Pendahuluan

 Validasi metode analisis adalah suatu tindakan

penilaian terhadap parameter-parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan dalam penggunaannya.
 Tujuan utama validasi adalah untuk menjamin
metode analisis yang digunakan mampu
memberikan hasil yang cermat dan handal serta
dapat dipercaya.
 Validasi metode analisis pada matriks biologis
biasanya disebut sebagai validasi metode
bioanalisis.
 Validasi metode bioanalisis ini digunakan dalam
pengujian bioavailabilitas dan bioekuivalensi,
serta dalam uji farmakokinetika.
 Validasi metode bioanalisis meliputi dua fase yaitu
fase prestudi yang terdiri dari enam sampel
validasi dan fase studi yaitu validasi pada saat
proses analisis
 Parameter yang diuji dalam validasi
meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang,
limit deteksi, limit kuantitasi, spesifikasi,
ketangguhan, kekuatan, stabilitas dan uji
kesesuaian sistem.
 Untuk validasi metode bioanalisis,
parameter yang paling pokok meliputi
akurasi, pesisi, selektivitas, perolehan
kembali, kurva kalibrasi dan stabilitas analit
dalam sampel.
 Dalam validasi dokumentasi memegang peranan
penting untuk memastikan kinerja metode yang
cocok dan handal dalam aplikasi analisis.
 Suatu data analisis dapat diterima atau tidak
berhubungan langsung dengan kriteria parameter
validasi yang terpenuhi syaratnya.
 Ketika perubahan/modifikasi dalam metode
analisis terjadi dari metode sebelumnya, maka
metode yang baru harus memenuhi persyaratan
parameter validasi untuk menunjukkan keabsahan
kerja analisis yang dilakukan
 Jenis dan Tingkat Validasi
1. Validasi Lengkap (Full Validation)
2. Validasi Sebagian (Parsial Validation)
3. Validasi Silang (Cross Validation)
 Validasi Lengkap (Full Validation)
 Validasi Lengkap dilakukan ketika mengembangkan
dan menerapkan metode bioanalisis untuk pertama
kalinya
 Valiadsi lengkap dilakukan dalam menganalisis obat
baru
 Validasi lengkap dilakukan dalam uji bioanalisis suatu
molekul obat yang metabolitnya mengganggu.
 Validasi Sebagian (Parsial Validation)
 Validasi parsial adalah modifikasi dari metode
bioanalisis yang sudah tervalidasi
 Validasi parsial dialakukan dari yang paling sedikit
yaitu parameter akurasi dan presisi sampai pada
validasi lengkap
 Perubahan-perubahan metode bioanalisis yang
melakukan validasi parsial antara lain :
1. Transfer metode antar laboratorium atau
perubahan dalam metodologi analisis (mis;
perubahan sistem deteksi)
2. Perubahan antikoagulan dalam pengambilan
cairan biologis
3. Perubahan pada matriks dalam satu spesies (mis.
Plasma manusia menjadi urine manusia)
4. Perubahan pada spesies dalam satu matriks (mis.
Plasma mencit menjadi plasma tikus)
5. Perubahan konsentrasi dalam rentang yang
relevan
6. Perubahan dalam instrument dan atau platform
software
7. Jumlah sampel yang sedikit ( mis. Studi pd anak)
8. Matriks yang langka (mis. Cairan otak)
9. Selektifitas suatu analit baik dengan adanya obat
lain secara bersamaan
10. Selektifitas suatu analit baik dengan adanya
metabolit
 Validasi Silang (Cross Validation)
 Validasi silang adalah perbandingan parameter
validasi ketika dua/lebih metode bioanalisis
digunakan untuk menghasilkan data dalam studi
yang sama atau berbagai kajian berbeda.
 Metode bioanalisis yang sudah tervalidasi
digunakan sebagai referensi dan metode
bioanalisis yang direvisi adalah komparator.
Perbandingan harus dilakukan dua arah.
 Ketika analisis sampel dalam studi tunggal yang
dilakukan lebih dari satu laboratorium, validasi
silang dengan standar dan sampel matriks harus
dilakukan disetiap laboratorium untuk
membangun kehandalan antar laboratorium.
 Validasi silang juga dilakukan ketika data yang
dihasilkan menggunakan teknik analisis yang
berbeda (mis. LC-MS menjadi ELISA)
 1. Selektivitas (Selectivity)
 Selektivitas adalah kemampuan metode analisis
untuk mengukur kadar analit secara cermat dan
seksama dengan adanya komponen-komponen
lain dalam sampel (cairan biologis).
 Adanya gangguan pada pengukuran disebabkan
oleh tidak efektifnya tahap ekstraksi dan tidak
selektif/spesifik nya metode yang digunakan.
 Untuk selektivitas analisis dalam matriks biologi
harus diperoleh dari sedikitnya enam sumber.
 Setiap sampel blangko harus diuji interferensinya
pada batas terendah dari limit kuantitasi (LLOQ)
dan selektivitas harus menjamin tidak ada
interferensi pada LLOQ
 Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai
derajat penyimpangan (degree of bias) metode
yang dilakukan terhadap sampel yang
mengandung bahan yang ditambahkan berupa
cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa
asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil
analisis sampel yang tidak mengandung bahan
lain yang ditambahkan.
Cara penentuan:
 Selektivitas metode ditentukan dengan
membandingkan hasil analisis sampel yang
mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis,
senyawa asing lainnya atau pembawa plasebo
dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan
bahan-bahan tadi.
 Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih
dari hasil uji keduanya.
 Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi
atau tidak dapat diperoleh, maka selektivitas dapat
ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang
mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan
metode yang hendak diuji lalu dibandingkan dengan
metode lain untuk pengujian kemurnian seperti
kromatografi, analisis kelarutan fase, dan Differential
Scanning Calorimetry.
 Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut
merupakan ukuran selektivitas.
 Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi,
selektivitas ditentukan melalui perhitungan daya
resolusinya (Rs).
 2. Kecermatan (Accuracy)
 Akurasi adalah suatu metode analisis yang
menggambarkan kedekatan hasil penetapan yang
diperoleh dengan kadar analit sesungguhnya.
 Untuk akurasi dalam matriks biologi dilakukan
minimum lima kali pengukuran untuk setiap
kadar, menggunakan minimal tiga rentang kadar
yaitu, rendah, sedang dan tinggi.
 Pengukuran dapat dilakukan intra assay (dalam
satu run) dan inter assay (day to day variation).
 Pengukuran akurasi memenuhi syarat jika nilai
rata-rata % diff yang diperoleh tidak lebih dari
±15% dan untuk pengukuran pada konsentrasi
LLOQ nilai rata-rata yang diperoleh tidak lebih
dari ±20%
 Kecermatan suatu metode analisis
menggambarkan kedekatan tindakan individu
ketika prosedur diterapkan berulang kali untuk
beberapa aliquot analit dari volume homogen
matriks biologi.
 Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada
sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan
tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai
kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan
dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut
seperti menggunakan peralatan yang telah
dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut
yang baik, pengontrolan suhu, dan
pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai
prosedur.
 3.Keseksamaan (Precision)
 Presisi adalah suatu metode analisis menunjukkan
kedekatan antara hasil pengujian dengan hasil
pengujian lainnya.
 Presisi diukur minimal lima kali pengukuran
untuk tiap konsentrasi, minimal digunakan tiga
konsentrasi berbeda yaitu pada konsentrasi
rendah, sedang dan tinggi.
 Pengukuran presisi dilakukan secara intra assay
(dalam satu run) dan inter assay (day to day
variation).
 Suatu metode dikatakan presisi jika nilai koefisien
variasi (KV) untuk masing-masing tingkat
konsentrasi tidak boleh ≥ 15%. Kecuali jika
pengukuran dilakukan pada konsentrasi LLOQ,
maka koefisien variasi tidak boleh ≥ 20%
 4. Kurva Kalibrasi, Linieritas
 Kurva kalibrasi adalah hubungan antara respon
instrumen dengan konsentrasi analit yang diketahui.
 Persiapan kurva kalibrasi dilakukan sama dengan
sampel dalam matriks biologis yang diuji dengan
mencampur matriks dengan konsentrasi analit yang
diketahui.
 Kurva kalibrasi harus terdiri dari satu sampel blanko
(matriks tanpa baku dalam), satu sampel zero
(matriks dengan baku dalam), dan enam sampai
delapan sampel yang mencakup kisaran pengukuran
(termasuk konsentrasi pada LLOQ)
 Linieritas adalah kemampuan metode yang
memberikan respon secara langsung, proporsional
terhadap konsentrasi analit dalam sampel.
 Linieritas diperoleh dari koefisien korelasi (r) pada
analisis regresi linier yang di dapat dari kurva
kalibrasi.
 Dengan dilakukan uji ini, maka dapat diketahui
batas-batas konsentrasi dari analit yang
memberikan respon detektor yang linier. Analisis
harus dilakukan pada konsentrasi yang telah
dilakukan.
 Rentang metode adalah pernyataan konsentrasi
terendah dan tertinggi analit yang dianalisis
memberikan kecermatan, keseksamaan dan
linieritas yang dapat diterima.
 Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam
sampel yang dapat dideteksi yang masih
memberikan respon signifikan dibandingkan
dengan blanko.
 Batas deteksi merupakan parameter uji batas.
 Batas kuantitasi diartikan sebagai kuantitas
terkecil sampel yang masih dapat memenuhi
kriteria cermat dan seksama.
 Pada analisis instrumen, batas deteksi dihitung
dengan mengukur respon blanko beberapa kali
lalu dihitung simpangan baku respon blanko .
 Cara lain yang digunakan untuk mengukur LOD
dan LOQ melalui penentuan rasio S/N (signal to
noise) yaitu menghitung jarak antara lembah
dengan lembah kromatogram yang harus sama
dengan tiga agar cukup memenuhi untuk
menentukan batas deteksi dan untuk batas
kuantitasi diharapkan harga S/N sama dengan 10.
LOD = [3 sy/x] / b

LOQ = [10 sy/x] / b

LLOQ = Lower Limit of Quantification

 5. Perolehankembali (recovery)
 Uji perolehan kembali merupakan
perbandingan antara respon detektor analit
yang diekstraksi dari sampel biologis
dengan respon detektor kadar yang
sebenarnya dari standar murni.
 Uji perolehan kembali dari analit tidak perlu
100%, tetapi perolehan kembali dari analit
dan baku dalam presisi dan keberulangan
harus konsisten.
 Uji perolehan kembali dilakukan dengan
membandingkan hasil analisis dari ekstraksi
sampel pada tiga konsentrasi berbeda (konsentrasi
rendah, sedang, tinggi) dengan standar yang tidak
diekstraksi, dimana uji perolehan kembalinya
100%.
 Persyaratan uji perolehan kembali adalah 85-115%,
kecuali bila pengukuran pada LLOQ maka uji
perolehan kembali 80-120%
Integritas Pengenceran
 Pengenceran sampel dalam analisis seharusnya tidak
mempengaruhi akurasi dan presisi. integritas
pengenceran harus mencakup pengenceran yang
diterapkan pada sampel penelitian.
 Integritas pengenceran dilakukan dengan mencampur
matriks dengan konsentrasi analit di atas ULOQ dan
mengencerkan sampel ini dengan matriks blanko
(minimal lima kali penentuan per faktor pengenceran).
Akurasi dan presisi harus berada dalam kriteria yang
ditetapkan, yaitu ±15%.
 Penggunaan matriks lain dapat diterima, asalkan telah
menunjukkan bahwa tidak mempengaruhi presisi dan
akurasi.
 Efek Matriks
 Efek matriks harus diperiksa ketika menggunakan metode
spektrometri massa, menggunakan setidaknya 6 matriks
blanko individu yang berbeda. (Campuran matriks
sebaiknya tidak digunakan).
 Untuk setiap analit dan baku dalam, faktor matriks (MF)
harus dihitung untuk setiap lot matrik, dengan menghitung
rasio luas puncak analit dengan matriks (diukur dengan
menganalisis matriks blanko yang dicampur dengan analit
setelah ekstraksi), terhadap luas puncak analit tanpa
matriks (larutan murni dari analit).
 Faktor matriks (MF) untuk baku dalam juga harus dihitung
dengan membagi MF analit dengan MF baku dalam. Nilai
KV dari MF baku dalam yang dihitung dari 6 lot matriks
harus lebih kecil dari 15%. Penentuan ini dilakukan pada
konsentrasi rendah (maksimum 3 kali LLOQ) dan
konsentrasi tinggi (mendekati ULOQ).
 6. Stabilitas (stability)
 Berbagai kondisi seperti panas, cahaya,
kelembaban dan pH yang berbeda, kandungan
kimia dari obat, matriks serta wadah
penyimpanannya dapat mempengaruhi kestabilan
obat.
 Prosedur stabilitas harus ditentukan selama
sampel dikumpulkan dan penangganannya,
setelah waktu lama (disimpan pada suhu rendah)
dan waktu pendek (suhu kamar)
1. Stabiitas larutan standar (stock solution stability)
Stabilitas larutan stok sampel dan larutan baku
dalam harus diuji pada suhu kamar di jam ke-6
dan disimpan pada lemari pendingin untuk
dianalisis pada hari ke-7 sampai hari ke-14 atau
periode waktu yang ditentukan.
2. Stabilitas beku dan cair (freeze and thaw stability)
Stabilitas sampel harus ditentukan setelah tiga kali
siklus pembekuan dan pencairan. Pada tiap-tiap
konsentrasi rendah, sedang dan tinggi harus
disimpan pada suhu -20 oC atau suhu yang
direkomendasikan selama 24 jam dan biarkan
pada suhu kamar. Setelah meleleh sempurna,
sampel dibekukan kembali selama 12 sampai 24
jam pada kondisi yang sama.
Sampel baru dianalisis setelah siklus yang ketiga.
Jika sampel tidak stabil pada suhu yang
direkomendasikan, sampel disimpan pada suhu -
70 oC dan dianalisis setelah tiga kali siklus
pembekuan dan pencairan.
3. Stabilitas jangka pendek (short-term temperature
stability)
Pada tiap-tiap konsentrasi rendah, sedang dan tinggi
dianalisis pada suhu kamar dan tetap dijaga pada
kondisi tersebut untuk jangka waktu 4-24 jam.

4. Stabilitas jangka panjang (long-term stability)

Waktu penyimpanan dan evaluasi stabilitas jangka
panjang harus ditentukan lamanya, antara tanggal
awal sampel dikumpulkan sampai selesai dianalisa.
Stabilitas jangka panjang ditentukan pada tiap-tiap
konsentrasi rendah, sedang dan tinggi yang disimpan
pada suhu -20 oC atau suhu yang direkomendasikan.
5. Stabilitas pasca-preparasi (Post-Preparative
Stability)
Stabilitas sampel olahan, termasuk didalamnya
waktu tinggal sampel pada autosampler
stabilitas obat dan standar internal harus dinilai
selama proses analisis berlangsung. Proses
penilaian stabilitas dengan membandingkan
konsentrasi sampel terhadap standar kalibrasi
 Dasar perhitungan untuk suatu komponen zat
yang dianalisis adalah dengan mengukur luas
puncak kromatogramnya. Ada beberapa metode
yang dapat digunakan, yaitu :
Metode baku luar
Dibuat kurva kalibrasi antara luas puncak terhadap
konsentrasi dari berbagai macam konsentrasi larutan
sampel yang akan dianalisis disuntikkan dan diukur
luas puncaknya. Kadar sampel diperoleh dengan cara
memplot luas puncak sampel pada kurva kalibrasi
atau perbandingan langsung. Kekurangan metode ini
adalah diperlukan baku murni serta ketelitian dalam
pengenceran dan penimbangan.
 Metode baku dalam
Pada metode ini sejumlah baku dalam ditambahkan
ke dalam sampel dan baku pembanding. Kemudian
larutan campuran komponen baku pembanding dan
baku dalam dengan konsentrasi tertentu
disuntikkan dan dihitung perbandingan luas puncak
keduanya. Kurva kalibrasi dibuat dengan
menghubungkan perbandingan luas puncak
terhadap konsentrasi komponen baku pembanding.
Kadar sampel diperoleh dengan memplot
perbandingan luas puncak komponen sampel
dengan baku dalam pada kurva standar. Keuntungan
menggunakan cara ini