akurasi dilakukan dengan dibuat seri larutan baku pembanding dengan

konsentrasi 80%, 100%, dan 120% dari larutan stok yang diambil dengan

menggunakan buret. Ditambahkan pula ke labu ukur yang sama sejumlah

larutan stok plasebo dengan jumlah yang diambil dan pengenceran yang

dilakukan sesuai dengan Tabel 1 (halaman 18). Masing-masing konsentrasi

disuntikkan 3 kali ke dalam GC. Hasil yang didapat dihitung hasil perolehan

kembalinya dengan rumus berikut.

 8

Tu Bs 5 100 50
× × × × ×100 %
ecovery = Ts 100 50 Bu Vs
R

Tu Bs 5
= × × ×100 %
Ts Bu Vs

Keterangan :
Tu : Area sampel
Ts : Area standar
Bs : Bobot standar (mg)
Bu : Bobot sampel (mg)
Vs : Volume pemipetan sampel dari larutan stok
Kriteria penerimaan uji ini adalah 97,0%-103%.
5. Presisi

1. Keterulangan (Repeatability)

Uji keterulangan dilakukan dengan cara menyiapkan larutan sampel

sebanyak 10 kali penimbangan sesuai dengan cara persiapan larutan poin 3.

Kemudian disuntikkan ke dalam GC yang sudah dikondisikan. Hasil yang

didapat kemudian dibandingkan dengan larutan baku pembanding yang

juga disuntikkan ke dalam GC dengan kondisi yang sama dengan rentang

waktu yang tidak terlalu jauh. Hasil penyuntikkan dihitung dengan rumus

berikut.

Tu Bs 5 50 20 Br
× × × × × ×P
Ts 100 50 Bu 5 10
Kadar =

Tu Bs 20 Br
= × × × ×P
Ts 100 Bu 10
 9

Keterangan :

Tu : Area sampel
Ts : Area standar
Bs : Bobot standar (mg)
Bu : Bobot sampel (mg)
Br : Bobot rata-rata tablet (mg)
P : Potensi kadar standar (99,10%)
Kriteria penerimaan uji ini adalah nilai RSD dari 10 kali
penyuntikkan tidak lebih dari 2,0 %.

2. Presisi Antara

Uji Presisi antara dilakukan sesuai dengan uji Keterulangan (repeatability)

oleh analis kedua yang berbeda.

Tolerasi Diff 5%