VALIDASI METODE ANALISIS

METODE PENGUJIAN MUTU SEDIAAN FARMASI

1. Pengembangan dan validasi metode analisis sangat berperan sekali dalam

penemuan (discovery), pengembangan (development) dan manufaktur
(manufacture) produk farmasi. Metode analitik yang dihasilkan dari proses
tersebut digunakan oleh laboratorium pengawasan mutu (quality control)
untuk menguji dan menjamin identitas, kemurnian, kadar atau potensi dan
performa produk farmasi sesuai dengan spesifikasi yang telah ditetapkan

2. Untuk menjamin pemenuhan standar mutu, keamanan dan khasiat

sediaan farmasi, beberapa negara termasuk Indonesia telah menerbitkan
suatu kompendia atau farmakope yang mencantumkan metode pengujian
resmi untuk sediaan obat yang dipasarkan/beredar di negara masing-
masing.

3. Metode pengujian yang terdapat dalam Farmakope adalah resmi harus

digunakan oleh semua industri yang memproduksi obat tersebut. Para
pengguna metode penguji an Farmakope harus melakukan pembuktian
(verifikasi) kesesuain metode itu pada kondisi penggunaan di laboratorium
pengujiannya (FI IV, UU 23 Kesehatan dan PP 72-1998)
Pharmaceutical Quality by Design
Unsur PQbD

• Menetapkan Profil dari target mutu produk

(spesifikasi)
• Mendesain dan mengembangkan proses
manufaktur/pembuatan dan produk jadi.
• Mengidentifikasi titik kritis dari sifat mutu,
proses, dan sumber keragaman.
• Pengendalian proses manufaktur untuk
menghasilkan produk bermutu setiap saat.
Perbedaan antara teknik, metode dan prosedur analisis
Proses validasi

. Validasi adalah suatu proses yang dilakukan sekurang-kurangnya empat

tahapan berikut :
A .Validasi perangkat keras
b. Validasi perangkat lunak
c. Validasi metode
d. Uji Kesesuaian sistem

(4) Validasi
(1) Perangkat metode
keras

VALIDASI
(3) Kesesuaian
sistem
(2) Perangkat
lunak
Proses diawali dengan menggunakan perangkat dan sistem yang diakualifikasi.
Validasi metode dilakukan dengan menggunakan sistem yang sudah
dikualifikasi dan pengujian kesesuaian sistem. Masing-masing tahap sangat
menentukan bagi keberhasilan proses validasi
Validasi metode
Farmakope dan GMP mensyaratkan bahwa metode pengujian yang
digunakan untuk menetapkan kualitas produk farmasi dan
pemenuhan persyaratan spesifikasi, harus sudah dibuktikan
kesesuaiannya terhadap akurasi baku dan reliabilitas yang telah
ditetapkan (sudah divalidasi dulu).

Para pengguna metode pengujian yang terdapat dalam kompendia

(farmakope dan kodeks) tidak disyaratkan untuk memvalidasi tetapi
diwajibkan untuk memverifikasi kesesuaian metode itu pada kondisi
penggunaan.

Validasi metode analisis adalah proses yang dilakukan dengan

kajian di laboratorium yang membuktikan bahwa karakteristik
kinerja metode analisis telah memenuhi persyaratan sesuai dengan
tujuan pengunaannya.

Karakter kinerja metode analisis dinyatakan sebagai parameter

analisis
Perlunya validasi metode/prosedur
analisis
Validasi metode wajib dilakukan di industri
dengan berbagai alasan antara lain :
1. Menjamin mutu dan pencapaian tingkat mutu
tertentu
2. Menjamin mutu produk yang dapat diterima oleh
suatu badan internasional
3. Untuk memenuhi persyaratan akreditasi ISO 17025
4. Untuk memenuhi persyaratan pendaftaran obat jadi
dan sediaan perbekalan rumah tangga
5. Untuk memenuhi persyaratan metode yang
digunakan pada uji profisiensi
 Parameter analisis yang digunakan dalam validasi metode analisis

USP ICH
(UnitedStatesPharmacopeia (InternationalConferenceon
Harmonization)
1.Presisi(keseksamaan)
2.Akurasi(kecermatan) 1.Presisi
3.Batasdeteksi 2.Akurasi
4.Bataskuantisasi 3.Batasdeteksi
5.Spesifisitas(kekhasan) 4.Bataskuantisasi
6.Linieritas 5.Spesifitas
7.Rentang 6.Linieritas
7.Rentang
8.Robustness
9.Kesesuaiansistem

Asumsi yang digunakan pada validasi metode menurut USP

a. Spesifisitas telah dibuktikan pada saat pengembangan dan optimasi
metode atau dapat diuji selama berlangsungnya proses validasi
b. Metode harus sudah dioptimasi dan uji “Robustness” telah dilakukan
pada saat pengembangan metode
c. Pengolahan data dilakukan secara statistik untuk evaluasi dan
pengambilan keputusan
 Presisi

Akurasi Rentang
Linieritas Batas deteksi dan
kuantisasi
Spesifisitas Ketegaran

Calon met ode analisis

Metode telah divalidasi/verifikasi

Prosedur pengawasan mutu

 Strategi Validasi Metode Analisis
1. Buatlah protokol validasi atau prosedur operasional validasi
metode
2. Nyatakan dengan jelas tujuan dan ruang lingkup dari
metode yang akan divalidasi
3. Tentukan parameter kinerja metode dan kriteria
penerimaan untuk masing-masing parameter
4. Buat rencana percobaan validasi
5. Verifikasi dan kalibrasi semua peralatan dan instrumen
6. Siapkan semua bahan seperti pereaksi, pelarut dan bahan
acuan standar (BPFI, CRM, SRM), matriks dll.
7. Lakukan percobaan validasi sebagian atau lengkap secara
internal ataupun eksternal
8. Buat SOP pelaksanaan validasi metode untuk kegiatan
pengujian rutin
9. Buat kriteria untuk revalidasi
10. Buat laporan dan dokumentasi percobaan validasi dan
hasilnya
Panduan validasi metode analisis

Badan Judulpanduan Tahunterbit

ICH a.ICHQ2A:Textonvalidationofanalytical 1994
Procedure 1995
b.ICHQ2BValidationofanalytical
proceduresmethodology
CDER a.Reviewerguidancevalidationof
chromatographicmethods
b.Submittingsampleandanalyticaldatafor 1994
methodvalidation 1987
c.Analyticalprocedureandmethodvalidation 2000
forhumanstudies 1999
d.Bioanalyticalmethodvalidationforhuman
studies
USP28 Validationofcompendialmethod 2005
Tahapan validasi metode

1, Tahap persiapan
• Kalibrasi instrumen dan alat-alat gelas
• Penyiapan bahan acuan baku (CRM, SRM, BPFI) dan
matriks sediaan (placebo)
• Uji kesesuaian sistem untuk metode kromatografi
2, Tahap validasi
• Spesifisitas
• Linieritas dan rentang
• Batas deteksi
• Batas kuantisasi
• Akurasi
• Presisi
 Kategori metode analisis
Kategori I
Metode analisis untuk penetapan kadar komponen utama
dalam bahan baku obat atau bahan aktif (termasuk
pengawet) dalam produk farmasi
Kategori II
Metode analisis untuk penetapan cemaran dalam bahan
baku obat atau hasil degradasi dalam produk farmasi.
Metode ini terdiri dari penetapan kuantitatif dan uji batas
Kategori III
Metode analisis untuk penetapan karakteristik sediaan
(disolusi, pelepasan obat, dll)
Kategori IV
Metode analisis untuk identifikasi
SPESIFISITAS
Kemampuan untuk menguji secara tegas analit yang dimaksud
dengan adanya komponen lain atau yang diperkirakan ada
seperti pengotor, hasil degradasi dan komponen matriks. Jika
spesifisitas metode tidak ada atau kurang baik maka metode
dapat dilengkapi dengan prosedur analisis pendukung yang
memadai seperti pemisahan : ekstraksi, destilasi, dll

Pengujian
a. Untuk identifikasi
Metode harus mampu menyeleksi dan mengidentifikasi
senyawa-senyawa yang ada dalam sampel yang berkaitan
dengan struktur molekulnya. Dapat dibuktikan dengan hasil positif
(atau dibandingkan dengan bahan acuan standar yang
diketahui) dari sampel yang mengandung analit dan dengan hasil
negatif dari sampel yang tidak mengandung analit.
b. Untuk penetapan cemaran
Dilakukan dengan menguji sampel yang ditambahkan
sejumlah tertentu cemaran atau hasil urai dan terlihat dengan
nyata cemaran itu dapat ditetapkan secara akurat dan presisi
yang memadai
c. Untuk penetapan kadar
Dinyatakan dengan jelas bahwa prosedur tidak dipengaruhi
oleh adanya cemaran atau matriks. Dalam praktek dapat
dilakukan dengan cara menguji sampel yang ditambahkan
sejumlah tertentu cemaran atau matriks dan terlihat nyata
bahwa prosedur tidak dipengaruhi oleh komponen asing
tersebut.

Jika cemaran tidak tersedia maka sampel yang diuji harus

diperlakukan sebelumnya dengan menyimpan sampel
dalam kondisi “stress” yang relevan (cahaya, panas,
kelembaban, hidrolisis asam/basa oksidasi). Dalam kasus
ini pengujian dilakukan bersama sampel utuh. Untuk
metode kromatografi, dipersyaratkan kromatogram harus
ditampilkan untuk melihat derajat selektivitasnya dan
kemurnian pucak (gunakan DAD dan MS detektor)
 Kondisi untuk membuktikan spesifisitas terhadap
cemaran hasil degradasi

Degradasiyang KondisiDegradasi
dimaksud

-Hidrolisisasam 24jamdalamHCl1N
-Hidrolisisbasa 24jamdalamNaOH1N
-Oksidasi 24jamdalamlarutanH2O210%
o
-Pemanasan 24jamdalamoven105C
-Fotodegradasi 1jamdisinarilampuUV(200–300nm)
-Kelembaban 24jamdalamclimaticchamberkelembaban86%

Ukuran

1. Koefisien selektivitas (mA/mB)

2. Resolusi (Rs > 1,5
3. Derajat “BIAS”
LINIERITAS

Kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang secara langsung atau

melalui transpormasi matematik yang jelas, proporsional (sepadan)
terhadap konsentrasi analit dalam sampel dan dalam rentang
konsentrasi yang digunakan

Pengujian
Menyiapkan larutan analit sebanyak minimal 5 konsentrasi
dengan rentang konsentrasi 20 - 120% dari konsentrasi aktual
Mengukur respon instrumen ke lima larutan tersebut, masing-
masing paling sedikit tiga kali pengukuran
Buat kurva antara respon instrumen terhadap konsentrasi analit
dan hitung persamaan matematik yang memadai (persamaan
garis regresi linier atau regresi kuadrat)
Hitung derajat linieritas melalui
- koefisien korelasi
- % Y-intercept
- Vxo
- faktor respon
 Respon alat Kurva kalibrasi digunakan sebagai bukti linieritas metode

●
●

●
●

konsentrasi
A B C D

a. Y = bx + a (dapat dihitung dengan kalkulator)

b = kemiringan garis regresi
a = perpotongan garis dengan sumbu Y (dapat dihitung dengan kalkulator)
b. r = koefisien korelasi

r=
∑(x i − x)(y i− y)
1/2
{(xi − x)2(y1 − y)2}1/2
C Sy/x = simpangan baku residu dari regresi linier = ⎢ ∑⎡y − y ˆ )
i i 2 ⎤⎥
⎢⎣ n−2 ⎥
⎦
d. Vxo = koefisien variansi regresi Sy/x
Vxo = ⋅100%
bx
 Persamaan regresi kuadratik
a. Y = mx2 + nx + b
dimana y = respon instrumen, x = konsentrasi analit, n,m,b = fungsi kuadratik
2 2
∑ y − b.
b. ∑
S y/x
yi − mi∑ (xi − yi) − n∑ (xi
=
n−3
.yi)
c.
E = m+2nx
Sy/x
d. Vxo = ⋅100%
E.x

Parameter Vxo inilah yang dijadikan dasar untuk pemilihan kurva kalibrasi
menggunakan regresi linier atau regresi kuadratik dengan memilih Vxo yang paling
mendekati 2%
Kriteria penerimaan linieritas dan rentang

Uji Level Rentang Kriteriapenerima

Penetapankadar 5 50-150% R>0,999
%y-intercept<2,0%
Vxo<2,0

Disolusi 5-8 10–150% R>0,99

%yintercept<5,0%
Vxo<5,0
Cemaran 5 LOQ-2% R>0,98
Vxo<5,0%
Cleaning 5 LOQ–20kaliLOQ R>0,98
Vxo<5,0%

*Handbook of Pharmaceutical by HPLC

RENTANG
Interval (batas) antara batas terendah dan batas tertinggi konsentrasi analit
yang telah dibuktikan dengan hasil presisi, akurasi dan linieritas yang dapat
diterima
Rentang metode diuji dengan melakukan verifikasi yang menghasilkan
data yang memperlihatkan presisi, akurasi dan linieritas yang dapat
diterima, baik pada konsentrasi terendah dan tertinggi maupun pada
konsentrasi lain dalam rentang sesuai dengan tujuan metode analisis

Rentang dinamik
Respon

*
*
*
*

Batas terrebdah Batas tertinggi

konsentrasi
Hubungan faktor respon terhadap
rentang linier
 BATAS DETEKSI DAN BATAS KUANTISASI
a. Batas deteksi (BD)
Konsentrasi terendah analit dalam sampel yang masih dapat
terdeteksi, tapi tidak perlu ditetapkan secara kuantitatif dalam
kondisi percobaan yang telah dinyatakan

Pengujian
1. Untuk metode non instrumen, batas deteksi ditetapkan dengan
melakukan anlalisis sampel yang mengandung analit dalam
kadar yang diketahui dan menentukan batas terendah kadar
analit yang dapat dideteksi secara radikal
2. Untuk metode instrumen, batas deteksi dinyatakan sebagai
konsentrasi analit pada saat ratio signal-noise 3 : 1 (S/N = 3)
atau mengukur besarnya respon instrumen dari 20 larutan
blangko dan menghitung simpangan bakunya. Batas deteksi
merupakan hasil perkalian simpangan baku blangko dengan
suatu faktor (3,3/b), dimana b = kemiringan garis regresi
linier.
Perhitungan
- BD = Konsentrasi larutan pada S/N = 3
- BD = 3,3 (SD/b) = 3,3 (Sy/x )/b
dimana SD = simpangan baku blangko (n = 20)
b = kemiringan garis regresi (Y = bx + a)

Catatan
SD dapat dihitung dengan cara menghitung :
1. Simpangan baku blangko
2. Simpangan baku residual garis regresi (Sy/x)
3. Simpangan baku perpotongan garis dengan sumbu Y
(Sa)
b. Batas kuantisasi (BK)
Suatu karakteristik metode penetapan kadar senyawa untuk kadar
rendah dalam matriks sampel seperti cemaran dalam bahan baku
obat dan hasil degradasi dalam sediaan jadi farmasi.

Batas kuantisasi (BK) adalah konsentrasi terrendah analit dalam

sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang
diterima dalam kondisi percobaan yang ditetapkan. BD dan BK
dinyatakan dalam satuan konsentrasi

Pengujian
1. Untuk metode non isntrumental, umumnya ditentukan dengan
melakukan analisis sampel yang mengandung analit dalam
jumlah yang diketahui lalu menetapkan kadar terendah analit
yang dapat dideteksi dengan presisi dan akurasi yang dapat
diterima
2. untuk metode instrumental, umumnya dengan mengukur
besarnya respon latar belakang analisis dengan cara
menganalisis sejumlah larutan blangko sampel dan
menghitung simpangan bakunya. Simpangan baku dikalikan
faktor (10/b) merupakan batas kuantisasi
Untuk pengukuran respon instrumen yang memberikan
latar belakang derau (noise), maka batas kuantisasi
adalah konsentrasi analit dalam larutan di mana ratio
signal-noise S/N =10.

Perhitungan
- BK = C pada S/N = 10
- BK = 10 (SD/b) = 10 (Sy/x)/b)

dimana b = kemiringan garis regresi,

SD = simpangan baku blangko
Sy/x = simpangan baku residual garis regresi
Batas kuantisasi adalah konsentrasi yang menunjukkan
simpangan baku relatif 20%
AKURASI (KECERMATAN)
Akurasi adalah tingkat/derjat kedekatan hasil pengujian metode
yang sedang divalidasi dengan nilai yang sebenarnya atau nilai
yang dinyatakan benar

Pengujian
Akurasi ditentukan dengan 4 cara sebagai persen perolehan kembali
(recovery)
a. Analisis kadar analit dengan metode yang divalidasi
terhadap sampel yang telah diketahui kadarnya.
Sampel yang digunakan adalah sampel acuan baku yang
dikeluarkan badan resmi (NIST, dll.)
b. Analisis kadar analit yang ditambahkan ke dalam
matriks sampel yang dianalisis (spiked method)
c. Jika matriks dan eksipien tidak tersedia, maka akurasi
dnyatakan sebagai persen perolehan kembali kadar analit
yang ditambahlkan pada produk jadi yang sudah
mengandung analit (standar addition method)
d. Membandingkan hasil analisis analit dengan metode yang
divalidasi terhadap hasil dengan metode baku (cara grafik)
 Kriteria penerimaan akurasi

Jeniwsuji Level Rentang Kriteria

konsentrasi
Penetapankadar 3level,dengan3kali 70%,100%,130% +2%
bahanbakuatau pengujian (80%,100%,120%) (98,0–102,0%)
sediaanjadi rata-ratauntuk
setiapsampel
Disolusi 3leveldengan3kali 20–35% +5%
pengujian 50–80% (95,0–105,0%)
100–130% rata-ratauntuk
setiapsampel
Cemaran 1leveldengan3kali LOQ–1%(darikadar +20,0%
pengujian analit) (80,0–120,0%)
rata-ratauntuk
setiapsampel
Cleaning 3leveldengan3kali LOQ–20kaliLOQ +50,0%
pengujian (50,0–150,0%)
rata-ratauntuk
setiapsampel

* Handbook of Pharmaceutical analysis by HPLC

Perhitungan

1. Spiked placebo recovery

% Rec (akurasi) = Ch/Cs x 100%

Ch = kadar analit yang dihitung dari metode yang divalidasi,
Cs = kadar analit teoritis

2. Standard addition method

Ch = {(R2 – R1)/R1}x C

% Rec = {Ch/Ca} x 100

Ch = Analit baku (SRM) yang ditambahkan pada produk jadi, C = kadar

analit dalam sampel produk jadi, R2, R1 = respon R1 oleh sampel produk
jadi R2 oleh sampel yang telah ditambah analit baku, Ca = kadar analit
yang sebenarnya ditambahkan
 3. Multiple Standard Addition
No. Sampel Penambah Kadar Kadar %Recovery
anbaku temua sebenarny (x100)
n a
S A - -
o
S A B=A-A B/B
1 1
- 1 11 1
2 S B A C=A-A C/C
3 C 2 12 1
2
4 S D A D=A-A D/D
3 13 1
5 3 E
S A E=A-A E/E
6 4
F 4 14 1

S A F=A-A F/F
5 15 1
5

4. Cara grafik
Metode baku

●
● Persamaan garis regresi linier
● Y = A x (r=1,00)
●
Jika A = 1 maka % Rec. = 100%
● A = 0,99 maka %Rec. = 99,0%

Hasil dengan metode yang divalidasi

PRESISI (KESEKSAMAAN)
Presisi adalah tingkat kesesuaian antara hasil analisis individual jika
prosedur dilakukan berulang kali terhadap sampel ganda atau
beberapa sampel yang homogen.

Presisi metode analisis dinyatakan sebagai simpangan baku relatif

(SBR) atau koefisien variasi (KV).

Presisi metode dinyatakan dengan tiga jenis penetapan yaitu

repeatabilitas (keterulangan), presisi antara dan reprodusibilitas
(ketertiruan)

a. Repeatabilitas (keterulangan)
Keterulangan adalah kemampuan metode untuk memberikan
hasil analisis yang sama untuk beberapa sampel yang kadarnya
sama. Penetapan dilakukan oleh satu orang analis pada
waktu tertentu terhadap beberapa sampel yang sama.
Keterulangan diukur terhadap 6 jenis sampel dengan
konsentrasi sama 100% dari konsentrasi aktual atau 3 jenis
sampel dengan konsentrasi 80, 100, 120% dari konsentrasi
aktual yang diukur masing-masing tiga kali.
b. Presisi antara
Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode dimana sampel-
sampel diuji dan dibandingkan menggunakan tenaga analis
berbeda, perlatan berbeda atau hari berbeda (inter day
precision). Presisi antara tidak perlu, jika kajian reprodusibilitas
telah dilakukan.
Nama lain presisi antara adalah “Ruggedness”

c. Reprodusibilitas (ketertiruan)
Merupakan pengujian presisi yang terakhir dan tuntas.
Reprodusibilitas diuji dengan cara menyiapkan sampel yang
homogen dan stabil, lalu diuji oleh beberapa laboratorium (studi
kolaboratif). Hail ini akan memperlihatkan adanya galat acak yang
disebabkan oleh sampel dan laboratorium , serta galat
sistematik. Dihitung dengan ANOVA
 Kriteria penerimaan presisi
Repeatabilitasdanpresisiantara
Leveldan Kriteria
Pengujian Rentangkonsentrasi
Penetapan 3leveldengan3kali RSD<2,0%
kadar/keseragaman 70,100,130%atau
kandungan 6penetapanpada100%
Disolusi 12sampelkadarrendah RSD<20%
Cemaran 6replikatpadaLOQ RSD<20,0%

Cleaning 6replikatpada10LOQ RSD<20,0%

SD
RSD = ⋅ 100 %
x
2
∑ ( x i − x )
SD =
n − 1

x = ∑ x i

n
KURVA TEROMPET HORWITZ
Simpangan baku relatif (SBR atau RSD) akan meningkat dengan menurunnya
konsentrasi analit. HORWITZ melakukan kajian terhadap 3000 hasil analisis yang
diambil dari studi kolaboratif AOAC dan memberikan hasil sebagai berikut :

RSD = + 2(1-0,5 log C)

Dimana C adalah konsentrasi yang dinyatakan sebagai fraksi desimal

untuk kadar C = 100% maka fraksi = 100/100 = 1
RSD = + 2(1-0,5 log 1) = 2%

Hubungan RSD terhadap C digambarkan sebagai kurva berupa terompet. Oleh

karena itu kurva RSD vs C disebut kurva teromper dari HORWITZ

Jika nilai RSD dari percobaan dibandingkan terhadap RSD yang dihitung dari
persamaan terompet HORWITZ akan diperoleh HORWITZ RATIO atau HORRAT:

HORRAT = RSDobs/RSDcalc
HORRAT <2 menandakan metode analisis mempunyai presisi yang memadai
Harga RSD yang dihitung dari
persamaan HORWITZ
Konsentrasi RSD Kurva Terompet HORWITZ
relatif (%)
0
10(100%)
-1
10(10%)
-2
10(1%) 2,00
-3
10(0,1%) 2,83
-4 4,00
10 5,66
-5
8,00
10 11,31
-6
10(ppm) 16,00
-7 22,63
10 32,00
-8 45,25
10 64,00
-9
10(ppb) 90,51
-10 128,00
10
 ROBUSTNESS (KETEGARAN)
Ukuran kemampuan metode untuk tetap tak terpengaruh dan
bertahan terhadap pengaruh kecil, yang dilakukan dengan
sengaja dengan membuat variasi dalam faktor yang
berpengaruh, tetapi memberikan indikasi reliabilitas metode yang
normal pada pengujian biasa.
Robustness sebenarnya harus dan dapat diuji pada saat
pengembangan metode.

Tahapan Uji :
a. Identifikasi faktor-faktor yang berpengaruh pada pengujian
b. Menentukan level dari faktor-faktor tersebut
c. Seleksi dan disain percobaan
d. Pelaksanaan percobaan
e. Perhitungan pengaruh faktor terhadap hasil analisis
(menggunakan statistika)
Pengujian
Cara Plackett-Burman
Evaluasi pengaruh kondisi percobaan terhadap ketegaran metode

Kondisipercobaan
No
Percobaan A B C D E F G

1 - + + + - - +

2 + - + + + - -

3 - + - + + + -

4 - - + - + + +

5 + - - + - + +

6 + + - - + - +

7 + + + - - + -

8 - - - - - - -

Catatan : + = level tinggi, - = level rendah.

Pengaruh perubahan faktor dihitung dengan ANOVA
b. Cara OFAT (one factor at time)
Dalam hal ini perubahan faktor metode dibuat pada waktu tertentu.
Misalnya terdapat 6 faktor maka percobaan yang dilakukan adalah
jumlahnya 12
Pengujian Robustness metode analisis dengan cara OFAT

Percobaan Kondisi

o
1 Suhukolom+5C
2 o

3 Suhukolom-5C
4 Fasegerak+5%metanol
5 Fasegerak-5%metanol
6 Lajualir+0,2ml/mn
7 Lajualir–0,2ml/mn
8 pHfasegerak+0,2,unit
9 pHfasegerak-0,2unit
10 Dapar,konsentrasi+5mM
11 Dapar,konsentrasi-5mM
12 Detektor,panjanggelombang+5nm
Detektor,panjanggelombang-5nm

Catatan : Pengaruh faktor kondisi percobaan dihitung dengan ANOVA

TAHAPAN PELAKSANAAN VALIDASI
Tahapan validasi metode dapat diuraikan sebagai berikut :
1. Hari pertama, uji linieritas menggunakan paling sedikit 5 level
konsentrasi (untuk bahan baku obat maupun sediaan farmasi).
Penetapan kadar analit dalam bahan baku obat maupun sediaan
farmasi
2. Pada akhir hari 1, penetapan kadar analit dalam 6 sampel
kadar sama dan homogen atau 3 sampel kadar berbeda (80, 100
dan 120%) untuk penetapan akurasi dan presisi/keterulangan
3. Hari ke 2 dan 3. pengujian presisi antar hari (inter day
precision) dengan menggunakan kurva kalibrasi yang baru.
4. Penetapan batas kuantisasi dan batas deteksi serta pengulangan
penetapan presisi (bila diperlukan karena LOQ dapat dihitung
dari data uji linieritas, melalui Sy/x dan kemiringan garis regresi
(b)
5. Evaluasi dan pembuatan dokumen/laporan validasi
LAPORAN VALIDASI METODE
 Kriteria penerimaan pada validasi metode analisis kategori I
Parameter validasi
1. Spesifikasi
(metode kromatografi)
2. Linieritas
3. Rentang
4. Kecermatan (akurasi)
5. a. Keseksamaan
seketika (Presisi)
b. Keseksamaan antara
(Intermediate precision)
6. Stabilitas analit
7. Ketegaran metode
(Robutness)
Kriteria penerimaan
a. Pada kromatogram hasil penyuntikan larutan analit encer dan blangko/placebo tidak
terdapat puncak lain yang menggangu di waktu retensi analit
b. Puncak analit target terpisah dengan jelas dari puncak yang lain
c. Puncak analit target murni berdasarkan detektor PDA pada kondisi degradasi buatan
Kriteria ini berlaku untuk minimal 6 titik konsentrasi antara 20-120%
dari konsentrasi target :
a. Koefisien korelasi (r) tidak kurang dari 0,995
b. Persen “bias” dari y-intersept tidak kurang dari 5,0% dan tidak lebih dari +5,0%
Keseksamaan, kecermatan harus sesuai pada kadar 80% sampai 120% kadar sampel
Rata-rata rekoveri masing-masing analit harus tidak kurang dari 98% dan tidak lebih dari
102,0% untuk tiga kali penetapan pada kadar analit 80, 100 dan 120% dari kadar target
Simpangan baku relatif (SBR) dari enam kali penetapan/penyuntikan atau dari 9 kali
penetapan (3 kali dari 3 konsentrasi) tidak lebih dari 2%
Simpangan baku relatif dari penetapan oleh dua analit, dua instrumen atau 2 hari yang
berbeda tidak lebih dari 2 %
a. Hasil penetapan kadar dari sampel yang disiapkan tidak berubah lebih dari 2% pada
periode waktu yang ditetapkan
b. Hasil penetapan kadar dari larutan baku kerja tidak berubah lebih dari 2% pada perode
waktu yang ditetapkan
Kriteria kesesuaian sistem harus dipenuhi untuk variasi percobaan berikut :
- Komponen organik dalam fase gerak +5%
- konsentrasi pereaksi pasangan ion + 10%
- pH fase gerak +0,1 unit pH
- laju alir + 10%
- detektor + 2 nm
- suhu kolom + 5%