ARTIKEL PENGEMBANGAN OBAT

CRISPR_Cas9 ( Clustered Regularly  Interspaced  Short  Palindromic 

Repeats- Cas9)

Dosen Pengampu :
Dr. Ana Indrayati., M.Si

Disusun Oleh :
Cakka Kumara Vidya Dharma (242010514U)

PROGRAM STUDI PASCA SARJANA

S2 FARMASI MANAJEMEN
UNIVERSITAS SETIA BUDI
SURAKARTA 2020
 CRISPR_Cas9 ( Clustered Regularly  Interspaced  Short  Palindromic 
Repeats- Cas9)
Oleh: Cakka Kumara Vidya Dharma

I. Pendahuluan
CRISPR_Cas9 ( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Cas9) adalah bagian dari DNA berulang (repeats), yang ditemukan pada tahun 1987
dalam bakteri Echeria Coli, 20 tahun berikutnya 2007 ada pada bakteri dan archae
bakteri. Teknologi ini terkenal paling popular, lebih murah, lebih efisien dan lebih
praktis dalam memotong DNA faga dan plasmid. Metode CRISPR / Cas
digunakan untuk memproduksi organisme hasil rekayasa genetika, teknologi dalam
mengedit genom, yang bisa digunakan untuk mencegah berbagai penyakit (Garneau
et al., n.d.) (monogenic : hemophilia abenia bulan sabit, dan sistik fibrosis), (komplek
: kanker, kardiofaskuler, DM, HIV/AIDS, penyakit saraf dll)
II. Sistem kekebalan bakteri CRISPR / Cas membelah DNA fag dan plasmid
Interferensi DNA yang dimediasi CRISPR-Cas9 dalam kekebalan adaptif bakteri.
(a) Lokus CRISPR tipikal dalam tipe II CRISPR – Cas sistem ini terdiri dari serangkaian
urutan berulang (pengulangan, berlian coklat) diselingi oleh bentangan pendek
urutan yang tidak berulang (spacer, kotak berwarna), serta satu set gen (cas) terkait
CRISPR (panah berwarna). Sebelumnya cas operon adalah trans-aktivasi CRISPR RNA
(tracrRNA) gen, yang mengkodekan RNA noncoding unik dengan homologi untuk
urutan berulang. Setelah faga terinfeksi, spacer baru (hijau tua) yang berasal dari
elemen genetik invasif dimasukkan ke dalam susunan CRISPR dengan akuisisi mesin
(Cas1, Cas2, dan Csn2). Setelah terintegrasi, spacer baru akan ditranskripsikan
dengan semua spacer lainnya menjadi prekursor yang panjang. CRISPR RNA (pre-
crRNA) mengandung pengulangan (garis coklat) dan spacer (garis hijau tua, biru,
hijau muda, dan kuning). TracrRNA ditranskripsikan secara terpisah dan kemudian
diulangi ke pre-crRNA untuk pematangan crRNA dengan pembelahan RNase III.
Pemangkasan lebih lanjut 5 ujung crRNA (mata panah abu-abu) oleh nuklease yang
tidak diketahui mengurangi panjang urutan pemandu menjadi 20 nt. Selama
interferensi, struktur crRNA-tracrRNA yang matang melibatkan endonuklease Cas9
dan selanjutnya mengarahkannya untuk membelah DNA asing ,yang didalamnya
mengandung sekuens komplementer crRNA 20-nt yang mendahului sekuens PAM.
(b) Representasi skematis domain organisasi ortolog Cas9 perwakilan dari subtipe
yang berbeda. Tanda bintang menunjukkan residu kunci yang dilestarikan untuk Cas9
Aktivitas pembelahan DNA. Singkatan: Arg, heliks jembatan kaya arginin; crRNA,
CRISPR RNA; CTD, domain C-terminal; nt, nukleotida; NUC, lobus nuclease; PAM,
motif berdekatan protospacer; REC, lobus pengakuan; tracrRNA, trans-aktivasi
CRISPR RNA. (Jiang & Doudna, 2017)
III. Crispr – Cas9 Effector Complex Assembly
Untuk mencapai pengenalan dan pembelahan DNA spesifik lokasi, Cas9 harus
dirakit dengan pemandu RNA (crRNA-tracrRNA asli atau sgRNA) untuk membentuk
kompleks pengawasan DNA aktif. Urutan spacer 20-nt dari crRNA menganugerahkan
spesifisitas target DNA, dan tracrRNA memainkan peran penting dalam perekrutan
Cas9 (20). Eksperimen genetik dan biokimia telah ditentukan peran dari apa yang
disebut urutan benih dari nukleotida RNA dalam wilayah penjarak crRNA yang sangat
penting untuk spesifisitas target. Dalam sistem CRISPR tipe II, benih daerah telah
didefinisikan sebagai PAM-proksimal 10-12 nukleotida yang terletak di ujung 3 dari
20-nt. urutan spacer yang tidak sesuai pada wilayah benih dapat merusak atau
membatalkan pengikatan dan pembelahan targetDNA, sedangkan homologi dekat di
wilayah benih sering kali mengarah mengikat di luar target. (Jiang & Doudna, 2017)
IV. Protein Cas9 ortogonal
Menunjukkan kesamaan urutan terbatas dan panjang yang sangat bervariasi
(∼900–1.600 residu asam amino), selain dari domain nuclease HNH dan RuvC yang
dikonservasi itu diperlukan untuk pembelahan dsDNA Atas dasar arsitektur lokus
CRISPR – Cas dan Filogeni Cas9 yang dimediasi Cas9 pengenalan dan target
pengikatan dan pembelahan DNA, menjelaskan bagaimana Cas9 dapat memiliki
efisiensi dan spesifisitas tinggi yang menjadikannya alat pengeditan genom yang
hebat, studi terbaru menunjukkan bahwa aksesibilitas target DNA sebagian besar
dipengaruhi oleh struktur kromatin CRISPR-Cas9 yang ditransplantasikan secara
khusus mengenali target genom eukariotiknya pada konteks kromatin menggunakan
pendekatan sistematis yang memungkinkan peningkatan desain RNA yang diprediksi
secara akurat di luar target dari situs pengikatan atau pembelahan Cas9, studi
molekul tunggal pada pelepasan DNA target akan terus berkontribusi. (Jiang &
Doudna, 2017)
V. Cara Kerja Dari Crispr-Cas9
Sistem CRISPR / Cas bertindak dalam dua langkah: i) tahap adaptasi, di mana
spacer baru yang diturunkan dari DNA asing (proto-spacer) umumnya diperoleh di
akhir lokus CRISPR tahap interferensi, di mana Sistem CRISPR / Cas menargetkan baik
yang menyerang DNA atau RNA. mekanistik akuisisi spacer masih belum diketahui,
tetapi gambaran yang lebih jelas muncul untuk tahap interferensi, yang dimulai
dengan transkripsi lokus CRISPR dari sebuah promotor berada dalam urutan
pemimpin. Selanjutnya RNA dengan panjang penuh dibelah oleh protein atau
protein kompleks, menghasilkan CRISPR RNA (crRNA) pendek. Dalam Pyrococcus,
protein Cas menggunakan crRNA untuk menargetkan RNA asing dengan cara saling
melengkapi dengan cara berlabuh penguasa. Namun mekanisme in vivo dari plasmid
dan virus gangguan belum ditentukan. (Jiang & Doudna, 2017)
VI.Kombinasi CRISPR-Cas9 dan RNA pada HIV-1 DNA dan RNA
Resistensi Silang Desain reagen gRNA dan shRNA yang tumpang tindih dan
tidak tumpang tindih. Angka 1A merangkum mode aksi serangan RNAi dan CRISPR-
Cas9 pada RNA dan DNA HIV-1. Serangan RNAi menyerukan virus melarikan diri
melalui mutasi titik biasa yang dimediasi RT. Pembelahan DNA yang dimediasi
CRISPR-Cas9 memicu cepat perbaikan DNA yang dibantu NHEJ yang memfasilitasi
pelarian melalui indel atau substitusi nukleotida yang dimasukkan Pembelahan dan
perbaikan berulang, yang akan terjadi selama urutannya masih dikenali oleh Cas9
nuclease, hingga menyebabkan mutasi yang lebih parah yang akan menonaktifkan
virus secara permanen. Dengan menggunakan berbagai reagen gRNA dan shRNA
anti-HIV dalam penelitian ini . GRNA melihat DNA virus dalam mekanisme CRISPR-
Cas9. ShRNA yang menargetkan Nef (shNef) melihat RNA virus dalam mekanisme
RNAi. Serangan CRISPR-Cas9 ganda dianalisis tanpa dan dengan tumpang tindih
urutan target (gRNA yang menargetkan Gag3) (Zhao et al., 2017)
VII. Kesimpulan
Ada dua komponen utama dalam sistem CRISPR-Cas yaitu protein Cas dan
single guide RNA (sgRNA). Dimana, memiliki prinsip kerja yaitu; 1) sgRNA yang terdiri
dari sekuen crRNA yang spesifik menyasar DNA target dan tracrRNA yang
berinteraksi dengan Cas 9 protein. 2) Terbentuk ikatan komplek antara sgRNA
dengan pro mengandung aktivitas DNA endonuclease. 3) Ikatan komplek tersebut
akan menyebabkan dsDNA target terputus. 4) Situs yang terputus tersebut akan
diperbaiki oleh lewat jalur perbaikan DNA non atau penghapusan dari nukleotida
yang menyebabkan rusaknya fungsi gen.

Referensi:
Garneau, J. E., Dupuis, M.-ève, Villion, M., Romero, D. A., Magadán, A. H., &
Moineau, S. (n.d.). The CRISPR / Cas bacterial immune system cleaves phage
and plasmid DNA.

Jiang, F., & Doudna, J. A. (2017). CRISPR – Cas9 Structures and Mechanisms. 505–
531.

Zhao, N., Wang, G., Das, A. T., & Berkhout, B. (2017). Combinatorial CRISPR-Cas9 and
RNA interference attack on HIV-1 DNA and RNA can lead to cross-resistance.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 61(12), 1–10.
https://doi.org/10.1128/AAC.01486-17