microbial

enumeration testing
verification &
validation

r e priyono workshop pt multi rejeki kita, by zoom, 29 september 2020

 VALIDASI /VERIFIKASI METODE
PENGUJIAN ENUMERASI MIKROBA
 VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE
ENUMERASI MIKROBA

1. PENDAHULUAN
2. ISTILAH DAN DEFINISI
3. PARAMETER VALIDASI/VERIFIKASI
4. VALIDASI, VERIFIKASI, KESESUAIAN METODE
5. PROTOKOL
 1. PENDAHULUAN
• Berdasarkan Kutipan: 21CFR 211.194, tentang Cara Produksi Obat yang
Baik (GMP), point.2) Bahwa metode yang digunakan dalam pengujian
sampel (produk) harus memenuhi standar akurasi dan keandalan yang
tepat dan Jika metode yang digunakan adalah edisi terbaru dari USP, NF,
AOAC International atau Referensi Standard lain yang diakui harus
dilakukan VERIFIKASI dalam kondisi penggunaan yang sebenarnya, apabila
tidak dilakukan modifikasi.
• Metode Validasi adalah proses yang digunakan untuk mengkonfirmasi
bahwa prosedur analitis yang dikembangkan untuk uji khusus/spesifik
sesuai untuk penggunaannya. Hasil dari validasi metode dapat digunakan
untuk menilai kualitas, keandalan dan konsistensi hasil analisis, dan menjadi
bagian integral dari praktik analitik yang baik.
• Metode Analisis perlu divalidasi atau direvalidasi:
a. sebelum diperkenalkan untuk penggunaan (metode) rutin
b. setiap kali kondisi berubah, metode tersebut telah divalidasi (misal, instrumen
dengan karakteristik berbeda atau sampel dengan matriks berbeda),
c. setiap kali metode berubah dan perubahan tsb di luar ruang lingkup asli metode
tersebut
 1. PENDAHULUAN

Validasi

 Tujuan dilakukannya validasi metode adalah bahwa

metode yang digunakan harus dikarakterisasi dengan
benar untuk menetapkan dengan jelas bidang
penerapannya dan kehandalan mutlak yang
diberikannya.

 Validasi metode pengujian mikrobiologi hendaknya

merefleksikan kondisi pengujian yang sebenarnya
dan dapat dicapai dengan : menggunakan produk
yang terkontaminasi alamiah atau produk yang
ditambahi (spiked) dengan organisme kontaminan
yang ditetapkan terlebih dahulu.
 1. PENDAHULUAN

Verifikasi

Tujuan dari verifikasi metode, antara lain:

• Untuk memastikan bahwa laboratorium/
analis dapat menerapkan metode tersebut
dengan baik (ketersediaan peralatan, fasilitas,
pereaksi, penguji, keterampilan dan
kompetensi).

• Untuk menjamin mutu hasil pengujian.

 2. ISTILAH DEFINISI
 Validasi metode analisis adalah proses pembuktian atau konfirmasi
pengujian yang obyektif di laboratorium, dan bahwa metode itu
memenuhi persyaratan yang telah ditentukan, yang sesuai dengan
tujuan penggunaannya. (SNI ISO/IEC 17025-2008; 5.4.5.1)

 Validasi sekunder / verifikasi metode adalah konfirmasi kembali

melalui pengujian dan penyediaan bukti obyektif bahwa persyaratan
tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi (untuk unjuk kerja
metode telah dipenuhi oleh masing-masing laboratorium).

Dilakukan verifikasi, jika laboratorium menggunakan atau

mengadopsi metode standar yang telah divalidasi.
 2.
2. ISTILAH
ISTILAH DAN DEFINISI
DEFINISI
• Limit deteksi (LOD) adalah kemampuan metode untuk
mendeteksi tingkat konsentrasi terendah atau jumlah
minimum dari analit yang maih dapat terdeteksi.
Metode berdasarkan kultur biasanya diharapkan mampu
mendeteksi organisme target tunggal dalam sampel besar,
dimana apabila tidak ada organisme yang terdeteksi hasilnya
dilaporkan sebagai <1 organisme per gram sampel atau mL
sampel.
• Limit kuantifikasi (LOQ) adalah jumlah atau konsentrasi
terendah dari analit yang masih dapat dideterminasi/
diukur secara kuantitatif (akurasi dan presisi) dengan
tingkat ketidakpastian yang dapat diterima. Juga disebut
sebagai limit derterminasi/batas penentuan.
.
 2. ISTILAH DAN DEFINISI
 Linearitas adalah kemampuan metode untuk
memberikan hasil yang sebanding dengan jumlah analit
yang ada dalam sampel atau
kemampuan metode analisis untuk menunjukkan
bahwa larutan sampel yang berada didalam rentang
konsentrasi mEmiliki respon analit yg proporsional
dengan konsentrasi.
• Rentang adalah Interval konsentrasi (tingkat atas dan
bawah) di mana metode telah dibuktikan dengan
memberikan presisi, akurasi dan linearitas yang sesuai
metode.
Dinyatakan dengan unit yang sama dengan hasil uji, misal : %ase,
cfu atau ppm
 2. ISTILAH DAN DEFINISI
 Spesifisitas/kekhususan adalah kemampuan metode
untuk mendeteksi/mengukur mikroba target secara
cermat dan seksama dengan adanya mikroba lain dalam
bahan/matriks.
Cara penetapan : fraksi koloni/biakan yang negatif pada
uji konfirmasi terhadap pengujian presumtif.
 Sensitivitas/kepekaan adalah kemampuan metode untuk
mendeteksi/mengukur mikroba target dalam jumlah
sekecil mungkin.
Cara penetapan: fraksi koloni/biakan yg positif pada uji
konfirmasi terhadap pengujian presumtif.
 2. ISTILAH DEFINISI
• Eksklusivitas/Spesifisitas adalah kemampuan
metode untuk membedakan target yang serupa
tetapi secara genetik berbeda dengan non-
target.
Metode dengan spesifisitas rendah memiliki angka
positif palsu yang tinggi.

• Inklusivitas/Sensitivitas adalah kemampuan

metode untuk mendeteksi berbagai target
dengan keterkaitan yang didefinisikan misalnya
taksonomi, imunologi, komposisi genetik.
 2. ISTILAH DEFINISI
• Reprodusibilitas adalah kedekatan kesepakatan
antara hasil pengukuran analit yang sama
dilakukan dalam berbagai kondisi pengukuran
Reproduksibilitas internal, variasi hasil pengujian berulang dg:
lab, metode, alat sama; sampel identik; penguji dan waktu
berbeda. Disebut juga Repitabilitas intermediat
Reproduksibilitas eksternal (ruggedness), presisi antar lab
(hasil studi kolaborasi) untuk pembakuan metode,
pengujian berulang dlm kondisi pengukuran dg metode
sama; sampel identik; lab, alat, penguji dan waktu
pengujian berbeda
 2. ISTILAH DEFINISI

• Repitabilitas/Pengulangan adalah Kedekatan

kesepakatan antara hasil pengukuran yang
berurutan dari besaran ukur yang sama dan
dilakukan dalam kondisi pengukuran sama
dalam interval waktu singkat.
Juga disebut Presisi intra-assay.
• Presisi dalam laboratorium = Sr
• Presisi antar laboratorium = SL
• SR = presisi dalam dan antar lab. dirumuskan sbb:
SR = √ Sr2 + SL2
 2. ISTILAH DEFINISI

• Presisi adalah Tingkat kesesuaian pengukuran

dalam kondisi tertentu (sampel dan kondisi
sama)
• Presisinya dijelaskan dengan metode statistik seperti
simpangan baku atau batas kepercayaan.
• Repitabilitas/Pengulangan mengungkapkan presisi
dalam kondisi pengerjaan yang sama dalam waktu
singkat.
• Presisi menengah/intermediat mengungkapkan variasi
dalam laboratorium, seperti hari, analis dan peralatan
yang berbeda.
• Reprodusibilitas mengungkapkan presisi antar
laboratorium (presisi inter-assay)
 2. ISTILAH DEFINISI

• Presisi dinyatakan :
simpangan baku = standard deviasi (SD)
SD = √ { ∑ (Xi – X )2 } / n -1

simpangan baku relatif = rsd = relative

standard deviation = cv
RSD = { SD / X } x 100%
 2. ISTILAH DEFINISI
• Analit adalah komponen (dhi. Mikroba) yang diukur
atau diperiksa dengan suatu metode analisis
• Akurasi adalah kemampuan metode untuk mendeteksi
dan mengukur nilai aktual atau nilai sebenarnya dari
mikroba target pada suatu sampel
 Akurasi relatif adalah tingkat kesesuaian antara respons
yg didapat dari metode alternatif dengan metode
acuan terhadap sampel yg dispike
 Cara penetapan
o Recovery analit  sampel produk ditambah analit pd
rentang konsentrasi yg sesuai
o Pembandingan hasil uji dr metode analisis yang sedang
divalidasi dg metode baku
 2. ISTILAH DEFINISI
Catatan:
• konsentrasi inokulum mikroba yang ditambahkan =
nilai sebenarnya
• Akurasi dinyatakan dengan
% Recovery = %ase nilai terukur thd nilai sebenarnya

% RECOVERY ( R ) = (A/B) 100%

RECOVERY RELATIF = (A/X) 100%

Dimana
A = hasil pengujian dg metode (alternatif)
B = hasil pengujian sebenarnya dari mikroba target
X = hasil pengujian metode baku
 2. ISTILAH DEFINISI
 Robustness / ketangguhan ukuran kemampuan
metode analisis untuk tidak terpengaruh oleh perubahan
atau variasi kecil dari parameter metode analisis yang
sengaja dibuat dan memberikan indikasi dalam
penggunaan normal
 Robustness diterapkan pada saat pembuatan atau
pengembangan metode analisis, dengan melihat faktor-
faktor yangg mempengaruhi hasil pengujian
 Pengujian yang sangat peka terhadap perubahan kondisi
analisis harus mendapat perhatian.
 2. ISTILAH DEFINISI
 Deviasi negatif/negatif palsu adalah metode alternatif
memberikan hasil deviasi negatif, artinya hasil uji negatif,
sedangkan metode acuan memberikan hasil positif
 Deviasi positif/positif palsu adalah metode alternatif
memberikan hasil deviasi positif, artinya hasil uji positif,
sedangkan metode acuan memberikan hasil negatif
 Metode kualitatif adalah metode analisis yg merespon ada
dan tidaknya analit didalam sejumlah tertentu sampel
 Metode kuantitatif adalah metode analisis yg merespons
sejumlah analit yang diukur secara langsung atau tidak
langsung didalam sejumlah tertentu sampel
 Metode acuan adalah metode yg diakui dan diterima secara
internasional
 PERSYARATAN LAB

• PERSONEL YANG KOMPETEN

• METODE STANDAR ATAU IN-HOUSE METHODS
• PERALATAN & INSTRUMEN TERKALIBRASI
• BAHAN ACUAN/MIKROBA ACUAN
• PROGRAM STATISTIK UNTUK MENGHITUNG,
MENGEVALUASI DAN MENGINTERPRETASIKAN HASIL
PENGUJIAN
• LAB TERAKREDITASI ISO 17025 ATAU CPOB ?
 MACAM VALIDASI
• USP 1223, METODE ALTERNATIF
• USP 1225, VALIDASI
• USP 1226, VERIFIKASI
• USP 1227, REKOVERI

• USP 60, KESESUAIAN

USP <1223>, 42nd

VALIDASI METODE
ALTERNATIF
 USP <1223>, 42nd
Outline Bahasan:
•Persyaratan Pengguna:
 kualifikasi instrumen
 validasi teknologi/metode alternatif
 kesesuaian metode
 batasan penggunaan CFU sebagai sinyal baku metode mikrobiologi
•Kesetaraan (hal baru):
 prosedur yang dapat diterima
 kesetaraan kinerja
 kesetaraan hasil
 kesetaraan keputusan
•Aplikasi konsep non-inferionitas terhadap validasi metode
•Pedoman metode statistik
•Metode mikrobiologi: metode kualititatif (ada dan tidaknya
mikroba/positif/negatif) dan metode kuantitatif (enumeratif,
kandungan mikroba didalam produk)
PARAMETER VALIDASI UJI KUALITATIF UJI KUANTITATIF
USP <1225>, 42ND

VALIDASI METODE
KOMPENDIAL
 KARAKTERISTIK KINERJA ANALITIK
VALIDASI METODE (USP <1225>)
• AKURASI
• PRESISI
• SPESIFISITAS
• BATAS DETEKSI
• LINEARITAS
• RENTANG
• ROBUSTNESS (KETANGGUHAN)
ELEMEN DATA YANG DIPERLUKAN UNTUK
VALIDASI (USP <1225>, 42)
 Keterangan :

• Kategori I : Prosedur analitis untuk penghitungan komponen utama

bahan obat curah atau bahan aktif (termasuk bahan pengawet) dalam
produk farmasi jadi.
parameter validasi :akurasi, presisi, spesifisitas, lineraritas dan rentang
: Prosedur analitis untuk penentuan kotoran (impurities)
dalam bahan obat massal atau senyawa degradasi dalam produk
farmasi jadi (Impurities test)
• Prosedur ini mencakup uji kuantitatif dan uji batas.
parameter validasi uji kuantitatif, semua kecuali batas deteksi
parameter uji batas, spesisifitas dan batas deteksi
: Prosedur analitis untuk menentukan karakteristik kinerja
(misalnya, disolusi, rilis obat, dan lain-lain)(Performance test)
parameter validasi, presisisi. lainnya sesuai kebutuhan metode
• Kategori IV : Uji identifikasi, parameter validasinya: spesifisitas
USP <1226>, 42ND

VERIFIKASI METODE
KOMPENDIAL
 USP <1226 >, 42ND
• Di Amerika Serikat, persyaratan ini (verifikasi) ditetapkan
dalam 21 CFR 211.194 (a) (2) Cara Produksi yang Baik
(GMP), yang menyatakan bahwa "Kesesuaian semua
metode pengujian yang digunakan harus diverifikasi
dalam kondisi penggunaan yang sebenarnya"
• Berdasarkan ketersediaan personel, peralatan, media dan
reagen
• Bab ini tidak membahas verifikasi prosedur mikrobiologi
karena sudah tercakup dalam bab uji umum USP, seperti:
• Uji Efektivitas Antimikroba (USP <51>),
• Pemeriksaan Mikrobiologis Produk Nonsteril: Uji Angka Mikroba (USP <61>),
• Pemeriksaan Mikrobiologi Produk Nonsteril: Uji untuk Mikroba Tertentu
(USP<62>),
• Uji Sterilitas (USP <71>),
• Validasi Pemulihan Mikroba dari Artikel Farmakope
(USP <1227>) Informasi Umum
 USP <1226 >, 42ND
PROSES VERIFIKASI
• Untuk prosedur uji kompendial adalah penilaian apakah
prosedur dapat digunakan untuk tujuan yang sebenarnya,
di bawah kondisi penggunaan yang sebenarnya untuk
bahan obat tertentu dan / atau matriks produk obat.
• Pengguna harus memiliki pengalaman, pengetahuan, dan
pelatihan yang sesuai untuk memahami dan mampu
melakukan prosedur kompendial seperti yang tertulis.
• Verifikasi harus dilakukan oleh pengguna sehingga
hasilnya akan memberikan keyakinan bahwa prosedur
kompendial akan bekerja sesuai dengan yang diinginkan.
 USP <1226 >, 42ND

• Jika verifikasi prosedur kompendial tidak berhasil, dan

bantuan dari staf USP belum menyelesaikan masalah,
dapat disimpulkan bahwa prosedur tersebut mungkin
tidak sesuai untuk digunakan dengan bahan/artikel
yang sedang diuji di laboratorium tersebut. Maka perlu
untuk mengembangkan General Notices, 6.30
Alternative and Harmonized Methods and Procedures..
Prosedur alternatif dapat diserahkan ke USP, bersama
dengan data yang sesuai, untuk mendukung proposal
penyertaan atau penggantian prosedur compendial saat
ini.
 USP <1226 >, 42ND

PERSYARATAN VERIFIKASI
• harus didasarkan pada penilaian kompleksitas prosedur
dan bahan yang akan digunakan dimana prosedur
diterapkan.
• tidak diperlukan validasi ulang lengkap dari metode
kompendial, cukup melakukan verifikasi kesesuaian
prosedur dalam kondisi penggunaan yang sebenarnya,
dan beberapa karakteristik kinerja analitis yang
tercantum dalam bab {1225},
• Tabel 2, dapat digunakan untuk proses verifikasi. Hanya
karakteristik yang dianggap sesuai untuk verifikasi
prosedur tertentu yang perlu dievaluasi.
 USP <1227>, 42ND

VALIDASI PEMULIHAN
MIKROBA DARI PRODUK
FARMASI
 USP <1227>, 42ND

• Panduan validasi metode untuk estimasi jumlah mikroba hidup,

untuk mendeteksi mikroba indikator atau mikroba yang tidak
dikehendaki, untuk validasi metode mikrobiologi yang digunakan
dalam pengujian efektivitas anti- mikrobial, dan untuk pengujian
sterilitas produk farmasi.
• Secara umum dipahami bahwa jika produk memiliki sifat
antimikroba karena adanya pengawet tertentu atau karena
formulasinya, sifat antimikroba ini harus dinetralkan untuk
memulihkan mikroba hidup.
• Netralisasi ini dapat dicapai dengan penggunaan penetral khusus,
dengan pengenceran, pencucian dan kombinasi pencucian dengan
pengenceran.
• Metode uji yang memerlukan validasi metode pemulihan, al.:
Pengujian Efektivitas Antimikroba (51), Uji Sterilitas (71), dan Uji
Enumerasi Mikroba (61) dan Uji untuk Mikroba Tertentu (62)
 USP <1227>, 42ND

FAKTOR BERPENGARUH
•Beberapa faktor mempengaruhi pengukuran aktivitas antimikroba
larutan uji,yaitu:
- pertimbangan desain validasi.
- sifat mikroba yang digunakan sebagai mikroba tantang,
- persiapan inokulum mikroba tantang,
- kondisi khusus pengujian, dan kondisi pemulihan.

•Mikroba tantang yang digunakan dalam uji kompendial ini adalah

bakteri Gram-positif, bakteri Gram negatif, khamir dan kapang.
•Jumlah mikroba tantang dan suhu inkubasi
USP <61> Microbiological Examination of
Nonsterile Products

MICROBIAL ENUMERATION
TESTS
 DAFTAR BAHASAN
• PENDAHULUAN
• PROSEDUR UMUM
• METODE ENUMERASI
• UJI PROMOSI PERTUMBUHAN, KESESUAIAN
METODE HITUNG DAN KONTROL NEGATIF
 UMUM
 PENYIAPAN STRAIN UJI
 KONTROL NEGATIF
 PROMOSI MEDIA PERTUMBUHAN
 KESESUAIAN METODE HITUNG DENGAN ADANYA PRODUK

• PENGUJIAN PRODUK
 USP <61>, MET

PENDAHULUAN
• Pengujian ini dilakukan untuk menghitung jumlah bakteri dan kapang mesofilik
yang mungkin tumbuh di bawah kondisi aerobik
• Metode ini tidak berlaku untuk menguji produk yang mengandung mikroba
hidup sebagai komposisi aktifnya.
• Prosedur mikrobiologi alternatif, termasuk metode otomatisasi dapat
digunakan, karena kesetaraannya telah dibuktikan sebagai metode
farmakope.

PROSEDUR UMUM
• Prosedur ini dilakukan determinasi di bawah kondisi dan dirancang untuk
menghindari kontaminasi mikroba luar (extrinsic) dari produk yang akan diuji,
dimana kehati-hatian tersebut untuk mencegah kontaminasi tetapi tidak
berpengaruh terhadap mikroba yang akan diungkapkan dalam pengujian.
• Bila produk mengandung aktifitas antimikroba, sedapat mungkin dipindah
atau dinetralkan, bila digunakan inaktivator, khasiat dan tidak adaan toksisitas
untuk mikroba harus dibuktikan. Juga zat surfaktan (surface-active subtances)
 USP <61>, MET

METODE HITUNG/ENUMERASI:

Secara langsung : Filtrasi Membran dan Metode Angka

Lempeng Total (ALT).
Tidak Langsung: Most Probable Number (MPN/Angka Paling
Mungkin, APM).

MPN, secara umum metode angka mikroba yang akurasinya

rendah, tetapi untuk produk tertentu yang bioburden nya sangat
rendah, metode ini dianggap paling sesuai.
Pilihan metode berdasarkan faktor-faktor seperti alami produk,
persyaratan batas cemaran mikroba. Metode yang dipilih hanya
mungkin untuk menguji ukuran sampel yang cukup untuk
menilai kesesuaiannya dengan spesifikasi.
Kesesuaian dari metode yang dipilih harus ditetapkan.
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN, KESESUAIAN METODE HITUNG
DAN KONTROL NEGATIF

• UMUM, kemampuan pengujian untuk mendeteksi mikroba yang ada

dalam produk yang diuji harus ditetapkan. Kesesuaiannya harus
dikonfirmasi, bila perubahan kinerja uji atau perubahan dalam produk
yang mempengaruhi keluaran uji, harus diperkenalkan.
• PENETAPAN STRAIN UJI
 Gunakan suspensi baku stabil dari strain uji (inokululm) , teknik
pemeliharaan seed-lot culture yang digunakan mikroba hidup
untuk inokulasi hanya sampai pasase ke 5 dari master culture.
 Tabel 1, menyajikan bakteri, kapang dan khamir yang digunakan
untuk uji kesesuaian dan promosi pertumbuhan.
Suspensi uji : Sodium-Chloride Peptone Solution (Peptone Saline
Solution, pH 7,0); Phosphate Buffer Solution, pH 7.2; 0,05%
Polysorbate 80 dapat digunakan untuk melarutkan spora
A.brasiliensis, suspensi dapat digunakan dalam 2-24 jam
disimpan di lemari pendingin 2-8C
TABEL1, TABEL 2 & TABEL 3
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN, KESESUAIAN METODE HITUNG
DAN KONTROL NEGATIF

• NEGATIF KONTROL
Untuk memverifikasi kondisi pengujia, kontrol negatif dilakukan dengan
menggunakan pengencer yang digunakan pada saat persiapan uji,
hasilnya harus NEGATIF. Bila perlu media yang digunakan juga harus diuji
sterilitasnya. Perlu investigasi bila hasilnya positif terhadap kontrol
negatif.

• PROMOSI MEDIA PERTUMBUHAN

- Uji setiap bets media siap pakai atau media yang dibuat sendiri (dari
dehydrated media)
- Inokulasi media SCDB dan SCDB dalam tabung dan cawan Petri dengan
inokulum mikroba (Tabel 1) dengan jumlah < 100 cfu, inkubasi sesuai
Tabel 1
- Untuk media padat (SCDA, PDA, SDA) pertumbuhan mikroba yang
diinokulasi tidak boleh lebih 2 kali nilai inokulum baku
- Untuk media cair, dilihat adanya pertumbuhan pada media, menjadi keruh
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN,.....

• KESESUAIAN METODE HITUNG DENGAN ADANYA PRODUK

• Metode penyiapan sampel tergantung pada ciri fisik produk yang diuji. Apabila tidak ada
prosedurnya dapat dikembangkan metode alternatif
• Produk larut Air: larut atau encerkan (1:10) produk dalam PSS 7,0; BPS, 7,2; SCDB, atur
pH 6-8, bila perlu, pengenceran selanjutnya dengan pengencer sama
• Produk non-lemak tidak larut Air: larut atau encerkan (1:10) produk dalam PSS 7,0; BPS,
7,2; SCDB, tambahkan 1 g Polisorbat 80 (surfaktan) per L untuk membantu suspensi yang
susah larut tersebut, atur pH 6-8, bila perlu.
• Produk berlemak: larutkan dalam isopropil miristat steril (dengan filtrasi membran), campur
dengan sedikit polisorbat 80 steril atau pereaksi surfaktan non-penghambat lainnya, bila perlu
dipanaskan 40C atau hal tertentu 45 C. Aduk hati-hati pada waterbath dan cukupkan
dengan pengencer yang hangat hingga perbandingan 1:10, bila bentuk suspensi segera
lakukan.. Lakukan pengenceran desimal berikutnya dengan pengencer yang mengandung
polisorbat 80 atau surfaktan lainnya.
• Cairan atau Padatan dalam bentuk Aerosol: secara aseptik pindahkan produk kedalam
wadah MF wadah steril
• Transdermal Patches: lakukan secara aseptik untuk mencegah kontaminasi, buka dan
pindahkan kemasan, dan letakkan, perekat bagian atas ke nampan plastikatau gelas steril.
Tutup permukaan perekat dengan bahan steril berpori yang sesuai untuk mencegah
perekatan kembali. Transfer pengencer yang mengandung inaktifator seperti Polisorbat 80
dan / atau Lesitin ke patches dan kocok hati hati sedikit 30 menit.
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN,.....

 Tambahkan secara langsung sampel di atas dan kontrol

(positif, tanpa bahan uji/produk) dalam volume secukupnya
suspensi mikroba (inokulum) yang mengandung < 100 cfu
 Volume suspensi inokulum < 1% volume produk terlarut
 Untuk menunjukkan pemulihan mikroba yang dapat diterima
dari produk, faktor pengenceran terendah dari sampel yang
disiapkan harus digunakan untuk uji. Bila hal ini tidak
memungkinkan jarena aktifitas antimikroba dan solubilitas
rendah, perlu dibuat protokol pengembangan baru.
 Apabila hambatan pertumbuhan dari sampel tidak dapat
dihindari, alikuot suspensi mikroba ditambahkan setelah
netralisasi, pengenceran atau filtrasi.
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN,.....

 Jumlah mikroba yang dipulihkan dari sampel yang disiapkan dan

diencerkan dan diinkubasi seperti tersebut di atas, bandingkan
jumlah mikroba yang dipulihkan dengan kontrol (tanpa produk)
 Apabila pertumbuhan terhambat (pengurangan dengan faktor > 2),
lakukan modifikasi prosedur untuk uji enumerasi tertentu untuk
menjamin validitas hasil, contoh modifikasinya:
- menambah volume pengencer atau medium biakan
- penggabungan pereaksi penetral umum atau khusus kedalam
pengencer
 Filtrasi membran
 Kombinasi modifikasi di atas
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN,.....

 Bahan Penetral, Tabel 2 menyajikan bahan Penetral untuk

menetralkan aktifitas bahan antimikroba, dapat ditambahkan
pada pengencer sebelum sterilisasi
 Khasiat dan tidak adanya toksisitas dari mikroba harus di
tunjukkan dengan melalui blanko dengan penetral dan tanpa
produk.
 Apabila tidak ada metode penetral yang sesuai, dapat
diasumsikan bahwa kegagalan untuk mengisolasi mikroba
inokulat, dapat dilakukan (attributable) aktifitas antimikroba dari
produk. Ini menunjukkan bahwa sampel tidak mungkin
dikontamiasi dengan spesies mikroba tertentu.
 Lakukan pengujian dengan faktor pengenceran tertinggi yang
selaras dengan pertumbuhan mikroba dan kriteria penerimaan
khusus.
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN,.....

 Setiap mikroba di daftar, lakukan uji terpisah, hanya mikroba yang digunakan
sebagai strain uji yang dihitung:
 Filtrasi Membran, membran Ф 0,45 m, membran yang dipilih adalah
efisiensinya menahan bakteri dan tidak mempengaruhi komponen sampel yang
akan diselidiki/diuji.
 Setiap mikroba hanya menggunakan satu membran filter.
 Transfer jumlah sampel yang sesuai seperti diterangkan pada penyiapan
sampel (1 g produk , atau kurang apabila jumlah koloni lebih besar dari yang
diharapkan) ke filter membran, lakukan penyaringan segera, dan bilas filter
membran dengan pengencernya.
 Untuk determinasi angka mikroba total, pindahkan membran ke permukaan
media SCDA, untuk angka kapang khamir, pindahkan membran ke
permukaan media SDA, inkubasi dan hitung koloni yang tumbuh (Tabel 1).
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN,.....

 Metode Angka Lempeng / ALT

 Metode tuang, buat pengenceran desimal (lihat penyiapan
sampel) sesuai kebutuhan, pipet 1 mL enceran kedalam cawan
Petri, tuangkan 15 mL media SCDA untuk Mikroba dan SDA untuk
kapang khamir (suhu 45C) ke setiap cawan, goyangkan pelan2
agar sampel terdistribusi merata dalam agar, duplo. Inkubasi
(Tabel 1) dan hitung koloni yang tumbuh
 Metode sebar, tuang 15 mLmedia SCDA dan media SDA pada
cawan Petri, buat pengenceran sampel secara desimal sesuai
kebutuhan, pipet 0,1 mL enceran dan tuangkan ke atas media
SCDA untuk mikroba total dan SDA untuk kapang khamir,
sebarkan dengan dengan hockey stick glass sampai merata,
duplo. Inkubasi (Tabel 1) dan hitung koloni yang tumbuh.
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN,.....

 Metode MPN :
 Presisi dan akurasi metode MPN kurang dari metode Filtrasi
Membran dan Metode Hitung Lempeng
 Metode ini tidak digunakan untuk uji kapang khamir, karena
hasilnya tidak nyata (unrealible)
 Siapkan 3 seri pengenceran desimal (misal: 10-1, 10-2 dan 10-3);
dari setiap tingkat pengenceran, 3 alikuot 1 g atau 1 mL
digunakan untuk menginokulasi 3 tabung berisi 9-10 mL SCDB,
bila perlu ditambahkan Polisorbat 80 atau inaktifator pereaksi
antimikroba ke dalam media; jadi disiapkan 3 tabung media
SCDB untuk setiap tingkat pengenceran (ada 3 tingkat), butuh 9
tabung
 Inkubasi semua tabung pada 30-35C, selama tidak lebih 3 hari;
bila kesulitan dalam membaca hasil produk uji, lakukan
subkultur ke SCDB atau SCDA, inkubasi pada suhu sama dan
selama 1-2 hari. Hasil dirujuk ke Tabel 3 MPN
 UJI PROMOSI PERTUMBUHAN,.....

• HASIL DAN INTERPRETASI

 PENGUJIAN PRODUK
• JUMLAH YANG DIGUNAKAN UNTUK
UJI
• PENGUJIAN PRODUK
o Filtrasi Membran
o Metode Angka Lempeng (ALT)
o Metode MPN
• INTERPRETASI HASIL
 PENGUJIAN PRODUK
• JUMLAH YANG DIGUNAKAN UNTUK UJI
• Gunakan 10 g atau 10 mL produk yang akan diuji. Sampel Cairan dan Padatan
dalam bentuk aerosol, 10 kemasan. Sampel transdermal patches, 10 patches.
• Jumlah yang akan diuji menurun untuk bahan aktif yang akan diformulasikan
dalam kondisi sbb: jumlah per unit dosis (misal tablet, kapsul atau injeksi) < atau
sama 1 mg atau jumlah < 1 mg (penyiapan tidak mewakili unit dosis). D.h.i.,
jumlah sampel yang diuji tidak kurang dari jumlah yang ada dalam 10 unit dosis
atau 10 g atau 10 mL produk.
• Untuk bahan digunakan sebagai zat aktif dimana jumlah sampel terbatas atau
ukuran bets terlalu kecil (misal < 1000 mL atau 1000 g), jumlah yang diuji harus
1% dari bets.
• Untuk produk dengan jumlah bets kurang dari 200 (misal sampel untuk
percobaan klinis). Ukuran sampel diturunkan menjadi 2 unit, bila ukuran < 100.
• Pilih sampel secara acak dari bahan curah dari wadah yang sesuai, untuk
memperoleh jumlah yang diperlukan, aduk isi dari jumlah yang mencukupi dari
wadah untuk dijadikan sampel uji.
 PENGUJIAN PRODUK
• PENGUJIAN PRODUK
o Filtrasi Membran, gunakan alat filtrasi yang memungkinkan
untuk transfer filter ke media, siapkan sampel menggunakan
metode yang ada pada uji kesesuain, transfer sejumlah
tertentu masing-masing ke dua filter membran, segera saring
dan bilas sesuai dengan uji kesesuaian.
Untuk uji ALT, transfer filter membran ke permukaan media
SCDA, inkubasi 30-35C, selama 3-5 hari; untuk uji AKK,
transfer filter membran ke permukaan media SDA, inkubasi
20-25C, selama 5-7 hari. Hitung jumlah koloni (cfu) per g
atau mL produk.
Untuk sampel transdermal patches, saring 10% dari volume
penyiapan yang diterangkan pada penyiapan sampel.
o Metode MPN, siapkan dan buat p)engenceran sesuai metode
uji promomosi dan kesesuaian (3 konsentrasi dengan 3
ulangan, 9 tabung media SCDB, inkubasi 30-35C, selama 3-
5 hari. Bila perlu subkultur, gores SCDB positif ke media
SCDA, jumlah positif pada tiap enceran di rujuk ke tabung
MPN.
 PENGUJIAN PRODUK
o Metode Angka Lempeng (ALT), lakukan seperti pada uji
promosi dan kesesuaian, lakukan secara duplo. Untuk ALT
gunakan media SCDA, inkubasi 30-35C, selama 3-5 hari dan
uji AKK gunakan media SDA, inkubasi 20-25C, selama 5-7
hari .
o Setalah inkubasi, hitung koloni ALT, pilih koloni per cawan <
250 cfu; AKK pilih koloni < 50 cfu, ambil rata-rata duplo,
hitung jumlah koloni x faktor pengenceran = cfu per g atau
per mL produk.
o Cara tuang, pipet 1 ml alikuot ke dala cawan Petri dan
ditambahkan media SCDA atau SDA, aduk merata, duplo.
Inkubasi dengan posisi cawan Petri terbalik.
o Cara sebar, tuang media cair SCDA pada cawan Petri, hal sama
untuk SDA, setalah memadat, pipet 0,1 mL alikuot ke
permukaan media dan ratakan, duplo. Inkubasi dengan posisi
cawan Petri tidak dibalik.
 INTERPRETASI HASIL

• ALT/TAMC, jumlah koloni yang tumbuh pada media SCDA, bila koloni jamur
(kapang dan khamir) terdeteksi pada media ini, mereka dihitung sebagai bagian
dari ALT, total jumlah kapang dan khamir yang tumbuh semestinya sama
dengan jumlah koloni yang tumbuh pada SDA.
• Sebaliknyabila koloni bakteri terdeteksi pada media SDA, mereka dihitung
sebagai bagian dari AKK/TYMC. Ketika AKK, diharapkan melebihi kriteria
keberterimaan karena ada pertumbuhan bakteri, maka media SDA dapat
ditambahkan antibiotik (misal kloramfenikol, asam tartrat)
• Apabila pengujian dengan metode MPN, nilai terhitung sebagai ALT.
• Ketika kriteria keberterimaan mutu mikrobiologi ditetapkan, interpretasinya, sbb.:
• 101 cfu : maksimum angka yang diterima = 20
• 102 cfu : maksimum angka yang diterima = 200
• 103 cfu : maksimum angka yang diterima = 2000
 4. PROTOKOL VALIDASI

Protokol validasi merupakan prosedur teknis untuk

melakukan validasi metode mikrobiologi, meliputi:
-Metode analisis
-Perlakuan (treatment)
-Jumlah sampel
-Prosedur
-Interpretasi hasil
-Pelaporan/dokumentasi
ADA PERNYATAAN ATAU PERTANYAAN...........