VERIFIKASI METODE UJI MIKROBIOLOGI

Kartika S.
PEMBAHASAN

ƒ Defnisi
ƒ Validasi atau Verifikasi ?
ƒ Tahap Validasi dan Verifikasi
ƒ Verifikasi Mikrobiologi
DEFINISI

ƒ Validasi metode uji adalah serangkaian kegiatan yang dilakukan

laboratorium untuk membuktikan bahwa suatu metode uji mampu
memberikan hasil analisa yang dapat dipercaya, dengan melakukan
analisa terhadap karakteristik metode uji tersebut

ƒ Verifikasi metode uji merupakan kegiatan laboratorium untuk

mengontrol suatu metode uji dengan menggunakan sebagian
karakteristik validasi, agar dapat memberikan hasil analisa yang
benar.
DEFINISI

ƒ Verifikasi metode uji dilakukan untuk metode – metode yang telah

diakui secara nasional maupun internasional misalnya: SNI, AOAC,
AOCS, ISO, dll,

ƒ Jika terjadi modifikasi terhadap acuan tersebut atau sumber metode

berasal dari acuan tidak baku maka harus dilakukan validasi

ƒ Metode standar atau metode referens, tidak sepenuhnya sudah di

validasi untuk tiap katagori pangan
ACUAN VERIFIKASI & VALIDASI MIKROBIOLOGI

ƒ SAC-SINGLAS, 2002 – Guidance Note C&B AND ENV 002 Method Validation of
Microbiological Methods

ƒ ALACC GUIDE 2007 - Analytical Laboratory Accreditation Criteria Committee

ƒ ISO 16140-3, 2021 - Microbiology of the food chain — Method validation —

Protocol for the verification of reference methods and validated alternative
methods in a single laboratory
ISO 21528.2

ƒ Egg Product
ƒ Raw Meat
ƒ Animal Feed
ƒ Pasteurized milk
ƒ Tiramisu
KATEGORI PANGAN KAN K-01.04 PERSYARATAN TAMBAHAN AKREDITASI
LABORATORIUM PENGUJIAN BIOLOGI
ƒ Untuk setiap matrix-category (A) sampel yang dipilih
ƒ masukkan sedikitnya tiga (3) matrix-sub category (B)

Contoh
ƒ pada lampiran 3, untuk verifikasi metode dengan matrix-
category pangan “susu dan produk analognya”
ƒ maka dapat dipilih 3 matrix-sub category misalnya
(1) Susu dan Buttermilk
(2) Susu Fermentasi dan Produk Susu Fermentasi
(3) Krimer Minuman

ƒ Egg Product
ƒ Raw Meat
ƒ Animal Feed
ƒ Pasteurized milk
ƒ Tiramisu
Implementation verification
ƒ Verifikasi implementasi bertujuan untuk menunjukkan kompetensi laboratorium untuk melakukan metode
yang divalidasi. Hal ini dicapai dengan kemampuannya untuk mendapatkan hasil yang diharapkan pada
item (makanan).

Laboratorium harus meninjau data validasi untuk metode tersebut;

ƒ untuk metode kualitatif:
pilih satu item yang diuji selama studi validasi yang termasuk dalam ruang lingkup aplikasi laboratorium
gunakan item yang dipilih ini dan ukuran sampel yang digunakan dalam studi validasi untuk melakukan
verifikasi implementasi;
ƒ untuk metode kuantitatif: pilih item yang termasuk dalam ruang lingkup validasi metode
Food item verification
Verifikasi item bertujuan untuk menunjukkan kompetensi laboratorium untuk melakukan metode yang
divalidasi dengan item yang diuji di laboratorium

Laboratorium harus:
ƒ pilih satu item dari setiap kategori pangan yang yang diuji dalam lingkup validasi
ƒ gunakan item ini dan ukuran sampel (atau ukuran sampel yang lebih kecil jika digunakan secara rutin di
laboratorium pengguna) yang digunakan dalam studi validasi untuk melakukan verifikasi item (makanan).
VALIDASI ATAU VERIFIKASI ?

ƒ Laboratorium harus memastikan bahwa metode pengujian yang digunakan adalah edisi yang
mutakhir kecuali metode tersebut tidak sesuai, tidak mungkin untuk digunakan atau berdasarkan
permintaan customer.
ƒ Laboratorium harus memilih metode yang tepat.
ƒ Laboratorium harus memverifikasi metode standar untuk menunjukkan bahwa metode tersebut dapat
memenuhi kinerja yang diperlukan.
ƒ Laboratorium harus memvalidasi metode non standar, metode yang dikembangkan dan metode
standar yang digunakan diluar lingkup pengujian atau dimodifikasi, metode dari publikasi ilmiah.
ƒ Jika laboratorium menggunakan metode cepat (tes kit), maka harus dipastikan bahwa tes kit tersebut
sudah divalidasi oleh badan yang berwenang misalnya AFNOR dan laboratorium cukup melakukan
verifikasi. Namun jika belum tervalidasi maka laboratorium harus melakukan validasi.
VALIDASI ATAU VERIFIKASI ?

Metode divalidasi bila:

1. Metode bukanlah metode standard
2. Metode yang dikembangkan oleh laboratorium
3. Metode standar yang digunakan di luar scope metode
4. Modifikasi pada metode standar (termasuk jika ada
pembaharuan/pengembangan metode dibandingkan yang ditetapkan
regulator).
VALIDASI ATAU VERIFIKASI ?

Metode juga diverifikasi ulang jika terjadi perubahan antara lain:

1. Instrumen utama diganti
2. Reagen utama diganti
3. Perubahan pemikiran atau visi Laboratorium yang mungkin berpengaruh
terhadap hasil uji.
4. Terjadi penggantian personil
5. Tanggal terkahir dilakukan melebihi 1 siklus akreditasi
VALIDASI ATAU VERIFIKASI ?

Apakah metode sudah di validasi? Tidak Lakukan Validasi lengkap

Ya

Sudah divalidasi sesuai ISO 16140-4 Ya digunakan sesuai scope

Tidak

Digunakan sesuai scope kategori pangan tidak lakukan perluasan scope

Ya

Melakukan verifikasi
VERIFIKASI

Verifikasi metode mikrobiologi untuk menilai :

1. Kompetensi Laboratorium dalam melakukan metode ybs
2. Kemampuan Analis melakukan metode ybs
TAHAPAN VALIDASI / VERIFIKASI

yaitu:
1. Pembuatan rencana dan rancangan kerja
2. Pelaksanaan percobaan/ pengumpulan data
3. Olah data hasil percobaan/penghitungan
4. Pembahasan hasil validasi / verifikasi yang menunjukkan
performa karakteristik metode yang bersangkutan
CONTOH RENCANA KERJA

:ĂŶƵĂƌŝ &ĞďƌƵĂƌŝ
ϭ Ϯ ϯ ϰ ϭ Ϯ ϯ
ϭ͘DĞŶĞƚĂƉŬĂŶŵĂƚƌŝŬƐLJĂŶŐĂŬĂŶĚŝƵũŝ
Ϯ͘ĞŬƌĞŐƵůĂƐŝ
ϯ͘DĞŶLJŝĂƉŬĂŶŵĞĚŝĂ͕ďĂŚĂŶŬŝŵŝĂ͕ƉĞƌĂůĂƚĂŶĚĂŶŝŶŽŬƵůƵŵ
ϰ͘WĞůĂŬƐĂŶĂĂŶǀĞƌŝĨŝŬĂƐŝ
ϱ͘WĞŶŐƵŵƉƵůĂŶĚĂƚĂĚĂŶŽůĂŚĚĂƚĂ
ϲ͘WĞůĂƉŽƌĂŶ
PARAMETER VERIFIKASI METODE MIKROBIOLOGI

ALACC GUIDE 2007

Analytical Laboratory Accreditation Criteria Committee
Parameter yang Identifikasi Kuantitatif Kualitatif Verifikasi
di evaluasi (P/A) (jika
memungkinkan)
Akurasi Ya Ya Tidak Tidak
Efek Matrix Tidak Ya Ya Ya
Presisi Tidak Ya Tidak Ya
Selektivitas Tidak Ya Ya Tidak
Spesifitas Ya Ya Ya Tidak
Robustness / Ya Ya Ya Tidak
Ruggedness
Linearitas /Range Tidak Ya Tidak Tidak
PARAMETER VERIFIKASI METODE MIKROBIOLOGI ISO 16140.3
ƒ Parameter verifikasi untuk metode kualitatif dan semi kualitatif adalah sensitifitas dan
positif /negatif palsu.
ƒ Parameter verifikasi untuk metode kuantitatif adalah Relatif standar deviasi.
ƒ Parameter verifikasi metode untuk titer antibodi (HA/HI, ELISA) analisa hasil dapat
menggunakan uji statistik T-test atau ANOVA.

Metode Karakteristik Implementasi Item verifikasi

Kualitatif Estimasi LOD50 (eLOD50) √ √

Kuantitatif Intralaboratory standard √ NA

deviation (SiR)
Estimasi bias NA √

eLOD50 = estimasi Level of Detection probability 50%

Protokol Tingkat inokulasi

Tinggi Tengah Rendah 3-5 cfu/bagian Blanko Replikat

9xLOD50/ 3xLOD50/ 1xLOD50/ tes
bagian tes bagian tes bagian tes
1 1 4 4 - 1 10
2 - 3 5 - 1 9
3 - - - 7 1 8
Protokol 1 dapat digunakan bila terdapat ketidakpastian dalam mencapai tingkat kontaminasi
yang diinginkan dari bagian uji. Tidak diketahui tingkat inokulum yang sebenarnya, untuk
menginokulasi sampel uji
Protokol 3 dapat digunakan bila tingkat kontaminasi inokulum diketahui, misalnya ketika
menggunakan bahan referensi dengan konsentrasi yang diketahui.
Protokol 2 dapat digunakan jika protokol yang telah dipilih gagal dan eksperimen perlu diulang

Sac-Singlas 3.1.
When such a guidance is not available in the standard methods, as a general guidance, the
number of organisms used as inoculum in the validation tests for pathogens in the sample to be
examined should be between 10 to 100.
SYARAT KEBERTERIMAAN

ƒ Syarat keberterimaan parameter verifikasi / validasi harus ditetapkan oleh laboratorium jika tidak
tercantum dalam metode acuan verifikasi / validasi.

ƒ Metode Kualitatif Sensitifitas dan Spesifitas

ƒ Metode Kuantitatif Akurasi dan Presisi

ƒ Penetapan syarat keberterimaan sebaiknya mempertimbangkan =

− tingkat kontaminasi bakteri target dan bakteri lain yang tumbuh dalam sampel
− struktur fisik sampel (misalnya viskositas, Aw, pH dsb)
− proses pengolahan yang diterapkan terhadap sampel
− risiko terhadap kesehatan konsumen
ƒ Contoh yang akan digunakan disarankan sampel natural/asli.
ƒ Sampel natural/asli mencerminkan kondisi sampel misalnya adanya penghambatan alami atau
kompetisi mikroba lainnya, misal adanya kandungan minyak atsiri dan flora normal sampel.
ƒ Bila sampel natural kemungkinan sangat kecil atau tidak mengandung mikroba, tambahkan mikroba
spike
ƒ Sampel yang disteril mencerminkan korelasi sampel dengan mikroba yang di spike.
ƒ Pada verifikasi metode tidak dilakukan resuscitasi mikroba yang injured karena proses
pengolahan/proses produksi, tetapi hanya dilakukan sesuai metode yang digunakan.
ƒ Jika dilakukan spiking, maka jumlah target adalah jumlah spike yang ditambahkan.
 kol/ml)
  

 

 

 

"

 

  








ƒ Kultur phase 3
 

'

  )


  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

+ 

 


PEMBUATAN INOKULUM

 

  

"

 

& &


ƒ Disiapkan pada jumlah level rendah

"

 

 

 
(1-10 kol/ml) dan level tinggi (10-100

( 

' 

 

 

  

'

 

 

% %

'

 

  


ůŽŐ

 




ŝůƵƐŝ

  

 ,
ŬŽůŽŶŝƉϭ

 


ŬŽůŽŶŽƉϮ


>dŬŽůͬŵů

 

 

 

. 


Ϭ

ͲͲͲ
ͲͲͲ

 $ $


dh
dh


Ͳϭ

ͲͲͲ
ͲͲͲ

dh
dh

" 

 # #

%
ͲϮ

ͲͲͲ
ͲͲͲ


dh
dh

  


Ͳϯ

ͲͲͲ
ͲͲͲ

dh
dh

&

 
Ͳϰ

ͲͲͲ
ͲͲͲ
dh
dh
Ͳϱ

ͲͲͲ
ͲͲͲ
dh
dh
Ͳϲ

ϵϬϬ
ϴϵϲ

ϴ͘ϵϱ
ϵ͘ϬнϬϴ
Ͳϳ

ϵϱ
ϴϱ

ϴ͘ϵϱ
ϵ͘ϬнϬϴ
Ͳϴ

ϭϬ
ϭϱ

ϵ͘ϭϬ
ϭ͘ϯнϬϵ
YANG DIUJI DALAM VERIFIKASI
Contoh + cemaran
Sampel alami atau dilakukan
sterilisasi contoh untuk verifikasi
analisa kuantitatif
10 atau 25 g contoh ditimbang
dalam 90 atau 225 ml larutan
fisiologis atau pengkaya sesuai
prosedur,
lalu di homogenkan
Tambahkan sejumlah inokulum
sesuai level. Siapkan minimal 7
ulangan
Lakukan pengujian sesuai
metode
Cemaran Contoh
Masukkan sejumlah inokulum ke Sampel alami atau diakukan
tabung broth100 atau 250 ml sterilisasi contoh untuk verifikasi
sesuai level
Lakukan pengujian sesuai 10 atau 25 g contoh ditimbang
prosedur dalam 90 atau 225 ml larutan
fisiologis atau pengkaya sesuai
prosedur,
lalu di homogenkan
Siapkan minimal 7 ulangan
Lakukan pengujian sesuai
metode
VERIFIKASI UJI KUALITATIF

Presumptive

+ -
Konfirmasi (+) a b a+b
Konfirmasi (-) c d c + d
a + c b + d
Untuk Protokol 3 = 6 dari 7 replikat harus positif.

Sensitivity (%) : a / (a+c) x 100

Spesificity (%) : d/ (b+d) x 100
False positif rate (%) : b/ (b+d) x 100
False negative rate (%) : c/ (a+c) x 100
n = a + b + c + d = total test
Efisiensi E = (a+d)/n
VERIFIKASI UJI KUANTITATIF

Sample Laboratorium
Sampel Uji

Dihomogenkan

Sampel A Sampel B

Suspensi A inokulasi Suspensi B

Analisa Analisa

Hasil A Hasil B
VERIFIKASI UJI KUANTITATIF

1. Uji presisi
ƒ Kerjakan uji presisi dengan melakukan pengukuran terhadap repitabilitas atau reprodusibilitas.
ƒ Reprodusibilitas dilakukan pada laboratorium yang berbeda tetapi bila tidak memungkinkan bisa dilakukan
dengan reprodusibilitas internal yaitu pada laboratorium yang sama, waktu berbeda, tingkat konsentrasi
berbeda
ƒ RSD ditentukan dengan level analit yang berbeda dalam range perhitungan sesuai metode
ƒ RSD lebih besar dari 0.1 (5 sampai 10 kali RSD pure culture) menunjukkan kesulitan dalam analisa.
2. Recovery
Recovery (%) = (C1 -C2)/C3 x 100 %
Dimana :
C1 = Rerata log simplo dan duplo dalam campuran contoh ditambah sejumlah spike bakteri
C2 = jumlah koloni dalam contoh (blanko)
C3 = jumlah spike bakteri yang ditambahkan ke dalam contoh
Dari minimal 7 kali ulangan, recovery sampel yang dicemari harus lebih dari 70 % dan sifatnya sesuai
dengan kontrol positif
ISO 16140-3

SIR = standar deviasi

i = sampel ke i i = 1, 2, 3 dst
n = jumlah sampel
yiA, yiB = log hasil pengamatan
 s

w w w

t w w w w w s s

t t t s

t t t t t t t t

t t t t

t t t t t t t t

t t t

  Z Q G I 9

” ‘ [

: 

’ ;

K <

\ ?

’ <

¤ C

? D

x u u

H <

J > 0

t } w z w { w

? 1

w ?

: ?

t t t { x z |

• ?

t D

K @

<

t t t t t t t

H <

40
¦ A

<

640
410
110
– t t t

; A

• @

C B

H <

<

>

s u

} w u u

x s w }

t y } s

t y y {

t t t t

t t t t

H
40

t t t t

t t

330
620
182
U

˜ ˜  € H I F F F F F

~ 0

] G G

¨ — S N

` V J

: ?

‘ T

9 ^

B >

K B

? /

p :

 _

ˆ K

C H

; 8

J `

› O

y y y s x x x x x x x u

V
š œ €

› ?

v v v v v v v v v v v v

s u x | | { z z z w t w

: P

t { t s s | | s t u y t

š D

u w y y | x x z w x u x

t u u } } y u z x z y u O

† ž

<

: ?

; P

ƒ U

’ ]

 ‡ …

‚ U

y y s s s s x x x x x u

v v v v v v v v v v v v

} u w z u u z { } { x w

t x | t { u t } u | w t

} { | w w s w } z x t x

u u t x u | x | } y u u

 e

t t t t t t t t t t t t

v v v v v v v v v v v v

x t } u x s t t x u x t

t y t x s x z z z { u t

y | } z w u } s { | z t

u t u s w w | t { w { t

<

<

t t t t t t t t t t t t t t

v v v v v v v v v v v v v v

t w t t x t t u t t t t t t

s y y t } u } t t t z s y t

u x u | u x } w w s { w x x { t

z } t z { y x } t y y | z s z t
 PRESISI (REPEATIBILITY)

Conto
h+Ce
mara
n

Log Mean log a-log {(log a-log {(log a-log

CC a CC b CCa Log CCb X1 b b)/X1} b)/xX1}^2
1 510 580 2.71 2.76
2 560 545 2.75 2.74
3 490 2.69
4 810 2.91
ě = Ȉ R log
n
dimana:
n R log= Selisih nilai logaritma dari CC1 dan CC2
ě = Presisi (jumlah rata-rata selisih nilai logaritma CC1
dan CC2 dibagi jumlah contoh)
n = jumlah contoh

Kriteria 99% presisi = R ” 3.27 ě

PRESISI (REPEATIBILITY)
AKURASI (RECOVERY)

Koloni/gram
Log Rerata log
Spike Ulangan cawan Log 1 Log 2 % Recovery
Spike cawan 2 1&2
1
37 1.5682 1 38 37 1.5798 1.5682 1.5740 100.3693
37 1.5682 2 40 38 1.6021 1.5798 1.5909 101.4488
37 1.5682 3 42 40 1.6232 1.6021 1.6127 102.8346
37 1.5682 4 49 48 1.6902 1.6812 1.6857 107.4937
37 1.5682 5 38 36 1.5798 1.5563 1.5680 99.9899
37 1.5682 6 42 40 1.6232 1.6021 1.6127 102.8346
37 1.5682 7 38 37 1.5798 1.5682 1.5740 100.3693

Persyaratan : % Recovery > 80 % untuk

TPC
Kesimpulan : Hasil memenuhi
syarat
PUSTAKA

ƒ How To Meet ISO 17025 Requirement for Method Verification. Prepared by AOAC International.
www.aoac.org
ƒ KAN K-01.04 Persyaratan Tambahan Akreditasi Laboratorium Pengujian Biologi
Head Office Laboratory Division
Perkantoran Hijau Arcadia, Tower F Jl. Science Timur 1 Blok B3 – F1
6 – 7th Floor, Suite 602 Jl. TB Kawasan Industri Jababeka V
Simatupang Kav.88 Jakarta Selatan Cibatu, Cikarang – Bekasi 17530