Validasi Metode Analisis

pop

apt. Anita Puspa Widiyana, S.Farm., M. Farm.

INTRODUCTION

Validasi metode analitik Proses untuk

mengkonfirmasi bahwa analitik /prosedur yang
digunakan untuk uji tertentu memenuhi persyaratan
yang
dimaksud.
• Pedoman : FI, USP, ICH, FDA dll.
• Bagian sistem kontrol kualitas dan regulasi
dari praktek manufaktur di industri farmasi.
Tahapan uji analisis Metode uji analisis harus
menjelaskan: 1. Mutu dan sumber baku pembanding
untuk senyawa
yang dianalisis 2. Prosedur yang digunakan untuk
menyiapkan larutan
pembanding 3. Mutu semua pereaksi atau pelarut yag
digunakan dalam
penetapan kadar dan metode pembuatannya 4.
Prosedur dan keadaan yang digunakan untuk
pengoperasian semua perlengkapan dalam
penetapanas
kadar 5. Metodologi yang digunakan untuk
pemrosesan sampel
sebelum analisis

Validasi Prosedur Analitis

07
Uji kuantitatif pengotor;
Uji Identifikasi Memastikan identitas sampel (spektra,
kromatogram, reaktivitas dll) dengan standart reference
Mencerminkan karakteristik kemurnian sampel
Uji batas untuk kontrol pengotor
04
Uji kuantitatif senyawa aktif Adanya analit dalam sampel
dan kuantitatif zat di dalam obat

USP (united state pharmacopoeia)

Klasifikasi menurut USP 1. Kategori | Metode analitik

untuk kuantisasi pengukuran zat obat massal atau
bahan aktif termasuk pengawet dalam produk farmasi
jadi. 2. Kategori II Metode analitik untuk penentuan
pengotor dalam obat curah atau untuk penentuan
senyawa degradasi dalam produk farmasi jadi. 3.
Kategori III: Metode analitik untuk penentuan
karakteristik kinerja (mis disolusi, pelepasan obat).
4. Kategori IV: Tes identifikasi.

Characteristics
Table 1: ICH characteristics
Test for impurities Identification
Quantitative Limit test
Assay
V
X
Accuracy
Precision | Repeatability
Intermediate precision Specificity Detection limit Quantitation limit
Linearity Range
X
X

Vindicate this need to be evaluated

x indicate this need not to be evaluated

mo a

Category
IV
Table 2: characteristics required for the validation as
per USP Analytical performance Category 1 Category II
| Category characteristics
Quantitative Limit test III Accuracy Precision
V Specificity
V V
V Limit of detection
T
V Limit of quantitation
V Linearity
V
V
| * Range Ruggedness
|

Vindicates the parameter need to be considered *

indicates parameter may be considered depending on
the nature of the test.

mov

Parameter Validasi Metode Analisis

ni ni
w
Metode analitik telah divalidasi sesuai dengan
pedoman ICH Q2 (R1). Parameternya adalah:
Ketepatan (accuracy) Presisi (precision) Keterulangan
(repeatability) Presisi Intermediat (intermediate
precision) Kekhususan (specificity) Batas Deteksi
(detection limit) Batas Kuantitas (quantitation limit)
Linearitas (linierity) Jarak (range) Robustness
Sistem suitability
0
o
C
33
o
1. Ketepatan (accuracy)

Keterdekatan antara nilai yang diukur dengan nilai

yang diterima baik sebagai nilai sebenarnya atau nilai
referensi atau disebut kebenaran Data sampel
sama/dekat dengan
Cara memnentukan akurasi: data standar/yg
menjadi patokan a. Perbandingan dengan
standar referensi b. Perolehan kembali analit yang
ditambahkan matriks
kosong C. Penambahan standart analit
Akurasi metode: membandingkan metode yang
dilakukan dengan metode pembanding di farmakope
w

2. Presisi (precission)
Kedekatan kesesuaian (tingkat sebaran) di antara
serangkaian pengukuran yang diperoleh dari
pengambilan sampel yang berulang pada sampel
homogen yang sama dalam kondisi yang ditentukan.
Semua data sampel penelitian saling
berdekatan, Kondisi dibagi menjadi 3: biasanya
ada yang jauh dari data standar/yg
menjadi 1. Pengulangan
patokan (tergantung akurasinya) presisi
dalam kondisi operasi yang sama, analis yang sama
dalam periode waktu yang singkat 2. Presisi menengah
metode diuji pada beberapa hari, instrumen, analis dll
3. Reprodusibilitas studi antar-laboratorium
Kriteria sampel : homogen dan otentik
Nilai sesungguhnya
Nilai Terukur
PRESISI
TIDAK PRESISI
Akurasi

Nilai
Presisi

TIDAK AKURAT
TIDAK AKURAT

Low accuracy Low precision

Low accuracy High precision

Oo oo
TIDAK BIAS
High accuracy Low precision
High accuracy High precision

AKURAT
TIDAK AKURAT

X = nilal rerata data

data
©
nilal sebenarnya
w

3. Keterulangan (repeatability)

1. Repeatability mengekspresikan presisi di dalam

kondisi

operasi yang sama dalam waktu singkat interval waktu.

2. Disebut presisi intra-assay 3. Contoh: penetapan

kadar diulangi oleh orang yang sama

dengan instrumen tunggal

4. Presisi Intermediat (intermediate precision)

1. Presisi menengah mengekspresikan variasi presisi

pada
saat analisa tersebut dilakukan oleh analis dalam
laboratorium: hari yang berbeda, berbeda analis,

peralatan berbeda, dll. 2. Tujuan: standarisasi

terhadap variasi-variasi dalam

perlengkapan, metode, analis.

5. Kekhususan (specificity)
Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit
di dalam kompleks
campuran o Kemampuan untuk menghasilkan sinyal
yang bebas dari gangguan (kotoran,
zat pengurai, matriks, dll)
Definisi tersebut memiliki implikasi berikut: a. Tes
identifikasi : Tes identifikasi harus dapat membedakan
senyawa yang terkait erat dengan struktur yang
diharapkan ada yaitu, untuk memastikan identitas
analit. b. Tes kemurnian: Untuk memastikan bahwa
prosedur analitik yang dilakukan memungkinkan
pernyataan akurat isi dari pengotor analit yaitu zat
terkait residu pelarut, logam berat, dll. C. Pengujian:
Untuk mencapai hasil yang akurat, ini memungkinkan
laporan yang benar tentang potensi atau konten analit
dalam sampel.
Spesifisitas adalah yang tertinggi dari Selektivitas

Selektifitas

Selektivitas metode analitis didefinisikan sebagai

sejauh mana
suatu metode dapat mengukur analit di hadapan
reference. e Komponen lain yang mungkin ada
termasuk pengotor,
degradan, matriks, dll Spesifik : merujuk pada metode
yang menghasilkan respons untuk analit tunggal saja
Selektif mengacu pada metode yang memberikan
respons untuk jumlah entitas kimia yang mungkin
dibedakan satu sama lain atau tidak

6. Batas Deteksi (detection limit/LOD)

Batas deteksi jumlah analit terendah dalam sebuah

sampel yang dapat dideteksi tetapi belum tentu
dikuantifikasi sebagai nilai yang tepat dinyatakan
dalam konsentrasi analit (ppm) dalam sampel. ICH
merekomendasikan empat metode berikut untuk
estimasi LOD:
Evaluasi visual. Sinyal untuk rasio kebisingan. Deviasi
standar dari respons. Standar deviasi kemiringan plot
linieritas.

7. Batas Kuantitas (quantitation limit/LOQ)

Batas kuantitasi prosedur

jumlah analit terendah di dalam sampel yang dapat
ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan
akurasi yang sesuai. parameter uji kuantitatif untuk
senyawa dengan kadar rendah dalam sampel matriks,
dan digunakan terutama untuk penentuan kotoran
dan/atau degradasi ICH merekomendasikan empat
metode berikut untuk estimasi LOQ:
Evaluasi visual. Sinyal untuk rasio kebisingan. Deviasi
standar dari respons. Standar deviasi kemiringan plot
linieritas.

8. Linearitas (linierity

Linieritas

ukuran seberapa baik plot kalibrasi respons vs

konsentrasi mendekati garis lurus.
pengukuran tunggal pada beberapa konsentrasi analit.
Diproses menggunakan regresi linear kuadrat-terkecil.
Kemiringan plot yang dihasilkan, koefisien intersep dan
korela memberikan informasi yang diinginkan pada
linearitas

9. Jarak (range)

interval antara konsentrasi analit atas dan bawah

dalam sampel (termasuk konsentrasi ini) yang telah
ditunjukkan bahwa

prosedur analitik memiliki tingkat ketepatan, akurasi,

dan linieritas yang sesuai

10. Robustness

Ukuran kemampuan suatu metode analitik untuk tetap

tidak berubah oleh perubahan kecil yang disengaja
dalam parameter metode. Parameter metode variabel
dalam teknik HPLC mungkin melibatkan laju aliran,
suhu kolom, suhu sampel, pH dan komposisi fase
gerak. Parameter metode variabel dalam teknik
spketrofotometri melibatkan panjang gelombang
Untuk zat dan produk obat perbedaannya harus < 2,0%
dan untuk pengotor harus < 10%.

11. Sistem suitability test /pengujian kesesuian sistem

1. Sistem pengujian yang digunakan secara rutin di

laboratorium cocok untuk analisa yang pasti 2. Tes
didasarkan pada konsep bahwa peralatan, elektronik,
operasi analitis dan sampel menjadi dianalisis
merupakan sistem integral yang dapat dievaluasi 3.
Tergantung pada jenis prosedur yang sedang
dilakukan/divalidasi.

AKURASI

Anita Puspa Widiyana, S. Farm., M. Farm., Apt.

Akurasi (Ketepatan)

Akurasi ditentukan dengan nilai persen recovery

(perolehan kembali) Rentang nilai persen (%) recovery
analit yang dapat diterima adalah 90–110 % Range
tersebut bersifat fleksibel tergantung dari kondisi analit
yang diperiksa

berdasarkan jumlah sampel dan kondisi laboratorium

Rumus % recovery =
kadar terukur
-X 100% kadar sebenarnya

Kasus
Uji ketepatan dilakukan dengan menggunakan metode
akurasi baku dan diekspresikan dengan menghitung
persentase recovery. Pengujian dilakukan dengan
membuat suatu seri baku ofloksasin dalam dapar fosfat
dengan lima konsentrasi (y= 0,0224 X – 0,0234;
r=0,998). Pengujian dilanjutkan dengan melakukan
penimbangan ofloksasin sejumlah tertentu sehingga
diperoleh konsentrasi 5; 10; dan 15 ppm. Ketiga
sampel tersebut dianalisis dengan menggunakan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang
maksimum. Hasil pengukuran dibandingkan dengan
kurva baku yang telah dibuat dan digunakan untuk
menghitung persentase recovery..

Hasil Uji Akurasi

Absorbansi
Konsentrasi baku ofloksasin
(ppm)

0,105

0,213

0,321

Tahapan Penyelesaian
1. Tentukan konsentrasi dari perolehan sampel setelah
penambahan baku (dapat diperoleh melalui persamaan
garis regresi dari kurva baku) 2. Hitung % recovery
sesuai dengan rumus

Perhitungan % Recovery

1. Persamaan Garis Regresi: y= 0,0224 x -0,0234 2. Y

→ 0,105

0,105 = 0,0224 x -0,0234

0.105+0,0234 = 4 792 ppm
X = 0,1057
0,0224

kadar terukur
3. % recovery = kadar sebenarnya
dar sebenarnva* 100%

x 100%
4,792 ppm
5,0 ppm = 95,84 %
PRESISI

Anita Puspa Widiyana, S. Farm., M. Farm., Apt.

Presisi

Presisi adalah tingkat pengulangan dari metode

analisis dibawah kondisi normal Presisi dari metode
ditentukan dengan repeatability (intraday) dan
intermediate precision (inter-day) Presisi ditentukan
dengan % RSD atau %KV untuk beberapa kali
pengulangan Sampel dengan konsentrasi sama
dianalisis dengan beberapa kali replikasi pada hari
sama (intraday pecision) dan 3 hari berturut-turut
(interday precicion) Persyaratan % KV atau % RSD <
2%

{(xs-x)
SD=11-1
KVC) = P x 100%

Kasus
Kuercetin merupakan salah satu senyawa aktif yang
terkandung pada daun asam jawa. Pengujian senyawa
aktif dengan metode spektrofotometri UV Vis perlu
dilakukan validasi sebagai salah satu persyaratan
penjaminan mutu herbal. Salah satu pengujian validasi
metode yaitu presisi dengan menggunakan larutan
baku standart seri kuersetin. Larutan baku standart
kuersetin konsentrasi seri 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, 10
ppm, dan 12 ppm diukur serapannya pada panjang
gelombang maksimum 361,8 nm. Setiap konsentrasi
dilakukan pengukuran dengan pengulangan
sebanyak 7 kali. Hasil pengukurannnya dalam bentuk
absorbansi yang terdapat dalam tabel. a. Berapakah
nilai % koefesien korelasi (%KV)? b. Apakah pengujian
tersebut memenuhi syarat ?

Hasil Pengujian Kuersetin

Replication
6 ppm 0.343 0.343
0.348
4 ppm 0.232 0.226 0.226 0.229 0.231 0.235 0.235
Absorbance (A)
8 ppm 0.470 0.476 0.476 0.474 0.472 0.471 0.480
10 ppm 0.601 0.594 0.598 0.607 0.596 0.604 0.597
12 ppm 0.731 0.716 0.725 0.716 0.721 0.724 0.722
0.349 0.356 0.353 0.353

Tahapan Penyelesaian

a. % RSD atau % KV pada konsentrasi 4 ppm

1. Nilai rata-rata absorbansi
0.232+0.226+0.226+0,229+0.231+0.235+0.235

= 1.614 = 0,231 2. Nilai standart deviasi (SD) =

0,00378 3. Nilai % RSD atau % KV
% RSD atau % KV = SD x 100%
= 0,00378 x 100 % = 1,636 %
0.231

b. Hasil pengujian memenuhi syarat diperoleh % RSD

atau % KV 1,636 % < 2%)

Kesimpulan
 % RSD atau % KV = 1,636% Hasil memenuhi syarat
presisi

SPESIFITAS ATAU SELEKTIFITAS

Anita Puspa Widiyana, S. Farm., M. Farm., Apt.

Spesifitas atau Selektivitas

Kemampuan yang hanya mengukur zat tertentu secara

cermat dan

seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin

ada dalam

matrik

O Membandingkan struktur molekul yang hampir sama

(uji identifikasi)
Daya pisah antar senyawa yang berdekatan (uji
kemurnian)

Kasus

Mahasiswa farmasi melakukan pengujian spesifitas

parasetamol di dalam sediaan tablet. Pengujian
spesifitas dilakukan dengan mengukur serapan larutan
masing-masing analit secara terpisah. Larutan kerja
standart yang mengandung campuran komponen juga
diukur serapannnya. Berdasarkan hasil pengujian
diperoleh spektra standart parasetamol, placebo (tanpa
obat) dan campuran placebo dan analit

Hasil Uji
2435 mm0.679 Abs
Algorogner

0.000

FIGURE 4 UV SPECTRUM OF PLACEBO

FIGURE3: UV SPECTRUM OF PARACETAMOL IN SAMPLE SOLUTION
SVELDO WODY

W eat rm) FIGURE 5: UV SPECTRUM OF PLACEBO+ANALYTE

LOD DAN LOQ

Anita Puspa Widiyana, S. Farm., M. Farm., Apt.

Kasus

Apoteker di BPOM melakukan validasi metode untuk

memilih metode analisis yang tepat dalam
menentukan keberadaan ibuprofen yang ditambahkan
di dalam jamu. Parameter yang ditentukan antara lain
batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ). LOD
dan LOQ ditentukan secara statistik melalui garis
regresi linier dari kurva kalibrasi/kurva baku. Data
pengukuran absorbansi dari kurva kalibrasi dapat
dilihat dalam tabel. Berapakah nilai LOD dan LOQ ?

Hasil Uji Kurva Kalibrasi

Konsentrasi (ppm)
2,2 2,6 3,0 3,4 3,8
Absorbansi
0,317 0,395 0,411 0,504 0,536 0,667

Tahapan Penyelesaian

1. Persamaan garis regresi: y = 0,1619 x -0,0463 2. X

= 2,2 ppm
Yi = (0,1619 x 2,2) - 0,0463 = 0,310

Konsentrasi Absorbansi Yi
Y-Yi
(Y-Yi)2
(C)
(Y)
2,2
0,317
0,007
0,000
0,310
0,375
2,6
0,395
0,020
0,000
3,0
0,411
0,439
-0,028
0,001
0,000
0,504
0,504
0,000
3,4 3,8 4,2
0,536 0,667
0,569 0,634
-0,033 0,033
0,001 0,001
Tahapan Penyelesaian

E (Y-Yi)2 = 0,003 N = 6
LOD =
3.S(y/x) slope (b)

3.0,032
= 3,0,032 = = 0,568 ppm
= 0,568 ppm

S (v/x)2 =
(yi – yi)2
N-2

0,003
= 6-2 = 0,001 Sly/x) = 70,001 = 0,032
LOQ =
10.S(y/x) slope (b)

10.0,032 - 1,892 ppm

0,1691

Kesimpulan
LOD = 0,568 ppm LOQ = 1,892 ppm

LINIERITAS

Anita Puspa Widiyana, S. Farm., M. Farm., Apt.

Kasus

Pemanis buatan lebih banyak digunakan dibanding

pemanis alami. Neonatam merupakan pemanis
sintesis yang digunakan pada industri farmasi
sebagai eksipien obat. Dalam rangka
mempertahankan mutu, maka dilakukan pengujian
linieritas pada metode Spektrofotometri UV-Vis.
Pengujian linieritas dengan mengukur serapan dari 6
konsentrasi larutan baku kerja neonatam pada panjang
gelombang maksimun 210 nm. Berdasarkan hasil
pengujian diperoleh data seperti pada tabel.
Hasil Uji Linieritas

Konsentrasi (ppm)
10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5
Absorbansi
0,256 0,329 0,379 0,439 0,476 0,557

Hasil Regresi Linier dengan Microsoft Excel

0,256 0,329 0,379

Linieritas Larutan Baku Kerja Neonatam
12,5
15,0 17,5 20,0 22.5
0,439 0,476
y=0,0229x + 0,0335
R2 = 0,992

0.557
Absorbansi

R
05
20
25
10 15
Konsentrasi (ppm)

-
Data
........ Linear (Data)

Kesimpulan

Persamaan Garis Regresi: y = 0,0229x + 0,0335

R' = 0,992

ROBUSTNESS (KETAHANAN)

Anita Puspa Widiyana, S. Farm., M. Farm., Apt.

Ketahanan (Robustness)

Keandalan analisis yang berhubungan dengan variasi

yang disengaja

Pengukuran yang peka dengan kondisi analitis →

perlu kontrol dan

kehati-hatian

Kasus

Parasetamol standart dengan berat 10 mg dilarutkan

dalam 5 ml

metanol. Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 100,0

ml dan ditambahkan akuades sampai tanda batas.
Dipipet larutan sebesar

5,0 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 ml. Ke

dalam labu
ukur ditambahkan akuades sampai tanda batas.
Larutan diukur

pada panjang gelombang maksimum 242 nm, 243 nm

dan 244 nm.

Pengukuran absorbansi dilakukan replikasi 6 kali.

Hasil Uji

Replikasi

3
242 nm 243 nm 0,650 0,653 0,650 0,653 0,651 0,653
0,651 0,653 0,651 0,654 0,652 0,653
244 nm 0,657 0,656 0.656 0,657 0,657 0,657

Tahapan Penyelesaian
1. Hitung rata-rata masing-masing pengujian 2. Hitung
nilai SD masing-masing pengujian 3. Hitung nilai %
RSD sesuai dengan rumus

Tahapan Penyelesaian

1. Nilai rata-rata absorbansi

0,650+0,650+0,651+0,651+0,651+0,652

i
(x1 - x)2
10-6
= 3,905 = 0,651 2. Nilai standart deviasi (SD)

Ż (X, - 7)
- in= jumlah data
Data ke-1 (xi)
0,650 0,650 0,651
Rata-rata (x)
0,651 0,651 0,651
10-6
(xi-x) -0,001 -0,001 0,000 0,000 0,000
0,000

0,651
0,651 0,651
0,000

0,000
- 3.10 6 = 7,07 x 10-4
0,651 0,652
10-6
0,651
0,001
3.10-6
Ź (*: - *)

Tahapan Penyelesaian

3. Nilai % RSD

% RSD = P x 100%

7,07 x 10-4
0651X100% = 0,10 %

Hasil pengujian memenuhi syarat diperoleh % RSD

sebesar 0,10% (< 2%)
UJI KESESUAIAN SISTEM

Anita Puspa Widiyana, S. Farm., M. Farm., Apt.

Uji Kesesuaian Sistem

* Dilakukan sebelum validasi

Kriteria penerimaan dengan %RSD < 2% * Contoh:

absorbansi (spektrofotometri UV-Vis)

Kasus

Larutan standar siprofloksasin dengan konsentrasi

yang sama diukur serapannya dengan menggunakan
spektrofotometer UV Vis. Dari hasil pengujian
dilakukan perhitungan nilai % RSD untuk menentukan
uji kesesuaian sistem.
Hasil Uji

Sampel No.

1.
Absorbansi
0,660 0,661 0,660 0,660 0,660 0,660

Tahapan Penyelesaian

1. Tentukan nilai rata-rata absorbansi 2. Tentukan nilai

SD

3. Tentukan nilai % RSD

Tahapan Penyelesaian

1. Nilai rata-rata absorbansi

0,660+0,661 +0,660+0,660+0,660+0,660
 = 3,961 = 0,660 2. Nilai standart deviasi (SD)
Data ke-1 (xi)
0,660
(x; -x) 0,000 0,001
(xi - x)2 0,000
1
10-6
Ż(x,- 7
-
0,000
in= jumlah data
Rata-rata (x)
0,660 0,660 0,660 0,660 0,660 0,660
0,661 0,660 0,660 0,660 0,660
0,000 0,000
0,000 0,000 0,000
106
6 = 4,08 x 10-4
0,000
0,000

10-6

Ź (*. – 3)"

Tahapan Penyelesaian
3. Nilai % RSD

% RSD = P x 100%

4,08 x 10-4 ==
x 100% = 0,06 %
0,660 Hasil pengujian memenuhi syarat diperoleh %
RSD sebesar 0,06% (< 2%)

Kesimpulan

% RSD sebesar 0,06%