PUBLIC Training (online)

Validasi
& VERIFIKASI
METODE

VALIDASI & VERIFIKASI

METODE PENGUJIAN Mikrobiologi
22 November 2022

Rumah Mutu Indonesia

 rumahmutu.id

THE VERIFICATION OF
REFERENCE AND VALIDATED ALTERNATIVE
METHODS
IMP LE MENTED IN A SIN GLE LA BORATORY
Oleh: RUSMADI EKO PRIYONO

REVISI ISO 16140:2004

Seri ISO 16140 telah diperluas sebagai tanggapan atas kebutuhan akan berbagai cara untuk
memvalidasi atau memverifikasi Metode uji. Ini adalah penerus ISO 16140:2003. Seri ISO 16140 ini
terdiri dari 6 bagian dengan judul umum, Mikrobiologi rantai makanan — Metode validasi:

2 *

1
 MATERI BAHASAN
rumahmutu.id

• Istilah dan Definisi

• Prinsip Verifikasi Metode Kualitatif dan Metode Kuantitatif (Verifikasi
Implementasi dan Verifikasi Item (Pangan)
• Protokol Teknis Verifikasi
 Metode Kualitatif : Estimasi LOD50(eLOD50)
 Metode Kuantitatif : Simpangan Baku Reprodusibilitas Intralab (SIR),
Estimasi Bias (eBias)
 Metode typing dan metode konfirmasi alternatif tervalidasi
• Contoh - contoh

3 *

rumahmutu.id

ISTILAH & DEFINISI

2
 ISTILAH DAN DEFINISI
• Metode konfirmasi alternatif atau metode pentipean/typing
metode konfirmasi atau metode petipean yang diajukan untuk validasi
metode analisis yang menegaskan atau mentipekan analit yang sama
dengan yang dikonfirmasi atau ditipekan menggunakan metode acuan
yang sesuai.
Catatan 1 untuk masuk: Metode ini dapat menjadi hak milik. Istilah
"alternatif" digunakan untuk merujuk pada keseluruhan "prosedur uji
dan sistem reaksi”. Istilah ini mencakup semua bahan, baik bahan
maupun lainnya, yang diperlukan untuk mengimplementasikan metode.
• Bias, bias pengukuran
perkiraan kesalahan pengukuran sistematis, atau perbedaan sistematis
antara nilai yang ditetapkan secara kuantitatif dan rata-rata hasil ulangan
pengukuran

5 *

ISTILAH DAN DEFINISI

• Kategori (Pangan).
kelompok jenis (pangan), asal yang sama
• Estimasi LOD50 , (eLOD50)
penentuan LOD50 (tingkat deteksi pada probabilitas deteksi 50%) berdasarkan rancangan
percobaan yang dijelaskan dalam dokumen ini
Catatan 1 untuk masuk: Penentuan LOD50 yang akurat tidak dimungkinkan karena jumlah sampel
yang diuji kecil dibandingkan dengan jumlah sampel yang dipersyaratkan dalam ISO 16140-
2:2016. Oleh karena itu, istilah "diperkirakan LOD50"(“eLOD50”) digunakan dalam dokumen ini.
• Studi eksklusivitas
studi yang melibatkan strain murni non-target, yang berpotensi reaktif silang, tetapi tidak
diharapkan dapat dideteksi atau dihitung dengan metode alternatif
• Laboratorium pengguna
laboratorium yang menerapkan metode alternatif tervalidasi dan/atau metode acuan
tervalidasi

6 *

3
 ISTILAH DAN DEFINISI
• Studi inklusivitas
studi yang melibatkan strain target murni (3.15)
dapat dideteksi atau dihitung dengan metode
alternatif
• Jenis/item (pangan)
pangan tertentu, pakan, lingkungan atau matriks
produksi primer CONTOH Kategori pangan: susu
olahan panas dan produk susu. Jenis makanan:
produk susu pasteurisasi.Item/jenis makanan:
crème brûlée.
• Sampel laboratorium
sampel disiapkan untuk dikirim ke laboratorium
dan dimaksudkan untuk inspeksi atau pengujian
• Matriks
semua komponen sampel
7 *
ISTILAH DAN DEFINISI
• Ruang lingkup validasi
kategori, matriks, analit, dan konsentrasi yang
metode analisisnya sudah divalidasi dapat digunakan
secara memuaskan
• Strain target/ sasaran
Strain, didefinisikan sesuai dengan ruang lingkup
metode acuan, yang diharapkan dapat dikonfirmasi,
dideteksi atau dihitung dengan metode alternatif
• Porsi uji
Sampel representatif terukur (volume atau massa)
yang diambil dari sampel laboratorium, untuk
digunakan dalam penyiapan suspensi awal
8 *
• Ruang lingkup aplikasi laboratorium
kategori, matriks, analit dan konsentrasi untuk
metode analisis yang digunakan laboratorium
pengguna dan mengklaim mampu
memuaskan pengujian di laboratorium
Catatan 1 untuk entri: Suatu metode mungkin
telah divalidasi ke kisaran (cakupan) yang
lebih luas dari analit, matriks, dan konsentrasi
dari ruang lingkup yang akan diklaim oleh
laboratorium pengguna. Ruang lingkup
aplikasi laboratoriumadalah ≤ ruang lingkup
validasi.
• Sampel uji
sampel disiapkan dari sampel laboratorium, sesuai
dengan prosedur yang ditentukan dalam metode
pengujian dan dari mana porsi uji diambil. Catatan
untuk masuk: Untuk metode konfirmasi dan pentipean,
sampel adalah koloni yang diisolasi pada media
selektif atau non-selektif tertentu.
• Jenis/tipe (pangan).
untuk kategori (pangan) tertentu), sekelompok item
(pangan) yang diproses dengan cara serupa, dengan
kesamaan karakteristik intrinsik dan ekologi mikroba
yang serupa
4
 rumahmutu.id

PENDAHULUAN

PENDAHULUAN
Ada dua tahapan yang diperlukan sebelum metode dapat digunakan di
dalam suatu Laboratorium, yaitu:
Tahap pertama adalah Validasi Metode. Tahap kedua adalah Verifikasi Metode,
• laboratorium mendemontrasikan bahwa
• Validasi dilakukan menggunakan studi
metode tervalidasi dapat
dalam laboratorium tunggal dan diikuti
dilaksanakan/dipraktikkan secara
oleh studi antar laboratorium (interlab) memuaskan.
(Lihat ISO 16140-2, ISO 16140-5 dan ISO
• Ini akan dijelaskan pada dokumen/materi
16140-6).
ini (ISO 16140-3).
• Dalam hal ini bila metode divalidasi dalam • Verifikasi hanya dapat diterapkan terhadap
satu laboratorium (ISO 16140-4), studi metode yang telah divalidasi dengan cara
antar laboratorium tidak dilakukan. studi antar laboratorium (interlab.)

10 *

5
 SERI ISO 16140 VALIDASI METODE MIKROBIOLOGI RANTAI PANGAN

Adakah persyaratan Memvalidasi

MULAI: Apakah metode (mis.legal) spesifik metode Pilih
tervalidasi (ciri kinerja diberikan tertentu menggunakan alternatif (milik/ ISO 16140-2
)? ISO 16140:2003 /ISO proprietary)
Memvalidasi Pilih
16140-2 ?
metode no-milik ISO 16140-5

Validasi lab-
Pilih
tunggal ISO 16140-4
Pilih
Memvalidasi
ISO 17468
metode acuan
Apakah metode divalidasi dg ISO 16140-4 Pilih
ISO 16140-2

Terapkan metode hanya dalam lab

tertentu (termasuk lingkup
tambahan)
Apa kategori (pangan) yg diuji Untuk tambahan dari lingkup metode acuan Pilih
termasuk lingkup validasi metode ? ISO 17468
Untuk tambahan dari lingkup metode alternatif (milik) tervalidasi Pilih
menurut ISO 16140-2 ISO 16140-2
Untuk tambahan dari lingkup metode non-milik/proprietary Pilih
tervalidasi menurut ISO 16140-2 ISO 16140-5

Penggunaan jenis (pangan) dalam lab tunggal, dalam kasus:

a) Metode alternatif (milik) tervalidasi menurut ISO 16140-2 Pilih
Pilih b) Metode non-milik tervalidasi menurut ISO 16140-5 ISO 16140-4
ISO 16140-3 c) Metode acuan dengan ciri kinerja, atau
d) Metode acuan tanpa ciri kinerja
(verifikasi)
Gambar 1. Flow chart aplikasi seri SO 16140
11

GAMBAR 2. PENGGUNAAN METODE KONFIRMASI ALTERNATIF TERVALIDASI

(LIHAT ISO 16140-6)
Metode Acuan
Metode Deteksi
Konfirmasi:
Porsi Uji Pengkaya Isolasi : Agar Selektif - biokimia Metode konfirmasi alternatif
- imunologi tervalidasi menurut
Metode Enumerasi - molekuler dokumen ini [ validasi untuk
- dll Agar Selektif ]
Porsi Uji Enumerasi : Agar Selektif

Metode alternatif tervalidasi menurut ISO 16140-2

Konfirmasi tidak
Metode Deteksi
termasuk dalam
Porsi Uji Prosedur
Protokol Metode
Deteksi
Alternatif Berbagai prosedur Dicakup dengan
Metode Enumerasi
Porsi Uji Prosedur Konfirmasi konfirmasi untuk Validasi
Metode Alternatif menurut
Enumerasi termasuk
berdasarkan Metode Dokumen ini
dalam
Acuan atau Kofirmasi
Protokol
dimulai dari Agar Isolasi Tidak dicakup
Metode
yang termasuk dalam dengan Validasi
Alternatif
studi validasi menurut menurut
ISO 16140-2 Dokumen ini

12 *

6
 APA ITU VALIDASI DAN VERIFIKASI ?
VALIDASI
Penetapan karakteristik kinerja
suatu metode dan penyediaan bukti
obyektif bahwa persyaratan kinerja
untuk tujuan penggunaan tertentu
telah dipenuhi
13 *
ADA 2 MACAM VERIFIKASI YANG BERBEDA:
A. Verifikasi Implementasi
Bertujuan untuk mendemonstrasikan
bahwa Laboratorium pengguna mampu
menerapkan metode tersebut secara
benar.
Lab pengguna menguji item (pangan) yang
digunakan dalam studi validasi (untuk
metode kualitatif) dan berbagai item
(pangan) didalam lingkup validasi (untuk
metode kuantitatif) dan kemudian
membandingkan hasil yang didapat dari
verifikasi terhadap hasil yang didapat dari
validasi.
14
*
VERIFIKASI
Unjuk kerja bahwa metode
tervalidasi di tangan pengguna
bekerja sesuai dengan spesifikasi
metode yang telah ditentukan
dalam studi validasi dan sesuai
dengan tujuan yang dimaksudkan.
B. Verifikasi Item (Pangan)
Bertujuan untuk mendemonstrasikan
bahwa laboratorium pengguna mampu
menguji item (pangan) yang diklaim atau
dinyatakan dalam lingkup penerapan
laboratorium.
Laboratorium pengguna menguji item
(pangan) yang termasuk dalam lingkup
validasi yang umumnya diuji oleh
pengguna.
Karena tidak semua item (pangan) dapat
termasuk dalam verifikasi, maka
laboratorium pengguna diminta untuk
menguji item (pangan) yang menantang.
7
 TIGA LINGKUP PRODUK
(KATEGORI, TIPE DAN ITEM) YANG BERBEDA
Lingkup dipisahkan (kelompok) produk – kategori atau tipe atau item, yang
mana metodenya dapat diterapkan.
Ada tiga lingkup yang berbeda, yaitu:
A. Lingkup Metode (kelompok) Produk: kategori atau tipe atau item, yang
mana metodenya dinyatakan sudah dapat diterapkan (aplikabel)
B. Lingkup Validasi (kelompok) Produk: kategori atau tipe atau item, yang
mana aplikabilitas dari metode dinyatakan telah divalidasi
C. Lingkup Penerapan Laboratorium: kategori atau tipe atau item, yang mana
metode tersebut dinyatakan dapat digunakan oleh Lab dan didalam
lingkup validasi.
Tetapi terjadi overlap diantara ketiga lingkup tersebut (lihat Gambar berikut)

15 *
GAMBAR 3. OVERLAP ANTARA LINGKUP
BERBEDA ( TERMASUK CONTOHNYA)

16

8
 LINGKUP METODE VS VALIDASI VS PENERAPAN LAB

Metode Validasi Laboratorium

Lingkup
Itu menentukan Metode
(kelompok dari)
Itu menentukan Itu menentukan
produk
(kelompok dari) (kelompok dari) (kategori/tipe/ item) Lingkup
produk produk yang metodenya Validasi
(kategori/tipe/ (kategori/tipe/ diklaim dapat
item) yang item) yang digunakan oleh Lingkup
metodenya metodenya Lab dan berada penerapan
diklaim dapat diklaim dapat dalam lingkup Lab

diterapkan divalidasi validasi

17 *

LINGKUP : BERBAGAI PANGAN LUAS

Gambar 4. Item pangan diperlukan ketika memverifikasi metode
dengan lingkup berbagai pangan luas
Lingkup Validasi Lingkup Penerapan
Metode Acuan divalidasi atau Metode Laboratorium
Kategori Alternatif divalidasi menurut ISO 16140-2 Lingkup berbagai pangan yang luas
Pangan atau 16140-5
Lingkup berbagai pangan yang luas Verifikasi
yang diuji
selama Kategori 1 Tipe Item Implementasi
Kategori 2 Tipe Item
Validasi
Kategori 3 Tipe Item - Metode Kualitatif: Pilih 1 item pangan yang diuji
Kategori 4 Tipe Item selama studi validasi dari Lingkup penerapan Lab
Kategori 5 Tipe Item
- : Pilih berbagai item pangan dari
Lingkup penerapan Lab
Kategori 6 Tipe Item
Kategori ........
Pangan yang ........
tidak diuji Verifikasi Item (Pangan)
........
selama
Validasi, tetapi
termasuk - PILIH minimum 5 item Pangan Menantang
Lingkup masing-masing 1 dari Kategori Pangan berbeda
Validasi yang ada pada Lingkup Penerapan Lab.

18

9
 LINGKUP : BERBAGAI PANGAN TERBATAS
Gambar 5. Item pangan diperlukan ketika memverifikasi metode dengan lingkup
berbagai pangan terbatas
Lingkup Validasi Lingkup Penerapan Laboratorium

Metode Acuan divalidasi atau

Metode Alternatif divalidasi menurut
ISO 16140-2 atau 16140-5 Verifikasi
Lingkup berbagai pangan terbatas Implementasi
Kategori - Metode Kualitatif: Pilih 1 item pangan yang
Pangan diuji selama studi validasi dari Lingkup penerapan
yang diuji Kategori 1 Tipe Item Lab
Kategori 2 Tipe Item - : Pilih berbagai item pangan
selama
Kategori 3 Tipe Item dari Lingkup penerapan Lab
Validasi

Verifikasi Item
(Pangan)

Bila Lingkup Validasi mencakup < 5 Kategori Pangan, PILIH

minimum 1 item pangan yang menantang dari setiap Kategori
Pangan yang ada pada Lingkup Penerapan Lab.

19

PADA DOKUMEN ISO 16140

“shall” menunjukkan Persyaratan

“should” menunjukkan Rekomendasi
“may” menunjukkan Izin
“can” menunjukkan kemungkinan atau kemampuan

20

10
 rumahmutu.id

4. PRINSIP UMUM VERIFIKASI METODE (DETEKSI)

KUALITATIF & METODE KUANTITATIF

21

PRINSIP UMUM VERIFIKASI METODE (DETEKSI)

KUALITATIF & METODE KUANTITATIF (4)
UMUM (4.1)
Verifikasi metode (deteksi) kualtitatif dan metode kuantitatif dilakukan dalam 2 cara:
A. verifikasi implementasi;
B. verifikasi item (pangan).

Laboratorium fokus pada item (pangan) yang ada dalam lingkup validasi dan lingkup aplikasi lab.
Sebelum melakukan verifikasi metode, lab pengguna harus mengacu pada laporan validasi yang dipublikasikan
Badan Standar yang diakui dan/atau Badan Sertifikasi Metode sebagai sumber untuk lingkup validasi dan
memilih item (pangan) yang sesuai untuk verifikasi.
Verifikasi implementasi terjadi sebelum verifikasi item (pangan). Aturan teknis untuk melakukan verifikasi
implementasi dan verifikasi item (pangan) dijelaskan pada Klausul 5. untuk metode kualitatif dan Kalusul 6.
untuk metode kuantitatif.
Untuk verifikasi metode acuan yang belum tervalidasi, lab pengguna harus menggunakan protocol teknis
seperti dijelaskan dalam Lampian F

22 *

11
 PRINSIP UMUM VERIFIKASI METODE (DETEKSI) KUALITATIF &
METODE KUANTITATIF (4)
Verifikasi implementasi (4.2)
Verifikasi bertujuan untuk mendemonstrasikan kompetensi laboratorium pengguna dalam menggunakan metode
tervalidasi. Hal ini dicapai dengan kemampuannya untuk memperoleh hasil yang diharapkan dari item (pangan)
Laboratorium pengguna harus::
mengkaji data validasi dari metode tersebut;
Untuk metode kualitatif:
memilih satu item (pangan) yang diuji selama studi validasi yang termasuk dalam ruang lingkup penerapan
laboratorium dari lab pengguna;
Apabila item (pangan) tersebut yang ada dalam studi validasi tidak masuk dalam lingkup penerapan lab dari
lab pengguna, lab pengguna harus memperoleh 1 dari item (pangan) tersebut; hal ini penting karena
batas deteksi (LoD ) metode dipengaruhi oleh item (pangan) tersebut.
Untuk melakukan verifikasi impelementasi menggunakan item (pangan) terpilih dan ukuran sampelnya yang
digunakan pada studi validasi.
Untuk metode kuantitatif: pilih berbagai item (pangan) yang masuk dalam lingkup validasi metode, tetapi tidak
perlu menguji selama validasi)

23
*

PRINSIP UMUM VERIFIKASI METODE (DETEKSI)

KUALITATIF & METODE KUANTITATIF (4)

Verifikasi item (Pangan) (4.3)

Verifikasi item (Pangan) bertujuan untuk mendemonstrasikan kompetensi dari lab pengguna
untuk melakukan validasi metode dengan item (pangan) yang diuji di lab pengguna.
Laboratorium pengguna harus:
Memilih satu item (pangan) yang menantang dari setiap kategori (pangan) yang ada dalam
lingkup validasi (lihat 4.4) yang juga kategori (pangan) diuji dalam lingkup penerapan
laboratorium lab pengguna
Menggunakan item (pangan) ini dan ukuran sampel (atau ukuran sampel lebih kecil dari yang
rutin digunakan oleh lab pengguna) digunakan dalam studi validasi untuk melakukan verifikasi
item (pangan).
.

24 *

12
 PERSYARATAN UNTUK VERIFIKASI IMPLEMENTASI
DAN VERIFIKASI ITEM (PANGAN) (4.4)

Gambar 4, 5 dan 6 menunjukkan jumlah item (pangan) yang diperlukan

untuk verifikasi implementasi dan verifikasi item (pangan) di bawah kondisi
yang berbeda. Gambar 4 dan 5 hanya mengacu terhadap kategori pangan.
Gambar 6 termasuk kategori lainnya

25

LINGKUP : BERBAGAI PANGAN LUAS

Gambar 4. Item pangan diperlukan ketika memverifikasi metode dengan lingkup berbagai
pangan luas

Lingkup Validasi Lingkup Penerapan

Metode Acuan divalidasi atau Metode Laboratorium
Kategori Alternatif divalidasi menurut ISO 16140-2 Lingkup berbagai pangan yang luas
Pangan atau 16140-5
Lingkup berbagai pangan yang luas Verifikasi
yang diuji
selama Kategori 1 Tipe Item Implementasi
Kategori 2 Tipe Item
Validasi
Kategori 3 Tipe Item - Metode Kualitatif: Pilih 1 item pangan yang diuji
Kategori 4 Tipe Item selama studi validasi dari Lingkup penerapan Lab
Kategori 5 Tipe Item
- : Pilih berbagai item pangan dari
Lingkup penerapan Lab
Kategori 6 Tipe Item
Kategori ........
Pangan yang ........
tidak diuji Verifikasi Item (Pangan)
........
selama
Validasi, tetapi
termasuk - PILIH minimum 5 item Pangan Menantang
Lingkup masing-masing 1 dari Kategori Pangan berbeda
Validasi yang ada pada Lingkup Penerapan Lab.

26
*

13
 LINGKUP : BERBAGAI PANGAN TERBATAS
Gambar 5. Item pangan diperlukan ketika memverifikasi metode dengan lingkup
berbagai pangan terbatas
Lingkup Validasi Lingkup Penerapan Laboratorium

Metode Acuan divalidasi atau Metode

Alternatif divalidasi menurut ISO
16140-2 atau 16140-5 Verifikasi
Lingkup berbagai pangan terbatas Implementasi
Kategori - Metode Kualitatif: Pilih 1 item pangan yang
Pangan diuji selama studi validasi dari Lingkup penerapan
yang diuji Kategori 1 Tipe Item
Lab
selama - : Pilih berbagai item pangan
Kategori 2 Tipe Item dari Lingkup penerapan Lab
Validasi Kategori 3 Tipe Item

Verifikasi Item
(Pangan)

Bila Lingkup Validasi mencakup < 5 Kategori Pangan, PILIH

minimum 1 item pangan yang menantang dari setiap Kategori
Pangan yang ada pada Lingkup Penerapan Lab.

27 *

GAMBAR 6. ITEM DIPERLUKAN BILA MEMVERIFIKASI METODE DENGAN LINGKUP

RENTANG PANGAN LUAS DAN KATEGORI LAINNYA
Lingkup validasi Lingkup aplikasi laboratorium
Lingkup “Rentang pangan luas dan kategori lainnya”
Metode acuan tervalidasi atau metode
alternatif tervalidasi menurut ISO
16140-2 atau ISO 16140-5.
Lingkup “Rentang pangan luas dan kategori Verifikasi
lainnya”
Kategori implementasi
pangan yang
diuji selama
validasi - Untuk metode kualitatif: pilih 1 item
pangan yang diuji selama studi validasi
Kategori yang masuk dalam lingkup aplikasi lab.
pangan yang - Untuk metode kuantitatif: pilih berbagai
tidak diuji item pangan yang masuk dalam lingkup
selama aplikasi lab.
validasi
tetapi
termasuk
dalam Verifikasi item (pangan)
lingkup
validasi

Kategori - Pilih sedikitnya 5 item pangan yang

lainnya yang menantang, masing-masin 1 dari kategori
diuji selama pangan berbeda masuk dalam lingkup aplikasi
validasi lab
- Termasuk kategori lain, pilih 1 item dari setiap
kategori lainnya yang masuk aplikasi lab.

28 *

14
 TABEL 1. RINGKASAN JUMLAH MINIMUM ITEM (PANGAN) YANG
DIPERLUKAN UNTUK VERIFIKASI
Jumlah Sampel
Lingkup Validasi
Verifikasi Implementasi Verifikasi Item (Pangan) Total
Lingkup “Rentang Pangan Luas” >
5 kategori pangan 1 >5 >6

Lingkup”Rentang Pangan
1 N pangan < 4 (N pangan + 1) < 5
Terbatas” Kategori N pangan
> 5 item pangan
Lingkup “Rentang Pangan Luas” + +
1 > 6 + N lain
kategori lain (Nlain) 1 item dari setiap kategori lain N
lainnya
Lingkup Kategori “Rentang N pangan < 4
Pangan Terbatas” Kategori + (N pangan + N lain + 1) <
1
Npangan + Kategori lain (N 1 item dari setiap kategori lain N 8
lainnya) lainnya
Hanya Lingkup Kategori lain (N
1 N lain < 3 (N lain + 1) < 4
lainnya)
29 *

KARAKTERISTIK KINERJA (4.5)

Tabel 2. Daftar karakteristik kinerja yang diperlukan untuk verifikasi metode.

Tabel 2 - Karakteristik kinerja yang diperlukan untuk penentuan verifikasi

Metode Karakteristik Kinerja Verif Implementasi Verif Item (Pangan)


Kualitatif Estimasi LOD50 (eLOD50) 

SD Reprodusibilitas Intralab 
Tidak aplikabel
(SIR)
Kuantitatif
Estimasi Bias (eBias) Tidak aplikabel 

Catatan 1: ada hub antara SIR dan ISO 19036

Catatan 2: Untuk verifikasi metode kualitatif, ada 3 protocol yang disiapkan untuk lab pengguna. Protokol 3 tidak
memerlukan determinasi eLOD50, tetapi konsentrasi targetnya 3 – 5 cfu/porsi uji.

30
*

15
 rumahmutu.id

5. METODE KUALITATIF
Protokol Teknis Untuk Verifikasi

31

PENENTUAN LOD TERESTIMASI (ELOD)(5.1)

Penentuan eLOD diperlukan untuk verifikasi implementasi dan verifikasi item

(pangan).
Laboratorium pengguna pertama-tama mengikuti satu dari protokol teknis terpilih
yang diuraikan di bawah ini, secara keseluruhan untuk melengkapi verifikasi
implementasi, mendemonstrasikan kemapuannya untuk melakukan metode yang
sudah divalidasi secara benar
Laboratorium pengguna kemudian menerapkan protokol teknis yang sama untuk
verifikasi item (pangan).
Selama verifikasi metode, jalankan protokol lengkap metode seperti telah dijelaskan,
termasuk prosedur konfirmasi (jika ada).
Minimum satu porsi uji individu/tunggal pada setiap tingkat inokulasi memerlukan
uji konfirmasi, dan jumlah koloni yang dikonfirmasi dapat diturunkan sampai satu
koloni

32

16
 APA ITU LOD50 ?

Tingkat Deteksi
LODx
<metode kualitatif> konsentrasi analit terukur, diperoleh dengan prosedur pengukuran tertentu,
di mana probabilitas pendeteksiannya adalah x
CONTOH LOD50 adalah tingkat deteksi dimana 50% pengujian memberikan hasil positif.

33 *

RANCANGAN PERCOBAAN (5.2)

Laboratorium pengguna harus memilih satu dari 3 protokol yang dijerlaskan pada Tabel 3.
Tabel 3. Protokol untuk menentukan eLOD50 dan Jumlah ulangan diperlukan per tingkat inokulum

Tingkat Inokulasi dari Porsi Uji

Tk tinggi Tk tengah Tk rendah 3 cfu-5 Blanko Jumlah Total
Protokol (9xLOD50)/porsi (3xLOD50)/p (91xLOD50)/ cfu/Porsi uji Ulangan
Uji orsi Uji porsi Uji

1 1 4 4 1 10
2 3 5 1 9
3 7 1 8
Catatan: cfu adalah unit pembentuk koloni (koloni)

34

17
 PROTOKOL VERIFIKASI

Ada 3 pilihan PROTOKOL berdasarkan kemampuan Lab memperoleh tingkat kontaminasi dari
porsi uji yang diinginkan:
a. Protokol 1, dapat digunakan bila ada ketidakpastian tingkat kontaminasi dari porsi uji yang
diinginkan. Artinya kita menggunakan biiakan yang tidak diketahui tingkat/konsentrasi
inokulum yang aktual untuk menginokulasi porsi uji (sampel).
b. Protokol 3, dapat digunakan bila tingkat kontaminasi inokulum diketahui, mikroba acuannya
diketahui konsentrasinya.
c. Protokol 2, dapat digunakan bila Protokol 1 tidak dapat dikerjakan sebagai antisipasi, dan
percobaan perlu diulang.
Pengenceran tambahan yang diresepkan untuk salah satu protokol dapat digunakan untuk
meminimalkan kebutuhan pengulangan percobaan ketika tingkat inokulasi tidak memenuhi
persyaratan atau verifikasi hasil uji tidak dapat diinterpretasikan (lihat Tabel 6 dan 8).
Pengenceran tidak wajib dilaksanakan dan keputusan ada di laboratorium yang melakukan
percobaan.

35 *

RANCANGAN PERCOBAAN (5.2)

Protokol harus dilakukan sebagai berikut.-
• Siapkan biakan mikroba target untuk
menginokulasi bahan (pangan).
• Minimal, siapkan jumlah porsi uji dari
item (pangan) yang sama yang
diperlukan untuk protokol yang dipilih
(lihat Tabel 3). Pilih item (pangan) yang
tidak boleh terkontaminasi secara
alami oleh mikroba target
• Inokulasi suspensi awal dari bagian uji
sesuai dengan protokol yang dipilih
pada Tabel 3.
• Tentukan tingkat mikroba target dalam
inokulum, pada saat yang sama dengan
porsi uji yang diinokulasi, dengan plating
dengan media non-selektif (misalnya uji
ALT) atau dengan melakukan uji MPN
(misalnya 3 pengenceran × 3 tabung).
Menghitungnya sesuai dengan ISO 7218.
CATATAN
Jika konsentrasi biakan yang digunakan
untuk inokulasi tidak diketahui, porsi uji
tambahan dapat dilakukan inokulasi
dengan pengenceran ekstra untuk
memastikan bahwa level target
dimasukkan dalam verifikasi.

36

18
 RANCANGAN PERCOBAAN (5.2)
Protokol (lanjutan)
• Menganalisis porsi uji yang diinokulasi menggunakan prosedur
lengkap dari metode yang diverifikasi.
• Untuk protokol 1 dan protokol 2: tentukan eLOD50 menggunakan
hasil positif dan negatif yang diperoleh(lihat 5.5 untuk detailnya).
Untuk protokol 3, tidak ada eLOD50 yang ditentukan. Sebaliknya,
hasilnya dievaluasiberdasarkan jumlah positif yang ditemukan dari
tujuh ulangan yang diuji.

37

5.3 PEMILIHAN ITEM (PANGAN).

• Satu item (pangan) diperlukan untuk verifikasi implemntasi. Setiap item
(makanan) yang termasuk dalam validasi dan dalam lingkup aplikasi
laboratorium dapat dipilih.
• Untuk verifikasi item (pangan), sebaiknya laboratorium pengguna harus
menguji minimal satu item (pangan).yang menantang, dari masing-
masing kategori (pangan) yang dibutuhkan.
• Rincian jumlah kategori (pangan) yang dibutuhkan untuk diuji menurut
ruang lingkup validasi atau ruang lingkup aplikasi laboratorium dijelaskan
dalam klausul 4.4.
• Lampiran B memberikan panduan tentang cara memilih item (makanan)
yang menantang.

38 *

19
 KONTAMINASI BUATAN (5.4)
Pemilihan strain (5.4.1 )
Strain bisa dari: CATATAN :
Lebih disukai, strain yang digunakan
•koleksi biakan;
dalam verifikasi berasal dari sumber
•koleksi laboratorium pengguna; yang relevan dengan item (pangan)
•bahan/mikroba acuan (termasuk bahan yang sedang diverifikasi dan strain
acuan komersial, misalnya strain beku- yang berbeda digunakan untuk setiap
kering dengan konsentrasi yang item (pangan) yang akan diuji.
diketahui).

Saat memilih strain uji, mayoritas harus berasal dari kategori (pangan)
yang dipilih studi verifikasi dan mencakup rentang analit target yang
diakui sehubungan dengan keragaman dalam karakteristik identifikasi
(misalnya biokimia, serotipe, jenis fag), distribusi geografis dan kejadian
(lihat ISO 16140-2:2016, Lampiran E).

39 *

INOKULASI PORSI UJI (5.4.2 )

• Gunakan data LOD50 dari kategori (pangan) terkait dari studi
validasi metode untuk menentukan kisaran kontaminasi
(sebaiknya antara 1 hingga 9 kali LOD50 , lihat Tabel 3) yang
akan digunakan untuk menginokulasi porsi uji.
• Jika LOD50 tidak diketahui (mis. metode referensi tanpa data
validasi yang dipublikasikan), nilainya akan dianggap < Untuk
Protokol 3, gunakan 3 cfu sampai 5 cfu / porsi uji.

• Apabila tidak ada kategori (pangan) terkait yang sesuai

dalam studi validasi (misal, untuk item (pangan) yang
menantang diuji dalam verifikasi item (pangan)). Nilai LOD50
diasumsikan < 1 cfu/porsi uji.

40 *

20
 INOKULASI PORSI UJI (5.4.2)
Panduan berikut diberikan sebagai contoh prosedur yang sesuai untuk memproduksi
inokula.
• Strain yang dipilih harus ditanam dalam media biakan dalam kondisi yang
memungkinkan pertumbuhan optimal strain (misalnya biakan semalam); ikuti
prosedur yang ditentukan dalam ISO 11133: 2014, klausul 5.4 (ctt: biakan semalam
= 16-24 jam inkubasi)

• Hitung biakan pada media non-selektif untuk menentukan konsentrasi strain

(cfu/mL), diasumsikan bahwa tingkat ini akan dicapai secara konsisten ketika
kondisi biakan yang sama digunakan.

• Ulangi pembiakan di bawah kondisi sama dan lakukan penghitungan sebelum

penentuan konsentrasi untuk menyiapkan pengenceran yang mencakup rentang
inokulasi. Langkah ini tidak diperlukan bila stabilitas strain diketahui oleh
laboratorium pengguna (misal viabilitas setelah penyimpanan pada 4ºC selama 16-
24 jam.

41 *

INOKULASI PORSI UJI (5.4.2)

Panduan (lanjutan)

• Apabila lab pengguna bekerja dengan strain target yang siap pakai (ready
to use) yang tingkat konsentrasinya diketahui (misal, bahan acuan
mikroba), Langkah tersebut di atas tidak perlu dilakukan.

• Inokulum yang siap dimasukkan ke dalam suspensi awal dari porsi uji
tunggal. Setelah inokulasi, suspensi dicampur secara langsung.
Penggunaan biakan stressed direkomendasikan tetapi tidak diperlukan
(lihat ISO 16140-2:2016, Lampiran C)

42 *

21
 TABEL 4. TINGKAT INOKULASI UNTUK SETIAP PROTOKOL

Protok Tk tinggi Tk tengah Tk rendah (1xLOD50)/porsi 3 cfu-5 cfu/ porsi uji

ol (9xLOD50)/porsi Uji (3xLOD50)/porsi Uji Uji

1 Ini harus
dimaksimalkan 9 x
Dari inokulasi tinggilevel,
lakukan 1:3 pengenceran
Dari inokulasi tingkat
intermediat/perantara
LOD50 yang untuk mencapai tingkat ,lakukan pengenceran 1:3
diharapkan. menengah. untuk mencapai tingkat
rendah

2 Ini harus maksimal dari

tiga kali diharapkan LOD50.
Dari inokulasi tingkat
perantara/intermediat,
lakukan pengenceran 1:3
untukmencapai tingkat
rendah.

3 Tingkat kontaminasi
dari inokulum
diketahui (misalnya
bahan referensi
dengan konsentrasi
diketahui).
43 *

INOKULASI PORSI UJI (5.4.2)

Penentuan MPN dari inokula dapat dilakukan dengan menggunakan pendekatan MPN 3
pengenceran × 3 tabung; penggunaan media non-selektif untuk pengayaan (misalnya Brain
Heart Infusion Broth atau Tryptone Soy Broth) sesuai (lihat juga Lampiran C untuk informasi
lebih lanjut). Dalam hal ini, hasilnya adalah ditentukan menurut Tabel C.1.
CONTOH
Laboratorium pengguna ingin memverifikasi metode Salmonella
(lihat ISO 6579-1) menggunakan Protokol 1.
Berdasarkan LOD50 (2,5 cfu/porsi uji) yang ditentukan dalam studi validasi, kisaran
kontaminasi untuk(pangan) item A, secara teoritis, akan menjadi 22,5 cfu/porsi uji, 7,5
cfu/porsi uji dan 2,5 cfu/porsi uji
Biakan semalam disiapkan. Berdasarkan penghitungan awal, ini dianggap mengandung 6 ×
108 cfu /ml.

44 *

22
 INOKULASI PORSI UJI (5.4.2)
Karena hitungan sebenarnya dari biakan semalam yang baru tidak diketahui, laboratorium
pengguna dapat menggunakan beberapa pengenceran untuk mencakup tiga level target, dengan
menggunakan setiap pengenceran dan bagian uji yang disyaratkan dalam Tabel 5.
Dalam hal ini:
 Pengenceran A (60 cfu/ml): gunakan 1 ml pengenceran 10−7 Biakan semalaman (umur biakan
antara 16-24 jam);
 Pengenceran B (20 cfu/ml): gunakan 1 ml pengenceran 1:3 A;
 Pengenceran C (6,7 cfu/ml): gunakan 1 ml pengenceran 1:3 B;
 Pengenceran D (2,2 cfu/ml): gunakan 1 ml pengenceran 1:3 C ;
 Pengenceran E (0,7 cfu/ml): gunakan 1 ml pengenceran 1:3 D;
 Pengenceran F (0,2 cfu/ml): gunakan 1 ml pengenceran 1:3 E.

45 *

INOKULASI PORSI UJI (5.4.2)

Dalam contoh khusus ini, enam pengenceran digunakan untuk porsi uji yang diinokulasi akan diperiksa
bersama dengan satu porsi uji kosong. Hanya tiga level yang relevandan level blanko (tidak diinokulasi)
akan dipertahankan untuk penentuan eLOD50.
Tabel 5. Contoh pengenceran dan jumlah ulangan yang sesuai untuk protokol
1, 2, dan 3 menggunakan lebih dari jumlah minimum pengenceran yang
diperlukan.
Protok Pengenceran Pengenceran Pengenceran Pengenceran Pengenceran E Pengenceran
ol A B C D F
(10-7) (1:3 ) A (1:3 ) B (1:3 ) C (1:3 ) D (1:3 ) E
1 1 4 4 4 4 4
2 3 5 5 5 5
3 7 7 7

46

23
 INOKULASI PORSI UJI (5.4.2)

— Dalam contoh ini, penghitungan yang membuat tingkat kontaminasi rata-

rata akhir untuk pengenceran ini adalah 54 cfu/ml.
— Menggunakan pengenceran yang dipilih ini (A) untuk pembuatan
pengenceran menurut Tabel 5 akan menghasilkan pengenceran B
mengandung 18 cfu/ml; pengenceran C (1:3 pengenceran B)
mengandung 6 cfu/ml dan pengenceran D (1:3 pengenceran C)
mengandung 2 cfu/ml. Pengenceran B, C dan D dianggap sebagai tiga
tingkat yang relevan sebagai inokulum 1 ml pengenceran D paling dekat
dengan LOD50 (2,5 cfu/bagian uji) dari metode ini.
Lihat juga Lampiran C (Contoh: Verifikasi Metode Kualitatif) untuk tambahan
panduan dan contoh.

47

EVALUASI HASIL (5.5)

Penentuan eLOD50 menggunakan protokol 1 (5.5.1)
Catat jumlah hasil positif yang diperoleh pada setiap tingkat inokulum dan
gunakan Tabel 6 untuk menentukan eLOD50.
Tingkat kosong tidak akan menghasilkan hasil yang positif. Jika hasil positif
diperoleh untuk tingkat blanko/kosong, percobaan harus diulang untuk semua
tingkat.
Untuk evaluasi hasil menggunakan protokol 1, inokulum tingkat
tinggi (9 × LOD50) hanya akan menghasilkan hasil positif. Jika hasil negatif
diperoleh, percobaan harus diulang untuk semua tingkatan.

48 *

24
 EVALUASI HASIL (5.5)……

Beberapa dari kombinasi MPN yang diindikasikan sebagai;

"hasil MPN yang tidak dapat diandalkan" (lihat Tabel 6 dan 7) sangat
tidak mungkin terjadi dan percobaan karena itu harus diulang. Ketika
lebih banyak pengenceran digunakan, tiga pengenceran, dengan
tingkat inokulasi rendah paling dekat dengan tingkat LOD50, harus
digunakan untuk mengevaluasi data sesuai dengan Tabel 6.

49

TABEL 6 — PENENTUAN ELOD50 BERDASARKAN JUMLAH HASIL POSITIF PER

TINGKAT KONTAMINASI MENGGUNAKAN PROTOKOL 1

50 *

25
 TABEL 7 — CONTOH PENENTUAN ELOD50 BERDASARKAN JUMLAH
HASIL POSITIF PER TINGKAT KONTAMINASI MENGGUNAKAN
PROTOKOL 1

a. Hasil MPN yang tidak dapat diandalkan: Gabungan

MPN sangat tidak mungkin terjadi dan percobaan
karena itu harus diulang

51

PENENTUAN ELOD50 MENGGUNAKAN PROTOKOL 2 (5.5.2 )

Jika protokol 2 digunakan dalam verifikasi untuk contoh di 5.4.2, maka 23 porsi uji akan diuji
(lihat Tabel 5) bersama dengan satu porsi uji kosong/blanko.
Catat jumlah hasil positif yang diperoleh pada setiap tingkat inokulum dan gunakan Tabel 8
untuk menentukan eLOD50.
Tingkat kosong/blanko tidak akan menghasilkan hasil yang positif. Jika hasil positif diperoleh
untuk tingkat blanko, makapercobaan harus diulang untuk semua tingkat.
Untuk evaluasi hasil menggunakan protokol 2, tingkat inokulasi menengah dan rendah bisa
memiliki hasil positif dan negatif. Ketika hanya hasil negatif yang diperoleh, percobaan
harus diulang.
Beberapa kombinasi MPN yang diindikasikan sebagai “hasil MPN yang tidak dapat
diandalkan” (lihat Tabel 8 dan 9) adalah sangat tidak mungkin terjadi dan percobaan harus
diulang.
Ketika lebih banyak pengenceran digunakan, dua pengenceran, dengan tingkat inokulasi
rendah yang paling dekat dengan LOD50,harus digunakan untuk mengevaluasi data sesuai
dengan Tabel 8.

52

26
 PENENTUAN ELOD50 MENGGUNAKAN PROTOKOL 2 (5.5.2 )

Tabel 8 — Penentuan eLOD50 berdasarkan Tabel 9 — Contoh penentuan eLOD50

jumlah hasil positif per tingkatkontaminasi berdasarkan jumlah hasil positifper tingkat
menggunakan protokol 2 kontaminasi menggunakan protokol 2

53 *

PENGGUNAAN PROTOKOL 3 (5.5.3 )

• Tingkat kosong/blanko tidak akan menghasilkan hasil yang positif. Jika hasil positif
diperoleh untuk tingkat blanko, percobaan harus diulang untuk semua tingkatan.
• Hasil dari protokol 3 hanya boleh digunakan untuk evaluasi ketika tingkat
kontaminasi porsi uji berada dalam batas yang dinyatakan antara 3 cfu dan 5
cfu/porsi uji.
• Tingkat kontaminasi ini ditentukan dengan enumerasi atau MPN sebagaimana
dimaksud dalam 5.4.2. Jika tingkat kontaminasiadalah > 5 cfu/porsi uji, hasilnya
tidak dapat digunakan, dan percobaan harus diulang. Jika tingkat kontaminasi < 3
cfu/porsi uji dan batas akseptabilitas terpenuhi, hasilnya dapat digunakan.
• Jika tidak, percobaan harus diulang.
• Tidak ada eLOD yang ditentukan menggunakan protokol 3. Hasilnya harus
dievaluasi berdasarkan jumlah positif yang ditemukan dari tujuh ulangan yang diuji.
• Batas akseptabilitas/penerimaan untuk ini disajikan dalam 5.6.

54

27
 BATAS PENERIMAAN (5.6 )
• eLOD50, ditentukan menurut protokol 1 (lihat 5.5.1) atau protokol 2 (lihat 5.5.2)
harus dibandingkan ke LOD50 dari studi validasi.
• Untuk verifikasi implementasi, gunakan nilai LOD50 sesuai dengan item (pangan)
yang diuji.
• Untuk verifikasi item (pangan), eLOD50 tidak boleh > 4 × LOD50 yang diamati dalam
studi validasi. Jika tidakNilai LOD50 sesuai dengan item (pangan) yang diuji, eLOD50
tidak boleh > 4 cfu/porsi uji. Ini batas penerimaan didasarkan pada nilai teoretis
LOD50 sebesar 1 cfu/ porsi uji.
• Untuk protokol 3, harus ada minimal enam hasil positif dari tujuh ulangan yang
diuji.
• Klausul 8 memberikan ringkasan batas penerimaan.

55 *

BATAS PENERIMAAN (5.6 )

CATATAN
— eLOD50 dari studi verifikasi valid dan dapat diterima hanya jika diperoleh dari porsi
uji yang sama atau lebih kecil (misalnya 25 g, 100 ml, 375 g) yang digunakan dalam
studi validasi.
— LOD50 yang diamati dalam studi validasi dapat dinyatakan sebagai cfu/g, cfu/ml atau
cfu/porsi uji.
Itu validasi LOD50 perlu diekspresikan dalam cfu/porsi uji untuk dapat
membandingkan hasil dengan hasilnya dari studi verifikasi.
— Dalam kasus di mana LOD50 yang diamati dalam studi validasi diberikan sebagai
cfu/g atau cfu/ml, maka LOD50 perludikalikan dengan ukuran bagian uji yang
digunakan. Oleh karena itu, LOD50 0,1 cfu/g atau cfu/ml akan memberikan LOD50
dari 2,5 ketika bagian uji 25 g atau 25 ml digunakan.
— Jika, misalnya, LOD50 dari studi validasi adalah 2,5 cfu/porsi uji, nilai maksimum
yang dapat diterima untukeLOD50 akan menjadi 10 cfu/porsi uji (maksimum 4 ×
LOD50 ).
56

28
 rumahmutu.id

6. METODE KUANTITATIF
Protokol Teknis Untuk Verifikasi

57

PENENTUAN STANDAR DEVIASI/SIMPANGAN BAKU

REPRODUSIBILITAS INTRALABORATORIUM (6.1)
Umum (6.1.1 )
Penentuan simpangan baku reprodusibilitas intralaboratorium hanya berlaku untuk
verifikasi implementasi .
Verifikasi implementasi yang dilakukan dalam laboratorium tunggal, dan
reprodusibilitas dinyatakan sebagai Simpangan Baku Reprodusibilitas Intralaboratorium
(SIR)
Penentuan Simpangan Baku Reprodusibilitas Intralab (SIR) dalam verifikasi
implementasi sesuai dengan penentuan ketidakpastian teknis, yang merupakan salah
satu dari ketiganyakomponen ketidakpastian utama (teknis, matriks dan distribusi) yang
dijelaskan dalam ISO 19036 (ISO 190136:2019)
Penentuan Simpangan Baku Reprodusibilitas Intralab (SIR) didasarkan pada ISO
19036:2019, 5.2.2.
Selama verifikasi implementasi, jalankan prosedur lengkap dari metode seperti yang
dijelaskan, termasukprosedur konfirmasi untuk setiap bagian uji individu

58 *

29
 RANCANGAN PERCOBAAN (6.1.2)
Protokol harus dilakukan sebagai berikut.
— Diperlukan minimal 10 sampel laboratorium, termasuk item (makanan) yang sama. Ini mungkin berasal dari
jumlah maksimum batch yang berbeda dalam kasus di mana laboratorium pengguna terhubungn fasilitas
produksi atau dari produsen yang berbeda untuk laboratorium swasta yang melayani produsen berbeda.
Lebih banyak sampel dapat diuji untuk menutupi kemungkinan hilangnya data dari beberapa sampel
karena kesalahan praktis / kecelakaan selama pengujian.— Tingkat kontaminasi yang digunakan harus
mewakili kisaran kontaminasi alamiditemukan dalam sampel yang diuji di laboratorium pengguna.
— Setiap sampel laboratorium (atau uji) harus dicampur atau dihomogenkan sebelum dua porsi uji diambil
(lihat Gambar 7). Ini penting untuk distribusi mikroba yang seragam.
 Untuk produk cairan, pencampuran harus dilakukan dengan mengocok sampel laboratorium (atau
sampel uji) dengan tangan (misalnya 25 kali melalui busur 25 cm).
 Untuk produk padat, homogenisasi dapat dilakukan dengan cara mekanis, yaitu dengan stomacher
atau blender. Untuk detailnya, ikuti prosedurnyadalam seri ISO 6887.— Jika kontaminasi buatan
digunakan, inokulasi suspensi awal setiap bagian uji dengan yang diketahuitingkat regangan.
— Porsi uji yang terkontaminasi secara alami dapat dianalisis secara langsung setelah homogenisasi sampel
laboratorium (atau sampel uji).
Lihat juga D.1 untuk panduan dan contoh tambahan.

59 *

PEMILIHAN ITEM (PANGAN) (6.1.3 ).
Gambar 7 — Protokol eksperimental untuk memperkirakan
standar deviasi reprodusibilitas intralaboratorium (SIR)
Tahapan Sampel uji,, jarang digunakan dalam pemeriksaan mikrobiologi.
Biasanya, Sampel laboratorium langsung digunakan (tidak melalui tahapan
sampel uji) untuk dihomogenisasi.
Kondisi pengujian yang digunakan dalam Analisis Porsi uji A dan Porsi uji B harus
divariasikan dalam berbagai cara yang memungkinkan dalam ruang lingkup
validasi.
Ini harus mencakup, kecuali laboratorium pengguna dapat melakukan cara lain,
tetapi tidak terbatas pada:
a) teknisi;
b) bets media biakan dan reagen (opsional: bila relevan, strain yang berbeda
juga dapat digunakan untuk menginokulasi sampel laboratorium yang
berbeda);
c) peralatan (misalnya inkubator, vortex mixer, pipet).
Pada kondisi uji a) dan b) dianggap paling menyebabkan variabilitas hasil
metode dan harus bervariasi kecuali laboratorium pengguna dapat
membenarkan sebaliknya.
Kondisi pengujian c) harus bervariasi berdasarkan ketersediaan alat di
laboratorium pengguna.
Jika item (pangan) yang diinokulasi dapat menunjukkan hasil hasil cukup stabil,
analisis dapat dilakukan pada hari yang berbeda.
Hasil akan dinilai menurut 6.1.6.
CATATAN
Bets media biakan dapat disiapkan atau dibuat berbeda, tetapi menggunakan
bets media dehydrated yang sama

60 *

30
 PEMILIHAN ITEM (PANGAN) (6.1.3 ).
Tahapan Sampel uji, jarang digunakan dalam pemeriksaan mikrobiologi.
Biasanya, Sampel laboratorium langsung digunakan (tidak melalui tahapan sampel
uji) untuk dihomogenisasi.
Kondisi pengujian yang digunakan dalam Analisis Porsi uji A dan Porsi uji B harus
divariasikan dalam berbagai cara yang memungkinkan dalam ruang lingkup validasi.
Ini harus mencakup, kecuali laboratorium pengguna dapat melakukan cara lain,
tetapi tidak terbatas pada:
a) teknisi;
b) bets media biakan dan reagen (opsional: bila relevan, strain yang berbeda juga
dapat digunakan untuk menginokulasi sampel laboratorium yang berbeda);
c) peralatan (misalnya inkubator, vortex mixer, pipet).
Pada kondisi uji a) dan b) dianggap paling menyebabkan variabilitas hasil metode
dan harus bervariasi kecuali laboratorium pengguna dapat membenarkan
sebaliknya.
Kondisi pengujian c) harus bervariasi berdasarkan ketersediaan alat di laboratorium
pengguna.
Jika item (pangan) yang diinokulasi dapat menunjukkan hasil hasil cukup stabil,
analisis dapat dilakukan pada hari yang berbeda.
Hasil akan dinilai menurut 6.1.6.
CATATAN
Bets media biakan dapat disiapkan atau dibuat berbeda, tetapi menggunakan bets
media dehydrated yang sama

61

PEMILIHAN ITEM (PANGAN) (6.1.3 )

Satu item (pangan) diperlukan untuk verifikasi implementasi Simpangan

Baku Reprodusibilitas Intralab (SIR), sebagaimana ditentukan menurut
Gambar 7, tidak tergantung pada matriks karena eksperimen dirancang
untuk mengecualikan kontribusi dari heterogenitas matriks, jadi apa pun
item (pangan) dalam lingkup validasi dapat dipilih. Disarankan untuk
memilih item (pangan) yang dapat dihomogenkan secara efektif untuk
meminimalkan ketidakpastian matriks.

62 *

31
 KONTAMINASI ALAMI (6.1.4)

Jika memungkinkan, gunakan item yang terkontaminasi secara alami. Untuk

item (pangan) yang dipilih, porsi uji individu yang dievaluasi harus memiliki
tingkat kontaminasi yang mewakili kisaran kontaminasi alami yang
ditemukan dalam sampel yang dianalisis di laboratorium pengguna.
Jika tingkat kontaminasi alami yang diharapkan kurang dari 10 cfu/g dalam
porsi uji, kontaminasi buatan digunakan (lihat 6.1.5 untuk rinciannya) untuk
mencakup rentang penggunaan dari metode ini.

63 *

KONTAMINASI BUATAN (6.1.5)

Pemilihan strain (6.1.5.1)

Strain/galur mikroba bisa dari
:— koleksi biakan;
— koleksi laboratorium pengguna;
— suatu bahan acuan (termasuk bahan acuan
komersial, misalnya galur beku-kering yang
diketahui konsentrasinya).
CATATAN :
Lebih disukai, galur yang
digunakan dalam verifikasi
berasal dari sumber yang relevan
dengan item (pangan) yang
diverifikasi

64 *

32
 KONTAMINASI BUATAN (6.1.5)

Inokulasi Porsi Uji (6.1.5.2)

Saat menginokulasi porsi uji, tingkat kontaminasi yang digunakan harus
mewakili kisaran kontaminasi alami yang ditemukan dalam sampel
laboratorium yang dianalisis di laboratorium pengguna.
Panduan berikut diberikan sebagai contoh prosedur yang sesuai untuk
memproduksi inokula.
(Lihat klausul 5.4.2)

65

INOKULASI PORSI UJI (6.1.5.2)

Inokulum yang disiapkan dimasukkan langsung ke dalam suspensi awal dari

bagian uji individu.
Setelah inokulasi, suspensi dicampur secara menyeluruh. Penggunaan biakan
stres dianjurkan tetapi tidak diperlukan (lihat ISO 16140-2:2016, Lampiran C).
CONTOH
Suatu laboratorium pengguna ingin memverifikasi metode enumerasi
Enterobacteriaceae (lihat ISO 21528-2).Validasi metode ini dilakukan dengan
menggunakan satu item (pangan) dalam masing-masing dari empat Kategori
Pangan dan satu Kategori Lainnya:

66 *

33
 INOKULASI PORSI UJI (6.1.5.2)
a) kategori pangan: susu dan produk susu yang diproses dengan panas; jenis
makanan: produk berbasis susu pasteurisasi; makanan: susu pasteurisasi;
b) kategori pangan: daging mentah dan produk daging siap masak (kecuali
unggas); jenis makanan: daging segar(belum diproses); makanan: daging
mentah (babi cincang);
c) kategori pangan: telur dan produk telur (turunan); jenis makanan: produk telur
(diproses panas) tanpa aditif; makanan: produk telur (telur cair utuh);
d) kategori pangan: cokelat, produk roti dan penganan; jenis makanan: kue kering;
makanan: tiramisu;
e) kategori lainnya: makanan hewan dan pakan ternak; (makanan) jenis: bahan
asal hewan; (makanan) item: pakan ternak (tepung daging dan tulang).

67

INOKULASI PORSI UJI (6.1.5.2)

Untuk verifikasi implementasi, dipilih item pangan “TIRAMISU” dan E. coli
dipilih sebagai strain untuk inokulasi buatan.
Sebagai catatan, bahwa tiramisu diberikan sebagai contoh karena item
(pangan) apa pun dapat dipilih untuk verifikasi implementasi.
— Berdasarkan kisaran tingkat kontaminasi yang mewakili kontaminasi
alami yang ditemukan dalam sampel dianalisis di laboratorium
pengguna, tiramisu akan diinokulasi antara 30 (1,5 log10) cfu/g hingga
30.000 (4,5log10) cfu/g.
— Minimal 10 sampel laboratorium tiramisu yang berbeda (merek, lot)
akan disiapkan dan masing-masing dibagi menjadi dua porsi uji: A dan
B (lihat Gambar 7).
— Kedua porsi uji, A dan B, yang berasal dari sampel laboratorium yang
sama (lihat Gambar 7) akan diinokulasi dengan inokulum yang sama.

68

34
 INOKULASI PORSI UJI (6.1.5.2) (LANJUTAN)
Setiap set dari 10 atau lebih sampel laboratorium akan diinokulasi pada
tingkat yang berbeda (dan mungkin dengan galur yang berbeda) antara
30 cfu/g dan 30.000 cfu/g.
Biakan akan diinokulasi ke suspensi awal, yang telah dibuat
menggunakan 10 g porsi uji
— Untuk melakukan ini, biakan semalam disiapkan dan diasumsikan
mengandung 109 cfu/ml (berdasarkan hasil penghitungan sebelumnya).
— Untuk mengkontaminasi pada tingkat 30 cfu/g, enam serial
pengenceran desimal dari biakan semalam disiapkan, untuk
mengurangi tingkat awal dari 109 cfu/ml menjadi 103 cfu/ml.
Tingkat kontaminasi yang berbeda yang mencakup kisaran 30 cfu/g dan
30.000 cfu/g dapat diperoleh dengan cara yang berbeda pengenceran
dan/atau volume inokulasi. Laboratorium pengguna harus memastikan
bahwa inokulum tidak mempengaruhi integritas matriks.
Hasil dari contoh ini diringkas dalam Tabel 10. D.1 memberikan rincian
dari:proses eksperimental untuk contoh ini.

69

EVALUASI HASIL (6.1.6)

Simpangan Baku Reprodusibilitas Intralaboratorium (SIR) dihitung,
berdasarkan minimal 10 sampel laboratorium, menurut Rumus (1):

Dimana
SIR adalah Simpangan Baku Reprodusibilitas Intralaboratorium ;
i adalah indeks sampel laboratorium, i = 1 to n (n ≥ 10);
n adalah jumlah sampel;
yiA , yiB adalah data transformasi log, dalam log10 (cfu/g) atau log10 (cfu/ml),
dari kondisi a, b dan c, berurutan.
Contoh perhitungan manual diberikan pada Tabel 11.

70 *

35
 BATAS PENERIMAAN (6.1.7)
Simpangan Baku Reprodusibilitas Intralaboratorium (SIR) dari metode yang diverifikasi
harus 2 × nilai rata-rata terendah dari Simpangan Baku Reprodusibilitas
Interlaboratorium (SR) antar laboratorium dari item (pangan) yang digunakan dalam
studi validasi.
Ketika hanya satu nilai (SR) yang ditentukan dalam studi validasi, nilai (SIR) dari metode
yang diverifikasi harus 2 × standar deviasi reproduksibilitas antar laboratorium (SR).
Klausul 8 memberikan ringkasan batas penerimaan.
CONTOH
Laboratorium pengguna telah memeriksa 12 sampel laboratorium tiramisu untuk
tingkat Enterobacteriaceae(menggunakan ISO 21528-2) mengikuti Rancangan
percobaan yang diberikan pada Gambar 7.
Hasil (dihitung sebagai cfu/g dalam porsi uji A dan B dari sampel laboratorium) yang
diperoleh, disajikan pada Tabel 10.

71

Batas penerimaan (6.1.7)

Tabel 10. Hasil Uji

Hasil sampel laboratorium 1 dan 11 tidak dapat digunakan karena salah satu hitungannya terlalu tinggi(“>” hasil) atau
terlalu rendah (di bawah rentang penghitungan yang diizinkan sesuai dengan ISO 7218). Hasil dari 10sampel lab tetap
untuk perhitungan.
Berdasarkan 10 sampel laboratorium yang tersisa, SIR dapat dihitung seperti yang ditunjukkan pada Tabel 11.

72

36
 Batas penerimaan (6.1.7)
Tabel 11. Perhitungan SIR

Nilai hitung SIR 0,18 dibandingkan dengan hasil studi validasi (data diambil alih dari
ISO 21528-2). Tabel 12 mencantumkan nilai SR yang diperoleh dari studi validasi
tersebut.

73

Batas penerimaan (6.1.7)

Tabel 12 — Ringkasan nilai SR dari studi validasi untuk ISO 21528-2

— Eksperimen ini dirancang untuk tidak mempertimbangkan efek dari item (pangan). SIR yang
diperoleh dibandingkan dengan nilai rata-rata terendah dari SR untuk salah satu item yang diuji
dalam studi validasi. Dalam contoh ini, mean terendahnilai SR sebesar 0,18 (untuk pakan ternak).
— SIR ditemukan dari studi evaluasi adalah (0,18), jadi dinilai dari 2 x SR ( 2 × 0,18) dari studi avlidasi.
— Karena SIR studi verifikasi (0,18) adalah < 0,36 (2 × 0,18), kesimpulannya adalah batas penerimaan
untuk verifikasi implementasi terpenuhi.
CATATAN Bila hanya satu nilai SR yang ditentukan dalam studi validasi, nilai SIR dibandingkan
dengan nilai SR tersebut.

74

37
 ANALISIS AKAR PENYEBAB (6.1.8 )
Ketika hasil verifikasi tidak memenuhi batas akseptabilitas/penerimaan, lakukan analisis akar masalah
untuk memberikan penjelasan tentang hasil yang diamati.
Hal ini akan berguna untuk melakukan kembali verifikasi metode alternatif yang tervalidasi secara
paralel dengan metode acuan tervalidasi padaitem (pangan) ini. Ini untuk menyelidiki apakah item
(pangan) ini memiliki kinerja yang sama terhadap kedua metode di tangan laboratorium pengguna.
Analisis akar penyebab harus dilakukan untuk menentukan masalah seperti (namun tidak terbatas
pada):
— kesalahan analitik karena praktik laboratorium yang buruk;
— kesalahan analitik dalam aplikasi protokol (misalnya tingkat inokulasi yang salah).
Ketika masalah telah diidentifikasi, terapkan tindakan korektif dan ulangi percobaan. Informasi
(berdasarkan investigasi, misalnya analisis akar masalah) dapat diberikan dalam laporan studi verifikasi
untuk memberikan penjelasan tentang temuan.
Ketika verifikasi item (pangan) tertentu tidak memenuhi batas penerimaan, itu merekomendasikan agar
laboratorium pengguna menginformasikan organisasi yang relevan (misalnya badan
standardisasi,pemasok, lembaga sertifikasi) tergantung pada metodenya.

75 *

rumahmutu.id

PENENTUAN ESTIMASI
BIAS (EBIAS)(6.2)

76

38
 PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)
Umum (6.2.1 )
Penentuan eBias hanya diperlukan untuk verifikasi item (pangan)(lihat Tabel 2).
Selama verifikasi item (pangan), jalankan prosedur lengkap dari metode seperti dijelaskan,
termasuk:prosedur konfirmasi (jika ada) untuk setiap porsi uji individu.

Rancangan Percobaan (6.2.2)

Protokol harus dilakukan sebagai berikut.
— Pilih item (pangan) untuk pengujian (lihat 6.2.3).
— cemari secara artifisial item (pangan) pada tiga tingkat inokulasi yang mencakup kisaran
penggunaan metode oleh laboratorium pengguna. Kontaminasi buatan dilakukan pada
suspensi awal.
Setiap tingkat dilakukan duplo. Sebaiknya, gunakan sampel laboratorium yang berbeda atau
batch/bets berbeda yang diproduksi dari item (pangan) yang sama untuk masing-masing dari
tiga tingkat inokulasi.

77 *

PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)

— Hitung, dengan menggunakan metode yang akan diverifikasi,

item (pangan) yang terkontaminasi artifisial dan suspense
(biakan murni) yang digunakan untuk menginokulasi item
(pangan).
— Uji porsi uji yang tidak diinokulasi untuk setiap sampel
laboratorium atau batch laboratorium untuk menentukan latar
belakangnya tingkat kontaminasi. Hasil dari kontrol negatif ini
dicatat dan dapat memberikan informasi bermanfaat ketika
analisis akar penyebab diperlukan (lihat 6.2.7).
Lihat juga D.2 untuk panduan dan contoh tambahan.

78 *

39
 PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)

Pemilihan item (pangan)(6.2.3 )

Untuk verifikasi item (pangan), laboratorium pengguna harus menguji
minimal satu item (pangan), lebih disukai yang menantang, dari
masing-masing kategori (makanan) yang dibutuhkan.
Rincian jumlah kategori (pangan) yang dibutuhkan untuk diuji menurut
ruang lingkup validasi atau ruang lingkup aplikasi laboratorium
adalah:dijelaskan dalam 4.4.
Lampiran B memberikan panduan tentang cara memilih item (pangan)
yang menantang.

79 *

PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)

Kontaminasi buatan (6.2.4 )
Pemilihan strain (6.2.4.1)
CATATAN Lebih disukai,
Strain bisa dari: strain yang digunakan dalam
verifikasi berasal dari
— koleksi biakan;
sumber yang relevan dengan
— koleksi laboratorium pengguna; item (makanan) yang sedang
diverifikasi dan strain yang
— bahan referensi (termasuk bahan referensi komersial, berbeda digunakan untuk
misalnya strain beku-kering dengan konsentrasi yang setiap item (makanan) yang
diketahui). akan diuji.
Saat memilih strain uji, mayoritas harus berasal dari kategori
(pangan) yang dipilih untuk studi verifikasi dan mencakup
kisaran analit target yang diakui sehubungan dengan
keragaman dalam karakteristik identifikasi (misalnya biokimia,
serotipe, jenis fag), distribusi geografis dan insiden (lihat ISO
16140-2:2016, Lampiran E).

80 *

40
 PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)
Inokulasi Porsi Uji (6.2.4.2)
(lihat 5.4.2)
CONTOH
• Laboratorium pengguna biasanya berharap menemukan
antara 102 cfu/g dan 106 cfu/g dalam sampel yang diserahkan.
• Studi verifikasi membutuhkan inokulasi suspensi awal hingga
kadar 101 cfu/ml, 103 cfu/ml dan 105 cfu/ml (karena suspensi
awal adalah pengenceran 10 kali lipat dari porsi uji, ini setara
dengan 102 cfu/g,104 cfu/g dan 106 cfu/g porsi uji).
• Diasumsikan bahwa porsi uji adalah 10 g dan volume akhir
dari suspensi awal adalah 100 ml.

81

PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)

Kultur/biakan segar dari mikroba yang diperlukan
— —Porsi uji yang tidak diinokulasi dan masing-
(lihat 6.2.4.1) disiapkan dan diasumsikan
melalui pengukuran/ pengalaman sebelumnya
memiliki 107 cfu/ml. Pengenceran 10 kali lipat
yang sesuai dibuat untuk mencakup kisaran
target dari 103 cfu/ml hingga 107 cfu/ml (=
biakan 16-24 jam yang tidak diencerkan) untuk
inokulasi.
— Satu ml inokulum dipindahkan ke dalam
suspensi awal, duplo, memberikan konsentrasi
asumsi dalam 5suspensi awal: 101 cfu/ml, 2103
cfu/ml dan 10 cfu/ml (setara dengan 10 cfu/g,
104 cfu/g dan106 cfu/g dalam porsi uji). Porsi uji
yang tidak diinokulasi dimasukkan.
Pengenceran tambahan0(untuk menutupi kisaran
yang lebih luas dari 10 cfu/ml sampai 106
cfu/ml dari suspensi awal) digunakan sebagai
konsentrasi sebenarnya dari inokulum mikroba
yangtidak diketahui pada tahap ini
(sebelumnya)
masing suspensi awal yang diinokulasi
kemudian dihitung menggunakan metode
yang akan diverifikasi.
— Biakan segar (16-24 jam)dan
pengencerannya yang digunakan untuk
menginokulasi suspensi awal juga dihitung,
menggunakan metode yang akan diverifikasi,
untuk menentukan konsentrasi mikroba yang
sebenarnya.
— Namun, setelah inkubasi dan penghitungan
inokulum, ditentukan bahwa Biakan segar
sebenarnya berisi 5 × 108 cfu/ml (yaitu 1
log10 > tingkat yang diasumsikan).
Oleh karena itu,2 level sebenarnya6dari suspensi
awal adalah 10 cfu/ml hingga 10 cfu/ml, dan
konsentrasi yang dihitung dalam porsi uji
adalah 103 cfu/g hingga107 cfu/g.

82

41
 PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)

Evaluasi hasil (6.2.5)

Bandingkan hasil item (pangan) yang terkontaminasi artifisial dengan hasil suspensi inokulum
[menjadi suspensi spesifik (diencerkan) yang digunakan untuk mencemari suspensi awal dari(jenis
pangan].
Baik item (pangan) dan suspensi inokulum spesifik (diencerkan) diuji menggunakan metode yang
akan diverifikasi.
Sebagai perbandingan, hasil untuk item (pangan) harus dinyatakan dalam log 10 cfu/per porsi uji
dan hasil suspensi inokulum harus dinyatakan dalam log 10 cfu/ml.
Hasil dari bagian uji yang tidak diinokulasi (kontrol negatif) memberikan informasi tentang tingkat
kontaminasi alami, jika ada, dari item (pangan) dengan mikroba target.

83 *

PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)

Batas penerimaan (6.2.6)
Diharapkan bahwa, pada setiap tingkat, perbedaan mutlak antara hasil item (pangan) yang
terkontaminasi buatan dalam log10 cfu/porsi uji dan suspensi inokulum sama dengan atau kurang dari
0,5 log10. Namun, ini mungkin tidak terjadi jika item (makanan) yang digunakan terkontaminasi secara
alamisebelum inokulasi.
Hasil dari bagian uji yang tidak diinokulasi (kontrol negatif) dapat membantu ketika aanalisis akar
penyebab diperlukan (lihat 6.2.7).
Klausul 8 memberikan ringkasan batas penerimaan.

CONTOH
Suatu laboratorium pengguna ingin memverifikasi eBias dari metode enumerasi alternatif tervalidasi
untuk Enterobacteriaceae, menggunakan makanan "pasta rebus".
Kisaran kontaminasi yang diharapkan adalah antara 102 cfu/gdan 104 cfu/g. Hasil pengujian diberikan
pada Tabel 13.

84 *

42
 PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)
Tabel 13 — Hasil pengujian yang diperoleh dengan menggunakan metode
yang akan diverifikasi

Hasil menunjukkan bahwa pada setiap tingkat kontaminasi perbedaan mutlak antara kedua hasil tersebut lebih sedikitdari
0,5 log10, sehingga metode yang akan diverifikasi bekerja dengan benar di laboratorium pengguna

85

PENENTUAN ESTIMASI BIAS (EBIAS)(6.2)

6.2.7 Analisis akar penyebab
Ketika hasil verifikasi tidak memenuhi batas keberterimaan, lakukan analisis akar masalah untuk memberikan
penjelasan atas hasil yang diamati.
Hal ini akan berguna untuk melakukan kembali verifikasi metode alternatif yang divalidasi secara paralel dengan
metode acuan tervalidasi pada (item) makanan ini. Ini untuk menyelidiki apakah item (pangan) ini memiliki
kinerja yang sama untuk kedua metode di tangan laboratorium pengguna.
Analisis akar penyebab harus dilakukan untuk menentukan masalah seperti (namun tidak terbatas pada):
— kesalahan analitik karena praktik laboratorium yang buruk;
— kesalahan analitik dalam aplikasi protokol (misalnya tingkat inokulasi yang salah).Ketika masalah telah
diidentifikasi, terapkan tindakan korektif dan ulangi percobaan.Informasi (berdasarkan investigasi, misalnya
analisis akar masalah) dapat diberikan dalam laporan studi verifikasi untuk memberikan penjelasan atas temuan
bila eBias > 0,5 log10 cfu/g.
Ketika verifikasi item (pangan) tertentu tidak memenuhi batas penerimaan, direkomendasikan agar
laboratorium pengguna menginformasikan ke organisasi yang relevan (misalnya badan standardisasi,pemasok,
lembaga sertifikasi), tergantung pada metodenya.

86

43
 rumahmutu.id

7. METODE TYPING DAN KONFIRMASI ALTERNATIF YANG

DIVALIDASI
Protokol Teknis Untuk Verifikasi

87

METODE TYPING DAN KONFIRMASI ALTERNATIF

YANG DIVALIDASI (7)

Umum (7.1 )
Verifikasi konfirmasi alternatif tervalidasi dan metode typing hanya membutuhkan verifikasi
implementasi. Sampelnya adalah koloni terisolasi yang ditumbuhkan pada cawan selektif agar atau
non-selektif agar.

Verifikasi Implementasi (7.2)

Verifikasi implementasi bertujuan untuk menunjukkan kompetensi laboratorium pengguna untuk
melakukan metode konfirmasi alternatif tervalidasi atau metode typing. Hal ini dicapai dengan
kemampuannya untuk mendapatkan hasil yang diharapkan pada koloni terisolasi dari media agar
selekti atau non-selektif tertentu.

88 *

44
 METODE TYPING DAN KONFIRMASI ALTERNATIF
YANG DIVALIDASI (7)
Lab pengguna harus:
— mengkaji data validasi untuk metode (data validasi dapat diperoleh dari
laporan validasi metode alternatif);
— pilih satu cawan agar selektif yang diuji selama studi validasi yang, jika
mungkin, termasuk dalam lingkup laboratorium;
— gunakan cawan agar selektif ini untuk melakukan verifikasi implementasi.
Jika tidak ada cawan agar selektif yang diuji, pilih dan gunakan satu cawan
agar non-selektif yang diuji selama studi validasi untuk melakukan
penerapan/implementasi.
CATATAN
Contoh rinci tentang verifikasi metode konfirmasi alternatif dan verifikasi
suatu metode typing alternatif diberikan dalam Lampiran E.
89 *

METODE TYPING DAN KONFIRMASI ALTERNATIF

YANG DIVALIDASI (7)
Rancangan percobaan (7.3)
Umum (7.3.1)
Untuk verifikasi implementasinya, jumlah strain yang diuji disajikan pada Tabel 14.

Tabel 14 — Jumlah strain untuk verifikasi implementasi konfirmasi

alternatif atau metode typing yang divalidasi

90

45
 METODE TYPING DAN KONFIRMASI ALTERNATIF
YANG DIVALIDASI (7)
Pemilihan Strain (7.3.2)
Strain bisa dari:
— koleksi biakan;
— koleksi laboratorium pengguna;
— bahan acuan (termasuk bahan acuan komersial, misalnya galur beku-kering).Saat memilih galur uji,
mayoritas harus berasal dari kategori (pangan) dalam lingkup aplikasi laboratorium dan mencakup
kisaran analit target yang diakui sehubungan dengan keragaman dalam karakteristik identifikasi, mis.
biokimia, serotipe, jenis fag, distribusi geografis daninsiden (lihat ISO 16140-2:2016, Lampiran E).
Untuk verifikasi implementasi, pilih lima strain target dan lima strain non-target untuk studi inklusivitas
dan eksklusivitas, masing-masing.
Pemilihan strain dapat didasarkan pada strain diuji dalam studi validasi.
Strain eksklusivitas harus relevan (misalnya L. innocua harus dipilih untuk metode konfirmasi alternatif
L. monocytogenes yang divalidasi).

91 *

METODE TYPING DAN KONFIRMASI ALTERNATIF

YANG DIVALIDASI (7)

Evaluasi hasil (7.4)

Uji strain inklusivitas dan eksklusivitas yang dipilih sesuai dengan konfirmasi alternatif yang
telah divalidasi atau metode typing yang sedang diverifikasi.
Tabulasikan hasil studi inklusivitas dan eksklusivitas seperti yang ditunjukkan pada Tabel 15.
Laporkan kesepakatan dan penyimpangan antara hasil konfirmasi yang diharapkan atau hasil
typing dengan hasil metode konfirmasi atau metode typing yang diverifikasi.

92
*

46
 METODE TYPING DAN KONFIRMASI ALTERNATIF
YANG DIVALIDASI (7)
Tabel 15 — Tinjauan hasil verifikasi untuk metode konfirmasi
alternatif tervalidasi atau metode typing

93

METODE TYPING DAN KONFIRMASI ALTERNATIF

YANG DIVALIDASI (7)
Batas penerimaan (7.5)
Hasil konfirmasi alternatif atau metode typing yang diverifikasi harus sama dengan konfirmasi yang
diharapkan atau hasil typing untuk semua strain yang diuji. Oleh karena itu, sebaiknya disetujui
100%.

Analisis akar penyebab (7.6)

Ketika hasilnya tidak memenuhi batas penerimaan, lakukan analisis akar penyebab untuk
memberikan penjelasan dari hasil yang diamati.
Analisis akar penyebab harus dilakukan untuk menentukan masalah seperti (namun tidak terbatas
pada):
— kesalahan analitik karena praktik laboratorium yang buruk;
— kesalahan analitik dalam penerapan protokol (misalnya waktu atau suhu inkubasi yang salah);
— formulasi medium/media kultur;
― identitas strain uji yang benar.

94 *

47
 rumahmutu.id

8. RINGKASAN BATAS PENERIMAAN UNTUK VERIFIKASI

METODE YANG DIVALIDASI

95

RINGKASAN BATAS PENERIMAAN UNTUK VERIFIKASI

METODE YANG DIVALIDASI (8)
Tabel 16 — Batas penerimaan untuk verifikasi metode yang
sudah divalidasi

96

48
 LAMPIRAN A
(INFORMATIF)
Klasifikasi kategori (pangan) dan kombinasi target
yang disarankan untuk studi verifikasi

97 *

LAMPIRAN
• Lampiran A (informatif) - Tabel A.1 menguraikan klasifikasi pangan yang
ditujukan untuk memandu laboratorium pengguna dalam pemilihan dari item
(Pangan) dalam kategori (Pangan) yang sesuai saat melakukan verifikasi
metode. Itu sifat intrinsik makanan seperti kandungan mikrobiota indigenous,
kadar lemak, pH, kadar garam, aktivitas air dan keberadaan senyawa
antimikroba dapat memiliki pengaruh besar pada hasil dari sebuah analisis
metode.

• Oleh karena itu, sifat intrinsik makanan telah dipertimbangkan sejauh mungkin
dalam klasifikasi pangan, tetapi banyaknya variasi makanan yang tersedia
membuat pertimbangan ini sulit untuk dilakukan dengan menerapkan akhir
dari level jenis (pangan).

98

49
 15 KATEGORI PANGAN + 1 KATEGORI PAKAN + 2 LAINNYA
(ISO 16140-3)

Susu mentah Susu proses Daging mentah & Produk daging Unggas mentah Produk daging
Produk daging siap saji & siap & Produk ungas unggas siap saji
& produk panas &
panas ulang siap masak
siap masak & siap panas
susu Produk susu (kecuali (4) (5) ulang (6)
(1) (2) ungas)(3)
Serealia,buah,
Telur & Produk Ikan & seafoods Buah segar Buah & kacangan,
telur mentah & siap Produk dan Produk
masak (blm perikanan siap
Sayuran bebijian &
(turunannya) buah diproses sayuran kering
proses) (8) saji & siap panas
(7) ulang (9) (10) (11)
(12)

Formula Produk Makanan multi- Pakan hewan Sampel Sampel

infant & coklat, bakery komponen &
& Pakan Lingkungan produksi
komponen
Serealia & ternak (Produk
infant confectionary
cemilan//meal
pangan dan
primer(PPS)
(15)
(13) (14) pakan)

99

TABEL A.1.KLASIFIKASI SAMPEL DAN RELEVANSINYA DENGAN

PENGUJIAN MIKROBA

Dan seterusnya………….

100

50
 KETERANGAN:
Catatan 1: penyiapan daging cincang termasuk daging potong besar, potong kecil dan cincang (<1% NaCl atau
spices) dimaksudkan menjalani pemanasan sebelum dikonsumsi dipersembahkan dibumbui, diasinkan dilapisid
dengan herbal atau rempah2 ditambahkan sebagai ingredient untuk meningkatkan tekstur atau sifat sensori
Catatan 2: penyiapan daging unggas meliputi daging diasinkan, daging potong dibumbui, ayam difilet, sayang
ayam, misal dengan kulit atau tanpa kulit
Catatan 3: hidangan laut/seafood termasuk moluska ivalvia hidup, gastropoda laut, echiderma dan tunikatus.
Catatan 4: Makanan siap saji (RTE= ready to eat), makanan yang disiapkan oleh rpdoser atau pabrikan untuk
konsumsi manusia secara langsung, tanpa perlu dimasak dan diproses lanjutan yetif untuk menurunkan level
yang dapat diterima untuk cemaran mikroba
Catatan 5: Makanan siap masak (RTC = ready to cook), makanan yang dirancang oleh produser atau pabrikan
untuk dimasak atau proses lain untuk menurunkan level yang dapat diterima untuk cemaran mikroba
Catatan 6: makanan siap dipanaskan kembali (RTRH, ready to reheated), makanan makanan yang dirancang
oleh produser atau pabrikan agar dapat dimakan secara langsung tanpa pemasakan, tetapi untuk
meningkatkan ctarasa sebaiknya disajikan hangat
Catatan 7: Pakan hewan ternak (mengacu REGULATION (EC) No.79/373/EEC.
Catatan 8: Air yang dijelaskan pada Tabel A.1, air yang digunakan untuk proses produksi atau untuk PPS, d.h.i.
filtrasi sampel tidak diperlukan. PPS = Primary Production Samples
Catatan 9: apabila target verifikasi termasuk mikroba pembentuk spora, termasuk sel vegetatif dan sporanya.
101

LAMPIRAN B
(INFORMATIF)
Persyaratan dan panduan tentang cara memilih item
(pangan) yang menantang untuk verifikasi item
(pangan)

102

51
 UMUM (B.1 )

• Penting untuk memilih item (pangan) yang mewakili semua laboratorium

pengguna. Lampiran ini secara khusus berlaku untuk verifikasi item (pangan).
• Item (pangan) dapat mempengaruhi hasil analisis. Komposisi pangan, latar
belakang mikrobiota dan kontaminan lainnya dapat mengganggu metode
pengujian dan membuat hasil uji tidak valid.
• Oleh karena itu diharapkan bahwa laboratorium pengguna akan memastikan
bahwa metode tersebut sesuai dengan tujuan penggunaan, yaitu menguji item
(pangan). Bahkan jika suatu metode divalidasi untuk berbagai jenis pangan, tidak
semua item (pangan) menjalani validasi; Oleh karena itu, laboratorium pengguna
harus menunjukkan bahwa metode tersebut dapat diterapkan pada item (pangan)
yang diuji di laboratorium. Karena hanya satu item (pangan) yang diperlukan per
kategori (pangan), maka penting untuk melakukan verifikasi item (pangan)
dengan item yang paling menantang.

103 *

EFEK MATRIKS SEBAGAI PERTIMBANGAN (B.2)

Karakteristik Mikroba (8.2.1)

Kecuali jika makanan telah disterilkan (misalnya makanan kaleng), barang
(makanan) dapat mengandung (secara alami atau sengaja diperkenalkan
dalam proses fabrikasi) mikroba, yang dapat dikategorikan sebagai:
• Mikrobiota teknologi seperti biakan mikroba dan probiotik, misalnya
makanan yang difermentasi dan diawetkan, produk makanan probiotik
yang diinokulasi dengan mikrooba dari 106 cfu / g sampai 109 cfu / g, dll.
• Sampel berlatar belakang mikrobiota tinggi, misal: daging cincang unggas,
sampel feses, susu mentah, dll.
• Keberadaan mikroba pembusuk yang merupakan mikrobiota asli ini dapat
mempengaruhi pemulihan dan pertumbuhan mikroba target.

104

52
 KARAKTERISTIK FISIK DAN KIMIA (B.2.2)
Parameter fisik dan kimia berikut diketahui mempengaruhi pemulihan
mikroba dan / atau pada kinerja metode (lihat seri ISO 6887):
Komposisi, mis. kandungan lemak tinggi, lesitin, pengental, kandungan
nutrisi;
pH, mis. pH <4-5 (minuman, saus, dll.);
Potensi reduksi oksidasi;
Aktivitas air, mis. aw <0,85 (tepung, makanan dengan kelembaban rendah);
Zat antimikroba dan penghambat pertumbuhan, misalnya polifenol, enzim,
penghambat molekuler;
Struktur fisik makanan, mis. viskositas/kekentalan, solubilitas/kelarutan
Warna. misal, pewarna makanan

105

Proses pembuatan matriks yang dipertimbangkan seringkali

dapat memiliki langkah perlakuan (pemanasan, proses tekanan
tinggi, dll.) yang dapat melukai sel mikroba.
Ini mempengaruhi kemampuan berkembang biak (culturability)
sel dan karena itu mempengaruhi pemulihan mikroba (ini
menjadi perhatian).

106

53
 PEMILIHAN ITEM (MAKANAN) UNTUK VERIFIKASI (B.3)
Karakteristik mikroba, fisik, kimia dan proses yang
direkomendasikan di atas dapat ditemukan di item
(pangan) di antara semua kategori (pangan) yang Tabel B.1. Contoh item (pangan) dan
dijelaskan dalam Lampiran A. Karakteristiknya
Saat memilih item (pangan) yang menantang per
kategori, laboratorium pengguna harus memilih, di
antara item (pangan) diuji di laboratoriumnya, item
yang menunjukkan salah satu karakteristik yang
menantang.
Cara terbaik untuk memilih item (pangan) yang
menampilkan kombinasi karakteristik (misalnya pH +
aw) seperti ini mewakili skenario terburuk.
Untuk lingkup kisaran pangan yang luas, minimal
lima item (pangan) dipilih dari lima kategori
(pangan) diperlukan (4.4).
Jika memungkinkan, masing-masing dari lima item
(pangan) harus memiliki karakteristik yang berbeda
atau kombinasi karakteristik untuk mencakup kasus
yang berbeda.

107

PEMILIHAN ITEM (PANGAN) JUGA BERGANTUNG PADA PRINSIP METODE

YANG DAPAT MENGORIENTASIKAN LABORATORIUM PENGGUNA DALAM
PEMILIHAN ITEM (PANGAN). TABEL B.2 MENUNJUKKAN CONTOH PRINSIP
METODE YANG KINERJANYA DAPAT DIPENGARUHI OLEH KARAKTERISTIK
PANGAN.
Tabel 2. Contoh karakteristik item (pangan) yang dapat mempengaruhi prinsip
kinerja metode yang berbeda

108

54
 LAMPIRAN C
(INFORMATIF)
Verifikasi Metode Kualitatif
(CONTOH)

109

C.1. METODE DIVERIFIKASI

LAB PENGGUNA SEBAIKNYA MEMVERIFIKASI ISO 6579-1. LOD50 UNTUK METODE DIPEROLEH DARI KAJIAN
DATA VALIDASI UNTUK METODE, DITEMUKAN MENJADI 2,5 CFU/PORSI UJI .
C.2. PERSIAPAN VERIFIKASI: PENGHITUNGAN AWAL MIKROBA AKAN DIGUNAKAN UNTUK VERIFIKASI
METODE DILAKUKAN UNTUK MEDAPATKAN PERKIRAAN KONSENTRASI INOKULUM ITU AKAN DIGUNAKAN.

1) Siapkan kultur/biakan mikroba dalam kondisi yang

sesuai (medium, suhu, waktu inkubasi). Ikuti
prosedur yang ditentukan dalam ISO 11133.
2) Lakukan penghitungan biakan pada media non-
selektif (PCA/TSA) untuk menentukan sel
konsentrasi. Untuk pengenceran desimal dan detail
enumerasi, ikuti ISO 7218 dan ISO 6887-1.
Periksa kemurnian strain

Hasil penghitungan akan digunakan sebagai titik awal pengenceran

untuk inokulasi porsi uji. Dalam contoh ini, konsentrasi awal ditentukan
menjadi 5 × 108 cfu / ml (lihat Gambar C.1).
Gambar C.1 — Contoh penentuan awal dari
konsentrasi/ level inokulum

CATATAN : Biakan semalam (24) jam dimaksudkan untuk mendapatkan mikroba dalam fase pertumbuhan
diam. Ubah kondisi biakan jika mikroba target membutuhkan waktu inkubasi yang lebih lama.

110

55
 VERIFIKASI: MENGGUNAKAN KONSENTRASI YANG TELAH DITENTUKAN SEBELUMNYA (6 × 108 CFU / ML
UNTUK CONTOH INI), PERSIAPKAN PENGENCERAN UNTUK MENCAKUP TINGKAT KONTAMINASI TARGET (LIHAT
GAMBAR C.2). PENGENCERAN YANG DIPILIH UNTUK INOKULASI ADALAH
BERDASARKAN VALIDASI LOD50 (DIASUMSIKAN 2,5 CFU / PORSI UJI ) DARI LAPORAN VALIDASI ISO 6579-1

biakan baru, 6 x
108 cfu/mL Lakukan penghitungan paralel dengan inokulasi porsi
uji

111

GAMBAR C.3. CONTOH INOKULASI PORSI UJI KETIKA

MENGGUNAKAN PROTOKOL 1

112

56
 GAMBAR C.4. CONTOH INOKULASI PORSI UJI KETIKA
MENGGUNAKAN PROTOKOL 2

113

GAMBAR C.5. CONTOH INOKULASI PORSI UJI KETIKA

MENGGUNAKAN PROTOKOL 3

114

57
 GAMBAR C.6. CONTOH ENUMERASI TINGKAT INOKULUM
AKTUAL/SAAT INI

115

GAMBAR C.6. CONTOH ENUMERASI TINGKAT

INOKULUM AKTUAL/SAAT INI
— Sebagai alternatif, pendekatan MPN dapat digunakan untuk menentukan
tingkat kontaminasi inokulum.
— Untuk protokol 1 dan 2, MPN dilakukan menggunakan 3 × 1 ml
pengenceran C dan D dan 3 × 0,3 ml pengenceran D. Lihat juga Gambar
C.7.
— Untuk protokol 3, MPN dilakukan dengan menggunakan 3 × 3 ml, 3 × 1 ml
dan 3 × 0,3 ml inokulum. Lihat juga Gambar C.8.
Hasil MPN (dinyatakan sebagai MPN/ml dari tingkat inokulum terendah)
ditentukan dengan menggunakan Tabel C.1.Gunakan hasil MPN yang
diperoleh dan lihat Tabel 7 (untuk protokol 1) atau Tabel 9 (untuk protokol 2)
untuk menentukan eLOD50.

116

58
 GAMBAR C.7. PENENTUAN MPN TINGKAT Gambar C.8. Penentuan MPN tingkat
INOKULUM UNTUK PROTOKOL 1 DAN 2
inokulum untuk Protokol 3

117

TABLE C.1. TABEL MPN UNTUK PERHITUNGAN TINGKAT INOKULUM LEVEL MENGGUNAKAN PROTOCOLS 1, 2 ATAU 3

a) Jika hasil kategori kelangkaan adalah 3, kombinasi MPN

sangat tidak mungkin terjadi. Dalam hal ini, percobaan
harusdiulangi.

118

59
 LAMPIRAN D
(INFORMATIF)
Verifikasi Metode Kuantitatif
(CONTOH)

119

Tingkat kontaminasi yang digunakan harus

mewakili kisaran kontaminasi alami yang
ditemukan dalam sampel yang diuji di
laboratorium pengguna.
Persiapan sampel laboratorium dan porsi uji (lihat
Gambar D.1):
1) Untuk satu item (pangan) misalnya tiramisu,
terkumpul minimal 10 sampel laboratorium.
Setiap sampel laboratorium dihomogenkan dan
dibagi menjadi 2 porsi uji.
2) Jika tidak tersedia item (pangan) dengan
kontaminasi alami (atau kontaminasinya <10 cfu
/ g), menginokulasi suspensi awal dengan strain
yang dipilih. Jika kontaminasi buatan digunakan,
hitung, secara paralel, suspensi inokulum
(digunakan untuk menyiapkan suspensi awal)
menggunakan media non-selektif (PCA, TSA)
Gambar D.1 - Persiapan sampel untuk penentuan
Simpangan Baku Reprodusibilitas Intralab (SIR)

120

60
 3) Setiap suspensi awal kemudian dianalisis
mengikuti protokol metode. Kondisi pengujian
yang digunakan dalam analisis dari porsi uji A
dan B harus berbeda sebanyak mungkin tetapi
dalam ruang lingkup validasi (misalnya teknisi,
bets media biakan dan pereaksi, bila relevan -
strain yang digunakan untuk kontaminasi
buatan,peralatan dan hari uji berbeda, jika
sampel laboratorium terinokulasi dapat
dibuktikan cukup stabil). Lihat Gambar D.2.
untuk strain berbeda dapat juga digunakan
untuk sampel lab yang berbeda tetapi tidak
untuk porsi uji A dan B.
4) Dari hasil yang diperoleh, hitung Simpangan
Baku Reprodusibilitas intralaboratorium (SIR)
(lihat 6.1.6 dan 6.1.7).

Gambar D2. Saran variasi untuk

penentuan SIR

121

- CONTOH

D.2.1 Persiapan verifikasi: pengencera

n 1:10,
Penghitungan awal suspeni mikroba misal: 1
yang akan digunakan untuk verifikasi mL dalam 9
mL
metode, dilakukan untuk memberikan pengencer

perkiraan konsentrasi inoculum yang

akan digunakan (lihat Gambar D.3).
Siapkan biakan mikroba dalam kondisi pengenceran 10-1 pengenceran 10-6 pengenceran
yang sesuai (media, suhu, waktu 10-7

inkubasi). Dan cek kemurniannya.

Bila gagal, re-isolasi, pilih dan
identifikasi koloni murni dan mulai
ulang/restart subkultur. Ikuti prosedur konsentrasi
awal : 5 x
ISO 11133:2014, 5.4 107cfu/mL

Gambar D.3. Contoh penentuan awal

konsentrasi inokululm

122

61
 - CONTOH

D.2.2. Verifikasi:
1) Ulangi pembiakan dengan pengenceran

memperhatikan konsentrasi yang

1:10, misal:
1 mL dalam 9

telah ditentukan sebelumnya. mL

pengencer

2) Lab pengguna berharap

menemukan antara 102 cfu / g - 106
cfu/g dalam sampel yang diuji.
Untuk penentuan eBias, diperlukan 10-6 , harapannya, 5 x
inokulasi suspensi awal pada
10-1 harapannya 10-3, , harapannya
5 x 106 cfu/mL 5 x 104 cfu/mL 101 cfu/mL

tingkat 101 cfu / ml, 103 cfu / ml dan

105 cfu / ml.
Berdasarkan hasil uji penghitungan
uji enumerasi sebelumnya, dibuat
pengenceran yang sesuai meliputi
kisaran asumsi 101 cfu / ml hingga
107cfu / ml ( .

123

3) Inokulasikan 1 ml setiap pengenceran ke

dalam suspensi awal (duplo) untuk
menghasilkan konsentrasi akhir:
101 cfu / ml; 103 cfu / ml; 105 cfu / ml
(lihat Gambar D.5)
10-2 ,harapannya 10-4 ,
harapannya
5 x 105 cfu/mL 5 x 103
cfu/mL

Suspensi Awal A
(pengenceran 1:10 dr 10 g)
harapannya, 5 x 107 cfu/porsi
uji = 5x106/g porsi uji =
5x105/mL suspensi awal
harapannya, 5 x 103 cfu/porsi
harapannya, 5 x 105 cfu/porsi
uji = 5x102/g porsi uji =
uji = 5x104/g porsi uji =
5x101/mL suspensi awal
5x103/mL suspensi awal

124

62
 LANJUTAN

4) Hitung menggunakan metode yang

diverifikasi(lihat Gambar D.6): Diharapkan X
cfu/mL
inokulasi dlm suspensi
- Porsi uji yang tidak diinokulasi
awal
-Porsi uji diinokulasi (A dan B)
-Suspensi inokulum (digunakan untuk menyiapkan
Porsi uji tidak suspensi Awal A Suspensi Metode diverifikasi
suspensi awal) diinokulasi
Awal B
Metode diverifikasi dg item (pangan) tanpa item (pangan)
5) Bandingkan hasil metode yang akan diverifikasi(kontrol negatif)
dengan item (pangan) yang terkontaminasi
buatan dengan hasil suspensi inokulum yang
diuji (tanpa item/matriks) dengan metode yang
sama.
Hasil dari kontrol negatif (porsi uji yang tidak
diinokulasi) dapat menjadi informasi penting
ketika diperlukan analisis akar penyebab (lihat
6.2.7)
Gambar D.6. Contoh verifikasi metode kuantitatif
(eBias) dengan menggunakan kontaminasi buatan

125

126

63
127

64