VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE

ANALISIS KIMIA SEDIAAN FARMASI DI

LABORATORIUM PENGUJIAN MUTU
 Pendahuluan
Metode-metode analisis yang digunakan di
laboratorium pengujian (industri farmasi,
pemerintahan) harus secara rutin dikembangkan
atau dimodifikasi untuk memperoleh metode
analisis yang lebih baik dan mutakhir.
Pengembangan metode tidak dapat dipisahkan
dari validasi metode analisis, karena metode
analisis hasil pengembangan tersebut baru
dapat dikatakan baik, kalau dapat divalidasi
secara ilmiah kesesuaiannya dengan tujuan
pengembangan metode tersebut.
Desain Kemanan
Rasional dan khasiat
Kualitas Kualitas Kualitas

Pemasaran,
Manufaktur Manufakt Penjualan
Penemu Pengembang senyawa ur obat
an Aktif dan
an jadi Penggunaa
n

-Riset dasar -Uji Produksi Produksi -Promosi

- Skreening praklinik senyawa sediaan jadi
- Distribusi
-Uji pada - Uji klinik aktif
hewan
- Layanan
-
Komunikasi

GLP & GMP GMP

GDP &
GCP GPP

Perjalanan obat baru

PROSES PENGEMBANGAN SEDIAAN FARMASI
RISET
PENEMUAN OBAT PASEN

CALON MARKET
OBAT FASE I FASE II FASE III

PENGEMBA VALIDASI
OPTIMASI UJI MANUFAKTU
NGAN PROSES
FORMULA FORMULA STABILITAS MANUFAKTUR RING

METODE FINALISASI VALIDASI

PENGEMBANGAN
ANALISIS PENGAWASAN
METODE METODE METODE
ANALISIS AWAL UNTUK MUTU
FORMULA ANALISIS ANALISIS
 Laboratorium Pengujian dan Pengawasan Mutu

• Pengawasan mutu merupakan bagian penting dari

kegiatan industri (CPOB ) dan kegiatan pemerintah
dalam pengawasan/pengendalian sediaan farmasi,
kosmetika dan pangan.
• Salah satu bagian integral dari sistem mutu adalah
pengawasan mutu, meliputi sampling, penanganan
sampel, spesifikasi, pengujian, pelaporan dan
dokumentasi.
• Dalam pelaksanaan pengujian mutu sebaiknya digunakan
metode yang sesuai. Biasanya digunakan metode
standard. Metode non-standard dapat digunakan jika
metode standard tidak tersedia dan pelanggan
menyetujui penggunaannya.
Persyaratan Umum Laboratorium Pengujian
Mutu
• Fasilitas dan instrumen analitik yang memadai
(terkalibrasi dan terjaga kebersihannya )
• Personal yang terlatih (qualified and trained
personal)
• Metode/Prosedur pengujian yang sudah divalidasi
atau diverifikasi serta tersedia di laboratorium
• Sistem Dokumentasi dan Rekaman yang baik
• Tersedianya Mutu Baku atau Spesifikasi yang
digunakan
• Tersedianya Bahan Acuan Baku (BPFI, CRM, SRM)
Tahapan analisis kimia
Proses validasi
Validasi adalah suatu proses yang dilakukan sekurang-kurangnya 4 tahap :
A . Validasi perangkat keras
B. Validasi perangkat lunak
C. Uji Kesesuaian sistem
D. Validasi metode
(1) Perangkat keras (4) Validasi metode

VALIDASI

(2) Perangkat (3) Kesesuaian

lunak sistem

Proses diawali dengan menggunakan perangkat dan sistem yang telah

dikualifikasi. Validasi metode dilakukan dengan menggunakan sistem
yang sudah dikualifikasi dan pengujian kesesuaian sistem. Masing-
masing tahap sangat menentukan bagi keberhasilan proses validasi
Validasi/verfikasi metode wajib dilakukan
dengan berbagai alasan antara lain untuk:

1. Menjamin mutu dan pencapaian tingkat mutu

tertentu
2. Menjamin mutu produk yang dapat diterima oleh
suatu badan internasional
3. Memenuhi persyaratan akreditasi ISO 17025
4. Memenuhi persyaratan pendaftaran obat jadi/sediaan
farmasi
5. Memenuhi persyaratan metode yang digunakan pada
uji profisiensi
Validasi/Verifikasi Metode
• Farmakope, ISO 17025.2005 dan CPOB mensyaratkan
bahwa metode pengujian yang digunakan untuk
menetapkan mutu produk farmasi dan pemenuhan
persyaratan mutu/spesifikasi, harus sudah dibuktikan
kesesuaiannya terhadap akurasi, presisi dan
reliabilitasnya yang telah ditetapkan.
• Para pengguna metode standard, misalnya yang
terdapat dalam kompendia (farmakope dan kodeks)
tidak disyaratkan untuk memvalidasinya tetapi
diwajibkan untuk memverifikasi kesesuaian metode itu
pada kondisi penggunaan.
• Metode pengujian yang non-standard atau hasil
pengembangan laboratorium sebelum digunakan harus
divalidasi dahulu.
• Kegiatan validasi/verifikasi metode merupakan kegiatan
yang terencana dan dilakukan oleh personal yang
terlatih.
Laboratorium harus memvalidasi:
a. Metode tidak baku (non-standard)
b. Metode yang didisain/dikembangkan sendiri.
c. Metode standard yang digunakan di luar
lingkup yang dimaksudkan.
d. Metode standard yang dimodifikasi atau
direvisi untuk mengkonfirmasi bahwa
metode itu sesuai untuk penggunaan yang
dimaksudkan.
(ISO 17025.2005, butir 5.4.5.2)
• Validasi metode analisis adalah suatu proses ilmiah
yang dilakukan untuk membuktikan bahwa karakteristik
kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan
yang sesuai dengan tujuan pengunaannya. Atau
konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang
objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud
khusus dipenuhi.
(ISO 17025.2005, butir 5.4.5.1)
• Verifikasi metode analisis adalah suatu proses ilmiah
yang dilakukan laboratorium untuk membuktikan bahwa
laboratorium mampu menggunakan metode analisis
standar sesuai dengan tujuan penggunaannya pada
kondisi nyata laboratorium.
• Karakteristik kinerja metode (parameter
validasi/verifikasi) yang dibuktikan harus berdasarkan
pada tujuan kegunaan, kategori dan kriteria metode
tersebut.
KRITERIA METODE ANALISIS I
KADAR
SPESIFIK/SELEKTIF
BESAR

ANALISIS
KUALITATIF

KADAR • SPESIFIK/SELEKTIF
KECIL • SENSITIF
KRITERIA METODE ANALISIS II
• SPESIFIK/SELEKTIF
KADAR • AKURAT
BESAR • PRESISI

ANALISIS
KUANTITATIF

KADAR • SPESIFIK/SELEKTIF
KECIL • SENSITIF
• AKURAT
• PRESISI
 Kategori metode analisis (USP)
Kategori I
Metode analisis untuk penetapan kadar komponen
utama dalam bahan baku obat atau bahan aktif
(termasuk pengawet) dalam produk farmasi
Kategori II
Metode analisis untuk penetapan cemaran atau hasil
degradasi dalam bahan baku obat atau produk
farmasi. Metode ini terdiri dari penetapan kuantitatif (II
a) dan uji batas/kualitatif (II b)
Kategori III
Metode analisis untuk penetapan karakteristik sediaan
(disolusi, pelepasan obat, dll)
Kategori IV
Metode analisis untuk identifikasi
 Kategori Metode Analisis (FDA)
• Kategori I (Quantitative Assessment of Major Component),
meliputi Penetapan kadar senyawa aktif dalam bahan baku
dan sediaan farmasi, uji keseragaman kandungan (uniformity
content), uji disolusi/pelepasan obat.
• Kategori II a (Quantitative Assessment of Minor Component)
meliputi penetapan kadar cemaran dan hasil degradasi dalam
bahan baku dan sediaan farmasi termasuk kadar obat dalam
darah.
• Kategori II b (Qualitative Assessment of Minor Component)
meliputi uji kualitatif dan uji batas cemaran dan hasil
degradasi dalam bahan baku atau sediaan farmasi)
• Kategori III (Qualitative Assessment of Major Component)
meliputi identifikasi senyawa aktif dalam bahan baku.
Parameter yang digunakan dalam validasi metode
analisis

USP ICH
(United States Pharmacopeia) (International Conference on
Harmonization)
1. Presisi (keseksamaan) 1. Presisi
2. Akurasi (kecermatan) 2. Akurasi
3. Batas deteksi 3. Batas deteksi
4. Batas kuantitasi 4. Batas kuantitasi
5. Spesifisitas (kekhasan) 5. Spesifitas
6. Linearitas 6. Linearitas
7. Rentang 7. Rentang
8. Robustness
9. Kesesuaian sistem
 Presisi
Akurasi Rentang
Linearitas Batas deteksi dan
kuantitasi
Spesifisitas Ketegaran/
Robustness

Calon metode analisis

Metode telah divalidasi/verifikasi

Prosedur pengawasan mutu

 Hakikat Pengujian Validasi/Verifikasi
PARAMETER VALIDASI
1. Spesifisitas/Selektifitas
2. Batas Deteksi dan Kuantitasi
3. Akurasi
4. Presisi
PEMBUKTIAN UNTUK MENGUJI
Adanya gangguan (interferences)
dari senyawa lain, cemaran,
hasil degradasi atau matriks.
Kepekaan
a. Galat sistematik (bias)
b. Rekoveri (Recovery)
c. Linearitas
a. Galat acak
b. Keterulangan (Repeatability)
c. Presisi antara (Ruggedness)
d. Ketertiruan (Reproducibility)
 Strategi Validasi/Verifikasi Metode Analisis
1. Nyatakan dengan jelas tujuan dan ruang lingkup dari
metode yang akan divalidasi/verifikasi
2. Tentukan parameter kinerja metode dan kriteria
penerimaan untuk masing-masing parameter tsb.
3. Buat rencana percobaan validasi/verifikasi
4. Verifikasi kinerja dan Kalibrasi semua peralatan dan
instrumen
5. Siapkan semua bahan seperti pereaksi, pelarut dan
bahan acuan standar (BPFI, CRM, SRM), matriks dll.
6. Lakukan percobaan validasi/verifikasi secara internal
ataupun eksternal
7. Buat SOP pelaksanaan validasi/verifikasi metode untuk
kegiatan pengujian rutin (method transferred)
8. Buat kriteria untuk revalidasi
9. Buat laporan dan dokumentasi lengkap validasi/verifikasi
yang telah dilakukan.
Panduan validasi metode analisis

Badan Judul panduan Tahun terbit

ICH a. ICH Q2A : Text on validation of analytical 1994
Procedure
b. ICH Q2B Validation of analytical 1995
procedures methodology
CDER a. Reviewer guidance validation of 1994
chromatographic methods
b. Submitting sample and analytical data for 1987
method validation
c. Analytical procedure and method validation 2000
for human studies
d. Bioanalytical method validation for human 1999
studies
USP Validation of compendial method 2009
Tahapan validasi metode

1, Tahap persiapan
• Kalibrasi instrumen dan alat-alat gelas
• Penyiapan pereaksi pelarut dan bahan acuan baku
(CRM, SRM, BPFI) serta matriks sediaan (placebo)
• Uji kesesuaian sistem untuk metode kromatografi
2, Tahap validasi
• Spesifisitas
• Linieritas dan rentang
• Batas deteksi
• Batas kuantisasi
• Akurasi
• Presisi
SPESIFISITAS
Kemampuan untuk menguji secara tegas analit yang
dimaksud dengan adanya komponen lain atau yang
diperkirakan ada seperti cemaran, hasil degradasi dan
komponen matriks.
Jika spesifisitas metode tidak ada atau kurang baik maka metode
dapat dilengkapi dengan prosedur analisis pendukung yang
memadai seperti pemisahan : ekstraksi, destilasi, SPE, dll

Pengujian
a. Untuk identifikasi senyawa aktif dalam bahan atau sediaan.
Metode harus mampu menyeleksi dan mengidentifikasi
senyawa-senyawa yang ada dalam sampel yang berkaitan
dengan struktur molekulnya. Dapat dibuktikan dengan hasil positif
(atau dibandingkan dengan bahan acuan standar yang diketahui)
dari sampel yang mengandung analit dan dengan hasil negatif
dari sampel yang tidak mengandung analit.
b. Untuk penetapan kadar cemaran
Dilakukan dengan menguji sampel yang ditambahkan sejumlah
tertentu cemaran, hasil degradasi atau matriks . Dibuktikan
dengan terlihatnya secara nyata gangguan itu dan cemaran
dapat ditetapkan secara akurat dan presisi yang memadai
c. Untuk penetapan kadar
Dinyatakan dengan jelas bahwa prosedur tidak
dipengaruhi oleh adanya cemaran atau gangguan
matriks. Dalam praktek dapat dilakukan dengan cara
menguji sampel yang ditambahkan sejumlah tertentu
cemaran atau matriks dan terlihat nyata bahwa prosedur
tidak dipengaruhi oleh komponen asing tersebut.

Jika cemaran tidak tersedia maka sampel yang diuji

harus diperlakukan sebelumnya dengan menyimpan
sampel dalam kondisi “stress” yang relevan (cahaya,
panas, kelembaban, hidrolisis asam/basa oksidasi).
Dalam kasus ini pengujian dilakukan bersama sampel
utuh.
Untuk metode kromatografi, dipersyaratkan
kromatogram harus ditampilkan untuk melihat derajat
selektivitasnya dan kemurnian pucak (dengan PDAD atau
MS detektor)
LINEARITAS
Kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang proporsional
(sepadan) terhadap konsentrasi analit dalam sampel dan
dalam rentang konsentrasi yang digunakan secara
langsung atau melalui suatu transpormasi matematik yang
jelas.

Pengujian:
 Menyiapkan larutan analit sebanyak minimal 6 konsentrasi
dengan rentang 20 - 120% dari konsentrasi aktual
 Mengukur respon instrumen ke enam larutan tersebut, masing-
masing paling sedikit tiga kali pengukuran
 Buat kurva antara respon instrumen terhadap konsentrasi analit
dan hitung persamaan matematik yang memadai (persamaan
garis regresi linier atau regresi kuadrat)
 Hitung derajat linearitas melalui:
- koefisien korelasi (r) - Vxo
- % Y-intercept - faktor respon
Kurva kalibrasi:

●
Respon alat

●
●

 konsentrasi
A B C D
a. Y = bx + a (dapat dihitung dengan kalkulator)
b = kemiringan garis regresi
a = perpotongan garis dengan sumbu Y (dapat dihitung dengan kalkulator)
b. r = koefisien korelasi


 (x i  x )( yi  y )
{( xi  x ) 2 ( y 1  y ) 2 }1/ 2
 yi  yˆ i ) 2
1/ 2
 
C Sy/x = simpangan baku residu dari regresi linear   
 n2 
Sy/ x
d. Vxo = koefisien variansi regresi linear Vxo  100%
bx
Persamaan regresi kuadratik
a. Y = mx2 + nx + b
dimana y = respon instrumen, x = konsentrasi analit, n,m,b = fungsi kuadratik

 yi  b. yi  m ( xi  yi )  n ( xi . yi )
2 2
b.
Sy/ x 
n3
c. E  m  2nx
Sy/ x
d. Vxo  100%
E. x

Parameter Vxo inilah yang dijadikan dasar untuk

pemilihan kurva kalibrasi yang menggunakan regresi
linear atau regresi kuadratik dengan memilih Vxo yang
paling mendekati 2%
Kriteria penerimaan linearitas dan rentang

Metode Untuk Level Rentang Kriteria penerimaan*)

Penetapan kadar 6 50 - 150 % r>0,999
20 - 120 % %y- intercept<2,0%
Vxo<2,0 %

Disolusi 5-8 10% – 150 % dari Q r>0,99

**) %y intercept <5,0%
Vxo<5,0 %
Cemaran (Kadar 5 LOQ - 2 % r>0,98
rendah) Vxo<5,0%
Cleaning ( Kadar 5 LOQ – 20 kali LOQ r>0,98
sangat rendah) Vxo<5,0%

*) Dari : Handbook of Pharmaceutical by HPLC

**) Q Persentasi jumlah zat terlarut dalam medium
RENTANG
Rentang adalah interval antara batas terendah dan batas tertinggi
konsentrasi analit yang telah dibuktikan dengan hasil presisi,
akurasi dan linearitas yang dapat diterima.

Rentang metode diuji dengan melakukan pembuktian data yang

memperlihatkan presisi, akurasi dan linieritas yang dapat diterima, baik
pada konsentrasi terendah dan maupun tertinggi serta pada konsentrasi
lain dalam rentang sesuai dengan tujuan metode analisis
Rentang dinamik : Linearitas,
Akurasi dan Presisi
• Presisi pada Batas Terendah
* (LOQ) : RSD < 20 %
Respon

• Titik yang lain antara Batas

* terendah sampai Batas
* tertinggi: RSD < 15%
*

Batas terendah Batas tertinggi

(LOQ) (ULL)
 konsentrasi
BATAS DETEKSI DAN BATAS KUANTISASI
a. Batas deteksi (BD)
Konsentrasi terendah analit dalam sampel yang masih
dapat terdeteksi, tapi tidak perlu ditetapkan secara
kuantitatif dalam kondisi percobaan yang telah
dinyatakan

Pengujian

1. Untuk metode non instrumen, BD ditetapkan dengan

menguji sampel yang mengandung analit dalam kadar
tertentu. Dengan melakukan pengenceran secara
bertahap, ditentukan batas terendah kadar analit yang masih
dapat dideteksi secara visual (menggunakan reaksi kimia,
KLT,dll)
2. Untuk metode instrumen, BD dinyatakan:
a. Sebagai konsentrasi analit pada saat respon
menunjukkan ratio signal-noise 3 : 1 (S/N = 3).
b. Mengukur besarnya respon instrumen dari 20 larutan
blangko dan menghitung simpangan bakunya (SD).
Batas deteksi merupakan hasil perkalian simpangan
baku blangko dengan suatu faktor (3,3/b), di mana b
merupakan kemiringan garis regresi linier.
Perhitungan
- BD = Konsentrasi larutan pada S/N 3
= 3 [Konsentrasi larutan uji/(S/N)]
- BD = 3,3 (SD/b) = 3,3 (Sy/x )/b
dimana SD = simpangan baku blangko (n = 20)
b = kemiringan garis regresi (Y = bX + a)
Catatan:

SD (simpangan baku) dapat dihitung dengan cara

menghitung :
a. Simpangan baku larutan blangko
b. Simpangan baku residual garis regresi (Sy/x)
c. Simpangan baku pada perpotongan garis
sumbu Y ( Y-intercept).

Dengan demikian BD dapat diprediksi dari hasil

pengukuran larutan blangko, hasil perhitungan dari
data pengukuran larutan encer, atau dari data kurva
kalibrasi (persamaan regresi linier).
b. Batas kuantisasi (BK)
Batas kuantisasi (BK) adalah konsentrasi terrendah analit
dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan
akurasi yang diterima dalam kondisi percobaan yang
ditetapkan. BD dan BK dinyatakan dalam satuan
konsentrasi.

Suatu karakteristik metode penetapan kadar senyawa kadar rendah

dalam matriks sampel seperti cemaran dan hasil degradasi dalam
bahan baku obat atau sediaan farmasi.

Pengujian

1. Untuk metode non instrumental, umumnya ditentukan dengan

melakukan analisis sampel yang mengandung analit, lalu
menetapkan kadar terendah analit yang dapat dideteksi
dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima.
2. Untuk metode instrumental, umumnya dengan
mengukur besarnya respon latar belakang analisis
dengan cara menganalisis sejumlah larutan blangko
sampel dan menghitung simpangan bakunya. Batas
Kuantitasi (BK) adalah nilai simpangan baku larutan
blangko (SD) dikalikan faktor (10/b).
Untuk pengukuran respon instrumen yang memberikan
latar belakang (noise), maka batas kuantitasi adalah
konsentrasi analit dalam larutan di mana respon
instrumen memberikan ratio signal-noise (S/N) =10
Perhitungan:

- BK = Konsentrasi analit pada S/N 10

= 10 [Konsentrasi larutan]/(S/N)]
- BK = 10 (SD/b) = 10 (Sy/x)/b)

di mana b = kemiringan garis regresi,

SD = simpangan baku blangko
Sy/x = simpangan baku residual garis regresi
Cara lain:
Penentuan Batas kuantisasi adalah konsentrasi larutan yang
menunjukkan simpangan baku relatif 20% terhadap nilai
teoritis.
AKURASI (KECERMATAN)
Akurasi adalah tingkat kedekatan hasil pengujian metode
dengan nilai yang sebenarnya atau nilai yang dinyatakan
benar

Pengujian
Akurasi ditentukan dengan 4 cara sebagai persen perolehan kembali
(rekoveri /recovery)
a. Analisis kadar analit dengan metode yang divalidasi
terhadap sampel yang telah diketahui kadarnya.
Sampel yang digunakan adalah sampel acuan baku yang
dikeluarkan badan resmi ( SRM dari NIST, dll.).
b. Analisis kadar analit yang ditambahkan ke dalam
matriks sampe (plasebo)yang dianalisis (spiked method).
c. Jika matriks dan eksipien tidak tersedia, maka akurasi
dnyatakan sebagai persen perolehan kembali kadar analit
yang ditambahlkan pada produk jadi yang sudah
mengandung analit (standar addition method).
d. Membandingkan hasil analisis analit dengan metode yang
divalidasi terhadap hasil dengan metode baku (cara grafik).
 Kriteria penerimaan akurasi *)

Level
Jenis uji Rentang Kriteria
konsentrasi
Penetapan kadar 3 level, dengan 3 70%, 100%, 130 % Bias : + 2%
dalam bahan baku kali pengujian (80%, 100%, 120%) Rekoveri:
atau sediaan jadi 98,0 – 102,0%

Disolusi 3 level dengan 3 kali 20 – 35 % Q Bias : + 5%

pengujian 50 – 80 % Q Rekoveri:
100 – 130 % Q 95,0 – 105,0 %

Penetapan kadar 1 level dengan 3 kali LOQ – 1% Bias : + 20,0%

Rendah (Cemaran) pengujian Rekoveri:
80,0 – 120,0 %

Penetapan Kadar 3 level dengan 3 kali LOQ – 20 kali LOQ Bias : + 50,0%
sangat rendah pengujian Rekoveri:
(Cleaning) 50,0 – 150,0 %)

*) Handbook of Pharmaceutical analysis by HPLC

**) Q Persen terdisolusi
Perhitungan

1. Spiked placebo recovery

% Rec = Ch/Cs x 100%
Ch = kadar analit yang dihitung
Cs = kadar analit teoritis

2. Standard addition method

Ch = {(R2 – R1)/R1}x C
% Rec = {Ch/Ca} x 100

Ch = Analit baku (SRM) yang ditambahkan pada produk jadi,

C = kadar analit dalam sampel produk jadi, R2, R1 = respon R1 oleh
sampel produk jadi dan R2 respon sampel yang telah ditambah
analit baku,
Ca = kadar analit yang sebenarnya ditambahkan
 3. Multiple Standard Addition

No. Sampel Penambahan Kadar Kadar % Recovery

baku temuan sebenarnya (x 100)
1 So - A - -
2 S1 B A1 B1 = A1-A B1/B
3 S2 C A2 C1 = A2-A C1/C
4 S3 D A3 D1 = A3-A D1/D
5 S4 E A4 E1 = A4-A E1/E
6 S5 F A5 F1 = A5-A F1/F
Akurasi intrinsik
PRESISI (KESEKSAMAAN)
Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil analisis
individual jika prosedur dilakukan berulang kali terhadap
sampel ganda atau beberapa sampel yang homogen.

Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan baku relatif

(SBR) atau koefisien variasi (KV). Presisi metode dinyatakan
dengan tiga jenis penetapan yaitu repeatabilitas
(keterulangan), presisi antara dan reprodusibilitas
(ketertiruan)

a. Repeatability (keterulangan)
Keterulangan adalah kemampuan metode untuk
memberikan hasil analisis yang sama untuk beberapa
sampel yang kadarnya sama yang dilakukan oleh satu orang
analis pada wakt tertentu terhadap beberapa sampel yang
sama.

Keterulangan diukur terhadap 6 jenis sampel dengan

konsentrasi sama 100% dari konsentrasi aktual atau 3 jenis
sampel dengan konsentrasi 80, 100, 120% dari konsentrasi
aktual yang diukur masing-masing tiga kali (triplikasi).
b. Presisi antara (intermediate precision)
Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode dimana sampel-
sampel diuji dan dibandingkan menggunakan tenaga analis
berbeda, perlatan berbeda atau hari berbeda (inter day
precision).
Presisi antara tidak perlu diuji , jika kajian reprodusibilitas telah
dilakukan. Nama lain presisi antara adalah “Ruggedness”
c. Reprodusibilitas (ketertiruan)
Merupakan pengujian presisi yang terakhir dan tuntas.
Reprodusibilitas diuji dengan cara menyiapkan sampel yang
homogen dan stabil, lalu diuji oleh beberapa laboratorium (studi
kolaboratif). Hail ini akan memperlihatkan adanya galat acak yang
disebabkan oleh sampel dan laboratorium , serta galat
sistematik. Dihitung dengan ANOVA
d. Presisi sistem atau instrumen
Keragaman dalam pengukuran menggunakan suatu instrumen
akan memberikan kontribusi pada presisi sistem. Oleh karena itu
sistem yang digunakan harus diuji kesesuaiannya meliputi
misalnya keterulangan penyuntikan, resolusi, kesimetrisan pada
Kromatografi
Berbagai tingkat presisi dan kontribusinya pada
hasil analisis
 Kriteria penerimaan presisi *)

Repeatabilitas dan presisi antara

Jenis Pengujian Level dan Kriteria
Rentang konsentrasi penerimaan
Penetapan 3 level dengan 3 kali RSD < 2,0%
kadar/keseragaman (70, 100, 130%)
kandungan atau
6 penetapan pada 100%
Disolusi 12 sampel kadar rendah RSD < 20%
Penetapan kadar 6 replika pada LOQ dari RSD < 20,0%
Rendah (Cemaran) batas toleransinya
Cleaning 6 replikat pada 10 LOQ RSD < 20,0%

*) Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC

Dasar Perhitungan Presisi

SD
RSD  100%
x

SD 
 i
( x  x ) 2

n 1

x 
x i

n
Presisi dapat diperoleh dengan menggunakan sampel
otentik yaitu sampel yang dibuat dengan mencampurkan
analit (bahan acuan) dengan matriks atau plasebo.
Parameter yang dipergunakan untuk menyatakan presisi
adalah simpangan baku (SD) , simpangan baku relatif (SBR
atau RSD), koefisien variasi (KV), dan batas kepercayaan
(CI).
KURVA TEROMPET HORWITZ

Nilai simpangan baku relatif atau disebut juga koefisien

variasi (SBR, RSD, KV ) akan meningkat dengan
menurunnya konsentrasi analit. HORWITZ telah
melakukan kajian terhadap 3000 hasil analisis yang
diambil dari studi kolaboratif AOAC dan memberikan
hasil sebagai berikut :

SBR atau KV = + 2(1-0,5 log C)

Dimana C adalah konsentrasi yang dinyatakan sebagai

fraksi desimal

Misalnya : Untuk kadar C = 100%

maka fraksi desimalnya = 100/100 = 1
SBR atau KV = + 2(1-0,5 log 1) = 2%
• Hubungan RSD terhadap C digambarkan sebagai kurva
berupa terompet. Oleh karena itu kurva tersebut
dinamakan kurva terompet HORWITZ

• Jika nilai RSD dari percobaan dibandingkan terhadap

RSD yang dihitung dari persamaan terompet HORWITZ
akan diperoleh HORWITZ RATIO atau HORRAT:

HORRAT = SBRobs/SBRcalc

• Jika nilai HORRAT <2 menandakan metode analisis

mempunyai presisi yang memadai
Harga RSD yang dihitung dari
persamaan HORWITZ
Konsentrasi RSD Kurva Terompet HORWITZ
relatif (%)
100 (100%) 2,00
10-1 (10%) 2,83
10-2 (1%) 4,00
10-3 (0,1 %) 5,66
10-4 8,00
10-5 11,31
10-6 (ppm) 16,00
10-7 22,63
10-8 32,00
10-9 (ppb) 45,25
10-10 64,00
10-11 90,51
10-12 (ppt) 128,00
ROBUSTNESS (KETEGARAN METODE)
Ukuran kemampuan metode untuk tetap tak terpengaruh
dan bertahan terhadap pengaruh kecil, yang dilakukan
dengan sengaja dengan membuat variasi pada faktor
yang berpengaruh, tetapi memberikan indikasi
reliabilitas metode yang normal pada pengujian biasa.

Robustness sebenarnya harus dan dapat diuji pada saat

pengembangan metode.

Tahapan Uji :
a. Identifikasi faktor-faktor yang berpengaruh pada pengujian
b. Menentukan level dari faktor-faktor tersebut
c. Seleksi dan disain percobaan
d. Pelaksanaan percobaan
e. Perhitungan pengaruh faktor terhadap hasil analisis
(menggunakan statistika- teknik ANOVA)
TAHAPAN PELAKSANAAN VALIDASI
Dengan asumsi semua bahan yang digunakan dalam validasi/verifikasi
sudah siap, maka tahapan validasi metode dapat diuraikan sebagai
berikut :
1. Hari pertama, Pengujian linearitas menggunakan paling sedikit 6 level
konsentrasi (untuk bahan baku obat maupun sediaan farmasi).
Penetapan kadar analit dalam bahan baku obat maupun sediaan
farmasi.
2. Pada akhir hari 1: Penetapan kadar analit dalam 6 sampel kadar sama
yang homogen atau 3 sampel kadar berbeda (80, 100 dan 120%)
untuk penetapan akurasi dan presisi.
3. Hari ke 2 dan 3 : Pengujian presisi antar hari (inter day precision).
4. Hari ke 4: Penetapan batas kuantisasi dan batas deteksi serta
pengulangan penetapan presisi (bila diperlukan ) karena LOQ dapat
dihitung dari data uji linearitas melalui nilai Sy/x dan kemiringan garis
regresi (b)
5. Hari ke 5 : Evaluasi dan pembuatan dokumen/laporan validasi.
 Kriteria penerimaan pada validasi metode analisis kategori I

Parameter Kriteria penerimaan

validasi
1. Spesifikasi a. Pada kromatogram hasil penyuntikan larutan analit encer dan
(metode blangko/placebo tidak terdapat puncak lain yang menggangu
kromatografi) di waktu retensi analit
b. Puncak analit target terpisah dengan jelas dari puncak yang
lain
c. Puncak analit target murni berdasarkan detektor PDA pada
kondisi degradasi buatan

2. Linieritas Kriteria ini berlaku untuk minimal 6 titik konsentrasi antara

20-120% dari konsentrasi target :
a. Koefisien korelasi (r) tidak kurang dari 0,995
b. Persen “bias” dari y-intersept tidak kurang dari 5,0% dan tidak
lebih dari +5,0%
c. Vx0 < 2.0%

3. Rentang Keseksamaan, kecermatan harus sesuai pada kadar 80% sampai

120% kadar sampel
Parameter Validasi Kriteria Penerimaan

4. Kecermatan Rata-rata rekoveri masing-masing analit harus tidak kurang dari 98%
(akurasi) dan tidak lebih dari 102,0% untuk tiga kali penetapan pada kadar
analit 80, 100 dan 120% dari kadar target
5. a.Presisi Simpangan baku relatif (SBR) dari enam kali penetapan/penyuntikan
b. Presisi antara atau dari 9 kali penetapan (3 kali dari 3 konsentrasi) tidak lebih dari
(Intermediate 2%
precision) Simpangan baku relatif dari penetapan oleh dua analit, dua instrumen
atau 2 hari yang berbeda tidak lebih dari 2 %
6. Stabilitas analit a. Hasil penetapan kadar dari sampel yang disiapkan tidak berubah
lebih dari 2% pada periode waktu yang ditetapkan
b. Hasil penetapan kadar dari larutan baku kerja tidak berubah lebih
dari 2% pada perode waktu yang ditetapkan
7. Ketegaran metode Kriteriakesesuaian sistem harus dipenuhi untuk variasi percobaan
(Robustness) berikut :
- Komponen organik dalam fase gerak +5%

- konsentrasi pereaksi pasangan ion + 10%

- pH fase gerak +0,1 unit pH, laju alir + 10%, detektor + 2 nm, suhu
kolom + 5%
 Pustaka
1. Satiadarma K., et al., Asas pengembangan prosedur analisis,
Cet.1, Airlangga University Press, 2004.
2. Swartz ME and Krull IS., Analytical method development and
validation, Marcel Dekker Inc., 1997
3. Riley CM and Rosanske TW., Development and Validation of
Analytical Methods, Pergamon, 1996
4. Burges C., Valid analytical methods and procdures, Royal Society
of Chemistry,
5. Ermer J and Miller JH McB., Method validation in Pharmaceutical
Analysis., Wiley-VCH, 2005
6. Miller JC and Miller JN., Statistics for analytical chemistry, 3rd ed.,
Ellis Horwood PTR Prentice Hall, 1994
7. Ahuja S and Dong MW., Handbook of pharmaceutical analysis by
HPLC, Elsevier Inc., 2005
8. Kazakevich Y and Lobrutto R., HPLC for pharmaceutical scientists.,
Wiley- Interscience, 2007
9. Chan CC, Lam H, Lee YC and Zhang XM, . Analytical Method
Validation and Instrument Performance Verification, Willey- Inter
Science, New Jersey, 2004.
 Terima kasih
atas perhatian saudara