Reprodusibilitas mengukur presisi antalaboratorium sebagaimana dalam studi – studi

kolaboratif atau studi uji banding antarlaboratorium dan atau uji profesiensi.Parameter ini harus
dipertimbangkan dalam standarisasi prosedur analisis (termasuk juga prosedur – prosedur dalam
Farmakope dan transfer metode antarlaboratorium yang berbeda).Untuk melakukan validasi
karakteristik ini, studi – studi yang sama harus dilakukan dilaboratorium lain dengan menggunakan lot
sampel homogen yang sama dan desain percobaan yang sama.Dalam kasus transfer (pemindahan)
metode antara dua laboratorium ,pendekatan – pendekatan yang berbeda yang berbeda dapat
dilakukan untuk suksesnya transfer prosedur analis .Meskipun demikian ,pendekatan yang paling umum
adalah dengan transfer metode secara langsung dari labaoratorium asal ke laboratorium penerima.

Laboratorium asal didefinisikan sebagai laboratorium yang mengembangkan dan memvalidasi

prosedur analisis atau laboratorium yang telah disertivikasi terlebih dahulu dalam prosedur analis yang
dimaksud dan akan berpartisispasi dalam studi transfer metode.Laboratorium penerima adalah
laboratorium tempat prosedur analisis dipindahkan ke laboratorium tersebut dan akan berpartisipasi
dalam studi transfer metode .Dalam transfer langsung ini, disarankan untuk menulis protocol
eksperimental secara terperinci serta kriteria keberterimaannya (misalnya perbedaan antara dua
laboratorium yang masih dapat diterima).

Dokumentasi presisi harusnya mencakup simpangan baku,simpangan baku relative(RSD) ,atau

koefisien variasi (CV) ,dan kisaran kepercayaan sebagaimana sisyartakan oleh ICH .Penhujian presisi
pada saat awal validasi metose sering kali hanya menggunakan dua parameter yang pertama ,yaitu
keterulagan dan presisi antara .Reprodubilitas biasanya dilakukan ketika akan melakukan uji banding
antar laboratorium .Presisi sering diekspresikan dengan simpangan baku (SD) dan simpanagn baku
relative (RSD) dari serangkaian data.

Spesifisitas

Spesifitas adalah kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur analit yang dituju secara
teapt dan spesifik dengan adanya komponen - komponen seperti pengotor ,produk degradasi, dan
komponen matrix.

ICH membagi spesifisitas dalam dua kategori yaitu uji identifikasi dan uji kemurnian atau
pengukuran.Untuk tujuan identifikasi spesifisitas ditunjukkan denga kemampuan suatu metode analisis
suatu metode untuk membedakan antara senyawa yang mempunyai struktur molekul yang hamper
sama .Untuk tujuan uji kemurnian dan tujuan pengukuran kadar spesifisitas ditunjukkan oleh daya pisah
dua senyawa yang berdekatan (sebagaimana dalam kromatografi ) . Senyawa-senyawa tersebut
biasanya adalah komponen aktif dan atau suatu pengotor.,maka metode uji tidak terpengaruh dengan
adanya pengotor ini.

Penetuan spesifisitas dapat diperoleh dengan dua jalan yaitu yang pertama (dan yang paling
diharapkan ) dalah denfgan melakukan optimasi sehingga diperoleh senyawa yang dituju terpisah secara
sempurna dan senyawa senyawa lain (resolusi senyawa yang dituju dengan senyawa disebelah kiri dan
kanannya dalam kromatogram > 2). Yang kedua adalah dengan cara dengan menggunakan detector
selektif ,terutama untuk senyawa senyawa yang terelusi secara bersama sama.Sebagai contoh detector
elektrokimia atau detektoe Flouresens hanya akan mendeteksi senyawa tertentu ,sedangkan senyawa
yang lainnya tidak terdeteksi.

Batas Deteksi

Batas deteksi ( Limit of Detection ,LoD) dan batas kuantifikasi merupakan parameter yang
digunakan untuk menggamabarkan sensitifitas metode analisis .Batas deteksi didefinikasikan sebagai
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat dideteksi meskipun tidak dapat dikuantifikasi .LoD
merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit tersebut berada di atas atau
dibawah nilai tertentu .

Definis batas deteksi yang paling umu digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa batas
deteksi merupakan kadar analit yang memberikan respon sebesar respons balnko ( Yb) ditambah
dengan tiga simpangan baku blanko.

ICH menggunakan dua metode untuk menentukan LoD yaitu metode noninstrumental visual
dan metode perhitungan .Metode noninstrumental visual digunakan pada teknik kromatrografi lapis
tipis dan pada metode titimetri .LoD juga dapat dihitung berdasarkan pada nilai simpangan baku (SD)
respons dan jemiringan (slope ,S) kurva baku pada level yang mendekati LoD sesuai dengan rumus ,LoD
=(SD/S).Simpangan baku respons dapat ditentukan berdasarkan simpangan baku blanko ,simpangan
baku residual dari garis regresi ,atau simpangan baku intersep y pada garis regresi.

Batas Kuantifikasi

Batas kuantufikasi (Limit of Quantification ,LoQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit

terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada
kondisi operasional metode yang digunakan.Perlu diingat bahwa LoQ merupakan suatu mompromi
antara konsetrasi dengan presisi dan akurasi yang dipersyaratkan .Jadi jka konsentrasi LoQ menurun,
maka presisi juga akan menurun .Jika presisi tinggi dipersyaratkan juga ,maka konsentrasi LoQ yang lebih
tinggi harus dilaporkan .

ICH mengenalkan metode rasio signal to noise ini.Namun sebagaimana dala perhitungan LoD
,ICH juga menggunakan dua metode pilihan lain untuk menentukan LoQ ,yaitu metode
noninstrumentasl visual dan metode perhitungan .Metode perhitungan didasarkan pada simpangan
baku respons (SD) dan slope (S) kurva baku sesuai dengan rumus ; LoQ = 10 (SD/S) .Simpangan baku
respons dapat ditentukan berdasarkan simpangan baku blanko pada simpangan baku residual garis
regresi linear atau dengan simpangan baku intersep-y pada garis regresi.
 Linieritas

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil hasil uji yang secara
langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisara yang diberikan .Linieritas suatu metode
merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan respon (y) dengan konsentrasi
(x) .Linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada monsentrasi yang berbeda beda
.Data yang diperoleh kemudian diproses dengan metode kuadrat terkecil,untuk selanjutnya dapat
ditentukan nilai kemiringan (slope),intersep,dan koefisien korelasinya .

Linieritas biasanya ditunjukkan secara langsung dngan mengencerkan larutan baku induk
.Dianjurkan untuk melakukan pengenceran secara serial terhadap larutan baku induk pada uji linieritas
ini.Penyiapan konsentrasi yang berbeda dengan menggunakan berat baku yang berbeda akan
menghasilkan kesalahan yang lenih besar terhadap kajian linieritas analit.Linieritas paling baik dievaluasi
dengan pengamatan visual terhadap suatu plot yang menyatakan hubungan antar fungsi konsentrasi
analit dengan sinyal yang diukur (afsorbansi,luas puncak,tinggi puncak,luas di bawah kurva,dan
sebagainya).Pada uji linieritas ,paling tida 5 konsentrasi yang berbeda digunakan pada pengujian.

Kisaran

Kisaran (range) suatu metode analisis didefinisikan sebagia konsentrasi terendah dan tertinggi
,yang mana suatu metode analisis menunjukkan akurasi,presisi,dan linieritas yang mencukupi .Kisaran
kisarn konsentrasi yang diuji tergantung pada jenis metode dan keguanaanya.Sebagaimana telah
direkomendasikan oleh ICH ,kisaran umum yang digunakan untuk uji potensi sneyawa obat atau produl
obat adalah kurang lebih 20% dari target atau nominal konsentrasi ,sedangkan untuk pengjian
keseragaman kadarnya adalah kurang lebih 20% dari target atau nominal konsentrasi.

Tabel Level dan kisaran serta kriteria keterterimaan untuk menentukan linieritas

UJi Level Kisaran Kriteria Keterterimaan

Pengujian 5 50% - 150% r≥ 0,999;
% intersep -y≤2,0%
Disolusi 5-8 10%-150% r≥0,99’
%intersep-y≤5,0%
Pengotor 5 LoQ-2% r≥0,98
Pembersih 5 LoQ-20 X LoQ r≥0,98

Kekasaran

Kekasaran (ruggedness) merupakan tingkat reprodubilitas hasil yang diperoleh dibawah kondisi
yang bermacam macam yang diekspresikan sebagai persen simpangan baku relative (%RSD).Kondisi
kondisi ini meliputi laboratorium analis,alat,reagen,dan waktu percobaan yang berbeda .
 Kekasaran suatu metode tidak akan diketahui jika suatu metode dikembangkan pertama
kali.Akan tetapi kekasaran suatu metode keliatan jika digunakan berulang kali .Suatu pengembangan
metode yang bagus mensyartakan suatu evaluasi yang sistematik terhadap factor factor penting yang
memengaruhi kekasaran suatu metode .

Ketahanan (Robustness)

Ketahanan merupakan kapasitasi metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi
parameter metode yang kecil .Ketahanan dievaluasi dengan melakukan variasi parameter parameter
metode seperti presentase pelarut organic ,Ph,kekuatan ionic,suhu,dan sebagainya.Suatu Pratik yang
baik untuk mengevaliasi ketahanan suatu metode adalah dengan memvariasikan parameter parameter
penting dalam suatu metode secara sistematis ,lalu mengukur pengaruhnya pada pemisahan.

Contohnya jika suatu metode menggunakan asetonitril 36%-air sebagai fase geraknya ,maka
seorang analis lalu memvariasikan presentase asetonitrilnya menjadi 33,36,39% kemudian melihat
pengaruhnya pada waktu retensi analit yang diuji.

Stabilitas

Untuk memperoleh hasil hasil analisis yang reprodusibel dan reliable ,sampel,reagen,dan baku
yang digunakan harus stabil pada waktu tertentu (misalnya satu hari,satu minngu,satu bulan,atau
tergantung kenutuhan .Untuk analisis sampel dalam jumlah banyak ,dibutuhkan waktu yang lebih lama
sehingga stabilitas dapat menjadi factor yang kritis pada validasi metode .Stabilitas semua larutan dan
reagen sangat penting ,baik yang berkaitan dengan suhu maupun yang berkaitan dengan waktu .Jika
larutan tidak stabil pada suhu hingga 2-8 C
̊ dapat meningkatkan stabilitas sampel dan standart.Stabilitas
juga penting terkait dengan waktu pengerjaan.

Kesesuaian Sistem

Sebelum melakukan analisis setiap hari ,seorang analis harus memastikan bahwa system dan
prosedur yang digunakan harus mampu meberikan data yang dapat diterima .Hal ini dapat dilakukan
dengan percobaan kesesuaian system yang didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin bahwa
metode tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima.Persyaratan – persyaratan
kesesuaian system setelah dilakukan pengembangan metode dan validasi metode.
 PENGEMBANGAN DAN VALIDASI METODE ANALISIS

1. Pengembangan Metode Analisis

Pengembangan metode analisis biasnya didasarkan pada literature yang sudah ada dengan
menggunakan instrumen yang sama atau hamper sama.Pengembangan metode biasanya mebutuhkan
pemilihan syarat-syarat metode tertentu dan memutuskan jenis instrument apa yang akan digunakan
dan mengapa digunakan.

Ada beberapa alas an valid untuk melakukan pengembangan suatu metode analisis baru,yaitu ;

1. Tidak ada metode yang sesuai untuk analit tertentu dalam matrix sampel tertentu
2. Metode yang ada terlalu banyak menimbulkan kesalahan atau metode yang sudah ada
tidak reliable (presisi dan akurasinya tidak dapat diterima)
3. Metode yang sudah ada terlalu mahal ,melibatkan banyak tahapan reaksi
,membutuhkan banyak waktu yang banyak ,membutuhkan banyak energy atau tidak
dapat diotomatisasikan sehingga tidak bersifat praktis
4. Metode yang telah ada tidak memberikan sensitivitas atau spesifitas yang mencukupi
pada sampel yang ditunjuk
5. Instrument dan teknik yang lebih baru memberikan kesempatan untuk meningkatkan
kinerja metode tersebut yang meliputi peningkatan identifikasi
6. Ada suatu kebutuhan untuk mengembangkan metode alternative ,baik untuk alas an
legal maupun karena alas an ilmiah .

Metode baru yang dikembangkan seharusnya mempunyai sifat –sifat :

1. Akurat,artinya metode yang dikembangkan mampu memperoleh hasil analisis yang

sedekat mungkin dengan nilai sebenarnya yang diterima (accepted true value)
2. Presisi ,bersifat atau ajek hasil analisis dari serangkaian pengukuran adalah dekat satu
sama lain
3. Spesifik
4. Peka
5. Tahan terhadap perubahan karena adanya sedikit variasi selama proses analisis
6. Praktis
7. Murah

2. Optimasi Metode Analisis

Optimasi metode dapat mengikuti dua pendekatan yang umum,yaitu :

1. Pendekatan manual.Pendekatan manual melibatkan variasi satu variable percobaan dalam satu
waktu sedangkan variable lainnya dibuat tetap,lalu respons yang terjadi dicatat.Variabel-
 variabel tersebut dapat berupa kecepatan air,komposisi fase diam atau fase gerak suhu,panjang
gelombang deteksi,dan Ph.
2. Pendekatan dengan computer ,efisiensi,dan dioptimasi.akan tetapi input eksperimental menjadi
minimal .Pendekatan secara otomatis dengan computer ini secara signifikan akan mengurangi
waktu,ennergi dan biaya .Terlebih lagi saat ini telah tersedia perangkat lunak yang mampu
mengolah data secara cepat.

3. Validasi metode analisis

Validasi metode menurut United State Pharmacopeia (UPS) dilakukan untuk menjamin bahwa
metode analisis adalah akurat ,spesifik,reprodusibel,dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis
.Secara singkat validasi merupakan aksi konfirmasi bahwa metode analisi yanhg akan digunakan sesuai
dengan tujuan yang diinginkan.

Menurut International Conference on Harmonization (ICH) suatu metode analisis harus

divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter –parameter kinerjanya cukup mampu untuk
mengatasi problem analisis.Oleh karena itu suatu metode harus divalidasi ketika:

 Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problrm analisis tertentu.

 Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau karena
munculnya suatu masalah yang mengarah pada perevisian metode baku
 Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring
dengan berjalnnya waktu.
 Metode baku digunakan dilaboratorium yang berbeda ,dikerjakan oleh analis yang
berbeda ,atau dikerjakan dengan alat yang berbeda
 Untuk mendeminstrasikan kesetaraan antar dua metode ,misalnya antara metode baru
dan metode baku.

Menurut ISO 17025:2005,suatu metode analisis harus divalidasi jika :

 Metode tidak baku ,misalnya dari diktat,buku teks ,dan jurnal yang belom diakui secara
luas
 Metode yang dikembangkan oleh laboratorium
 Metode standart yang digunakan di luar ruang lingkupnya .
 Perubahan sekecil apapun dari metode standard ,misalnya perubahan prosedur dan
perubahan volume reagensia .
 Gabungan dari dua atau lebih metode standard
 Gabungan antara metode standard dan metode bukan standard .

3.1 Pendekatan validasi metode analisis

Ada beberapa pendekatan untuk melakukan validasi metode , yaitu metode spiking buta nol
(zero-blind spiking) ,spiking buta tunggal (single –blind spiking ),metode spiking buta ganda (double –
blind spiking), pendekatan kolaboratif antarlaboratorium (interlaboratory collaborative studies) ,dan
pendekatan dengan membandingkan metode baru yang diterima .

Metode spiking buta nol (zero-blind spiking Method)

Pendekatan metode ini melibatkan analis tunggal,menggunakan suatu metode yang akan
divalidasi untuk melakukan analisis suatu sampel yang mengandung level analit tertentu yang sudah
diketahui untuk dapat didemonstrasi perolehan kembali (recovery-nya ),presisinya,dan akurasinya
.Secara umum pendekatan ini cepat,sederhana,dan berguna walaupun rentan terjadi hasil yang
subjektif.

Spiking buta tunggal (single –blind spiking method )

Pendekatan ini melibatkan satu analis yang menyiapkan sampel pada konsentrasi yag bervariasi
yang tidak konsentrasinya untuk diberikan kepada analis kedua yang juga melakukan analisis
sampel.Hasil analisis kedua ini kemudian dikumpulkan dan dibandingkan .meskipun tidak bias di awal
,pendekatan ini dapat kehilangan kebutaannnya pada tahap yang paling krusial ,yaitu ketika dua hasil
analisis dibandingkan.

metode spiking buta ganda (double –blind spiking method)

Pendekatan metode ini melibatkan tiga analisis.analis pertama menyiapkan sampel pada
konsentrasi yang diketahui,analis kedua melakukan analisis sampel ,dan analis ketiga (administrator)
membandingkan kedua data yang dihasilkan oleh kedua analis.baik analis pertama maupun kedua tidak
dapat melakukan akses data yang dihasilkan oleh masing masing analis.pendekatan metode ini
merupakan pendekatan yang paling objektif ,dengan asumsi bahwa tidak ada bias yang disebabkan oleh
analis ketiga (administrator)

Metode pendekatan dengan analisis bahan rujukan terstandar (standart reference material,
SRM)

Analisis dengan bahan rujukan atau referen standard atau sampel autentik pada umunya
merupakan pendekatan validasi yang diterima . Ketika menggunakan SRM ,analis harus menunjukkan
bahwa metode yang digunakan memberikan pengukuran analit yang akurat dan teliti dalam matrix
sampel tertentu.dengan pendekatan ini ,bias juga dapat terjadi,tertutama jika analis mengetahui
banyaknya kandungan analit dalam SRM.

Pendekatan kolaboratif antar laboratorium

Uji banding antar lab mungkin merupakan prosedur yang paling diterima untuk melakukan
validasi metode analisis baru. Pendekatan ini sangat mahal dan mebutuhkan waktu yang sangat lama.
Selama melakukan validasi dengan pendekatan ini, analis harus mengeluarkan segala usahanya untuk
mengordinasi prose validasi, mebagi sampel, menerima hasil, menganalisis hasil dengan cara statistika,
menginterpretasi hasil, dan akirnya melakukan interpretasi dan verifikasi data. Metode ini jarang
dilakukan pada suatu metode yang pertama kali muncul dalam literature.
 Pendekatan dengan memabndingkan metode baru dengan metode yang sudah eksis atau
dengan metode standard

Membandingkan metode analisis yang akan divalidasi dengan metode analisis yang sudah ada
atau meode standar membutuhkan suatu pendekatan lain untuk mengembangkan metode analisis.
Pendekatan ini biasanya dilakukan oleh analis tunggal. Akan tetapi, dapat juga dilakukan oleh dua orang
analis dan sampel yang dikerjakan menggunakan hasil yang diperoleh dari metode analisis yang telah
ada sebagai verifikasi untuk dipecah menjadi dua. Pendekatan ini juga menggunakan hasil-hasil yang
diperoleh dari metode analisis yang telah ada sebagai verifikasi untuk metode analisis baru yang akan di
validasi. Adanya kesesuaian hasil antara metode baru dengan metode yang telah ada mengarah bahwa
metode batu tersebut akan valid.

3.2 Persyaratan persyaratan validasi untuk kategori validasi metode analisis.

Baik USP maupun ICH telah menyatakan bahwa tidak selamanya parameter untuk
mengevaluasi validasi metode harus diuji.USP membagi metode metode analisis ke dalam
beberapa kategori –kategori yang terpisah ,yaitu
1) Kategori 1 untuk penetuan kuantitatif komponen komponen utama atau bahan aktif
.
Evaluasi nilai LoD dan nilai LoQ tidak begitu penting karena komponen utama atau
bahan aktif pada umumnya berada dalam jumlah yang besar. Meskipun demikian,
penentuan nilai LoD dan LoQ penting dilakukan jika penentuan keseragaman
kandungan terhadap suatu produk obat yang mengandung zat aktif kedua
mempunyai kandungan terhadap suatu produk obat yang mengandung zat aktif
kedua mempunyai kandungan relatif 0,5% atau lebih kecil terhadap kandungan zat
aktif mayor
2) Kategori II untuk penentuan pengotor (impurities) atau produk produk hasil
degradasi .
Dibagi lagi menjadi dua kategori yaitu analisis kuantitatif dan uji batas. Jika
diharapkan adalah informasi kuantitatifnya ,maka parameter LoD tidak begitu
penting ,tetapi parameter yang lain dibutuhkan.Keadaan yang berlawanan belaku
untuk uji batas karena jika informasi kuantitatifnya tidak dibutuhkan ,maka
pengukuran LoD ,spesifisitas,dan kekasran sudah mencukupi.
3) Kategori III untuk penentuan karakteristik karakteristik kinerja .
Digunakan untuk menentukan karakteristik kinerja produk akhir.Uji disolusi (tidak
termasuk pengukurannya )dan uji uji pelepasan obat merupakan contoh metode
yang masuk dalam kategori ini.Presisi merupakan parameter yang disyartakan untuk
kategori ini meskipun parameter parameter validasi yang lain juga adapat
ditentukan sesuai dengan tujuan yang diinginkan .
 4) Kategori IV untuk pengujian identifikasi .
Dalam kategori ini hanya membutuhkan uji spesifisitas dan validasinya.
Elemen-elemen data yang dibutuhkan untuk uji validasi (ICH, 1996)
Parameter Pengujian Pengujian Kategori II Pengujian
Kinerja Analisis Kategori I Kuantitatif Uji Batas Kategori III
Akurasi Ya Ya * *
Presisi Ya Ya Tidak Tidak
Spesifitas Ya Ya Ya *
LoD Tidak Tidak Ya *
LoQ Tidak Ya Tidak *
Linearitas Ya Ya Tidak *
Kisaran Ya Ya * *
Ruggedness Ya Ya Ya Ya
*Mungkin dibutuhkan, tergantung spesifiknya

3.3 Parameter validasi metode analisis

Menurut USP (United States Pharmacopeia) ada delapan parameter yang dievaluasi untuk
melakukan validasi metode analisis :
a. Presisi
b. Akurasi
c. Batas deteksi
d. Batas kuantifikasi
e. Spesifikasi
f. Linieritas dan rentang
g. Kekasaran ( Reggedness)
h. Ketahanan(Robustness)

Akurasi
Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur (measured value)dengan nilai
kebenarannya yang diterima (accepted true value),baik nilai konvensi,nilai
sebenarnya,maupun nilai rujukan .ada tiga pendekatan yang umum digunakan ketika
melakukan uji akurasi yaitu ; menggunakan SRM (Standart Reference
Material),melakukan spiking terhadap plasebo,dan melakukan metode penambahan
standart (standart addition method).
Presisi
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan
sebagai simpangan baku relative ( relative standart diviation ,RSD) .keterulangan
merupakan presisi yang dilakukan pada kondisi percobaan yang sama (berulang ),baik
orangnya,peralatannya,tempatnya,maupun waktunya.dua pilihan pengujian telah
diizinkan penggunaanya oleh ICH untuk mengamati keterulangan ;
 Suatu pengukuran sebanyak Sembilan(9) kali minimal yang mencakup kisaran
yang digunakan dalam prosedur analisis
 Suatu pengukuran sebanyak 6 kali minimal pada konsentrasi 100% dari
konsentrasi uji.