TUGAS BIOLOGI MOLEKULER

GENOM EDITING (CRISP Cas9)

NAMA : A. ENDANG KUSUMA INTAN

NIM : P2500216031

FAKULTAS FARMASI
PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2016
CRISRP Cas9
Sejak penemuan DNA ganda helix, peneliti dan dokter telah merenungkan kemungkinan
membuat situs khusus perubahan genom sel dan organisme. Banyak dari awal pendekatan untuk apa
memiliki disebut sebagai editing genom mengandalkan prinsip pengakuan situs-spesifik urutan
DNA. Studi perbaikan DNA jalur alami pada bakteri dan ragi, serta mekanisme rekombinasi DNA,
mengungkapkan bahwa sel memiliki mesin endogen untuk memperbaiki untai ganda istirahat DNA
(DSBs) yang seharusnya dapat mematikan. Demikian, metode untuk memperkenalkan istirahat
tepat di DNA di situs di mana perubahan yang akan diperkenalkan diakui sebagai strategi berharga
bagi ditargetkanrekayasa genom. Awal pendekatan untuk seperti pembelahan DNA target
mengambil keuntungan dari pasangan basa DNA pengakuan oleh oligonukleotida atau molekul
kecil. Bangunan uraian asli dari formasi tiga helix oleh Rich dan rekan-rekan di akhir 1950-an,
oligonukleotida digabungkan dengan bahan kimia belahan dada atau silang reagen seperti
bleomycin dan psoralen yang terbukti berguna untuk spesifik lokasi modifikasi kromosom dalam
ragi dan sel mamalia. Metode lain untuk Pengakuan kimia urutan DNA, seperti
peptida asam nukleat (PNAS) dan poliamida, ditunjukkan ke mengaktifkan ditargetkan pengikatan
lokus kromosom yang bisa dimodifikasi jika agen pengakuan kimia itu digabungkan kebelahan
dada reagen seperti bleomycin.
Strategi lain yang bergantung pada asam nukleat dasar pasangan adalah penggunaan
intron diri splicing untuk mengubah urutan di DNA atau RNA tingkat. Meskipun pendekatan ini
tidak menyebabkan metode yang kuat, mereka mendemonstrasikan utilitas dasar pasangan untuk
genom spesifik lokasi modifikasi. Penggunaan intron diri splicing untuk genom editing juga
menyarankan kemungkinan menggunakan intron-dikodekan nucleases-homing endonucleases yang
mampu spesifik pembelahan DNA dan integrasi urutan intron dengan memasukkan urutan yang
diinginkan dalam intron pertama, peneliti bisa menggabungkan informasi genetik yang dipilih ke
genom di situs diakui oleh endonuklease homing. Pada sekitar waktu yang sama, laporan awal dari
DNA jari-dimediasi zinc mengikat menyebabkan penciptaan DNA modular protein pengakuan
bahwa, ketika digabungkan dengan urut-independen nuklease domain dari pembatasan enzim FokI,
bisa berfungsi sebagai sitespecificnuclease. Ketika dirancang untuk mengenaliurutan kromosom,
zinc finger seperti nucleases (ZFNs) yang ditemukan efektif menginduksi genom perubahan urutan
di Drosophila dan sel mamalia. meskipun ZFNs adalah reagen editing genom yang efektif untuk
beberapa eksperimen, mereka tidak banyak diadopsi karena dari kesulitan dalam merancang dan
memvalidasi protein tersebut untuk lokus DNA spesifik. Dengan demikian, lapangan diutamakan
untuk laporan pertama transkripsi aktivator-seperti (TAL) efektor, yang terjadi alami di bakteri
yang menginfeksi tanaman, memungkinkan penciptaan cepat FokIcoupledversi yang dapat
digunakan sama dengan ZFNs untuk situs-diarahkan editing genom. Seperti TAL efektor nucleases
(Talens) yang lebih mudah dari ZFNs untuk menghasilkan dan memvalidasi, menghasilkan
kegembiraan luas tentang kemungkinan editing genom lancar yang akan cepat dan murah. Tapi
kesulitan dari desain protein, sintesis, dan validasi tetap menjadi penghalang untuk adopsi ini
nucleases rekayasa untuk penggunaan rutin.
Di daerah paralel tetapi benar-benar terpisah dari penelitian, beberapa mikrobiologi dan
bioinformatika laboratorium di pertengahan 2000-an mulai menyelidiki CRISPRs (clustered teratur
diselingi mengulangi palindromic), yang telah dijelaskan pada tahun 1987 oleh peneliti Jepang
sebagai serangkaian mengulangi langsung singkat diselingi dengan urutan pendek dalam genom
Escherichia coli CRISPRs kemudian terdeteksi di berbagai bakteri dan archaea, dan prediksi dibuat
tentang peran kemungkinan mereka dalam DNA perbaikan atau regulasi gen (36, 37). Sebuah
wawasan kunci datang pada tahun 2005 dengan pengamatan bahwa banyak urutan spacer dalam
CRISPRs berasal dari plasmid dan asal virus. Bersama dengan temuan bahwa lokus CRISPR
ditranskripsi dan pengamatan bahwa cas (CRISPR terkait) gen menyandi protein dengan nuklease
diduga dan domain helikase, itu mengusulkan bahwa CRISPR-Cas adalah pertahanan adaptif sistem
yang mungkin menggunakan RNA antisense sebagai tanda tangan memori invasi masa lalu. Pada
tahun 2007, percobaan infeksi bakteri asam laktat Streptococcus thermophilus dengan fag litik
memberikan bukti eksperimental pertama CRISPRCas-dimediasi kekebalan adaptif. Temuan ini
menyebabkan ide bahwa sistem alam CRISPR-Cas yang ada pada bakteri berbudaya digunakan
dalam industri susu bisa dimanfaatkan untuk imunisasi terhadap fag-aplikasi pertama yang berhasil
CRISPRCas untuk tujuan bioteknologi. Di tahun 2008, dewasa CRISPR RNA (crRNAs)
menunjukkan berfungsi sebagai panduan dalam kompleks dengan protein Cas mengganggu
proliferasi virus di E. Coli. Pada tahun yang sama, DNA menargetkan aktivitas CRISPR-Cas sistem
telah dilaporkan dalam patogenStaphylococcus epidermidis. Pada tahun 2011, trans-mengaktifkan
crRNA (tracrRNA)-a RNA kecil yang trans-dikodekan hulu jenis II CRISPR-Cas lokus di
Streptococcus pyogenes-dilaporkan menjadi penting untuk crRNA pematangan oleh ribonuklease
III dan Cas9, dan aktivasi tracrRNA-dimediasi crRNA pematangan ditemukan memberikan
kekebalan urutan spesifik terhadap genom parasit. Pada tahun 2012 yang pyogenes S. CRISPR-
Cas9 protein ditunjukkan menjadi DNA endonuklease dual-RNA-dipandu yang menggunakan
tracrRNA yang: crRNA duplex (66) untuk mengarahkan DNA pembelahan. Cas9 menggunakan
HNH nya domain untuk membelah untai DNA yang komplementer dengan urutan 20-nukleotida
dari crRNA; yang RuvC-seperti domain dari Cas9 membelah DNA untai berlawanan untai
komplementer
Teknologi CRISPR untuk Genome Aktivasi dan Penindakan di Sel Mamalia
Gangguan CRISPR / aktivasi (CRISPRi / a) teknologi memberikan pendekatan yang
sederhana dan efisien untuk represi yang ditargetkan atau aktivasi ekspresi gen dalam genom
mamalia. Hal ini sangat fleksibel dan diprogram, menggunakan Cas9 (dCas9) protein nuklease-
kekurangan RNA-dipandu menyatu dengan transkripsi regulator untuk penargetan gen tertentu
untuk mempengaruhi regulasi mereka. Beberapa studi telah menunjukkan bagaimana Metode ini
adalah cara yang efektif untuk mencapai efisien dan spesifik represi transkripsi atau aktivasi
gen tunggal atau ganda. Berkelanjutan modulasi transkripsi dapat diperoleh dengan ekspresi stabil
komponen CRISPR, yang memungkinkan diarahkan pemprograman ulang dari nasib sel. Dasar-
dasar CRISPRi / teknologi untuk genom represi atau aktivasi. Target aktivasi genom atau represi
merupakan pendekatan yang penting untuk teknik yang rumit seluler fungsi, nasib sel pemrograman
ulang dan untuk pemodelan penyakit. Di masa lalu, interferensi RNA (RNAi) memiliki telah
digunakan sebagai metode utama untuk membungkam ekspresi gen dalam sel mamalia.
CRISPRi dan CRISPRa menggunakan bentuk katalitik aktif dari protein Cas9, disebut dCas9,
menyatu dengan represor transkripsi dan aktivator, masing-masing. Penargetan Cas9 ke genom
ditentukan oleh pemandu tunggal RNA (sgRNA) mengandung dirancang 20-nukleotida urutan
komplementer ke DNA target, yang berdekatan dengan motif DNA pendek, disebut motif
protospacer-berdekatan homolog berbeda Cas9 mengenali urutan PAM yang berbeda. Sebagai
contoh, Streptococcus pyogenes Cas9 mengakui NGG atau NAG, sedangkan Neisseria meningitides
Cas9 mengakui NNNNGATT. Berbekal pendekatan CRISPRi- dan CRISPR, peneliti sekarang
memiliki platform untuk sistematis menginterogasi ekspresi gen. Sistem CRISPR-Cas9
menyediakan platform yang fleksibel dan modular untuk merekrut berbeda fungsional efektor
domain pada dasarnya di mana saja dalam genom. Hal ini sebagian besar dicapai dengan
menggabungkan dCas9 ke domain efektor yang berbeda. Kadang-kadang, perekrutan beberapa
domain efektor diperlukan untuk optimal genom-peraturan efektivitas. Telah ditetapkan bahwa
protein Cas9 saja efisien dapat membungkam ekspresi gen pada bakteri dengan sgRNA dirancang
dengan baik. Namun, hanya represi sedang diamati menggunakan dCas9 sendirian di sel mamalia
 DAFTAR PUSTAKA
Artikel. Jennifer A. Doudna dan Emmanuelle Charpentier. 2014. The new frontier of genome
engineering with CRISPR-Cas9. Jennifer A. Doudna dan Emmanuelle Charpentier
Jurnal. Dan Dul dan Lei S.Qi. 2016. An Introduction to CRISPR Technology for Genome
Activation and Repression in Mammalian Cells
 Virus herpes menginfeksi sebagian besar populasi manusia dan dapat menyebabkan
morbiditas dan mortalitas yang signifikan. Herpes simplex virus (HSV) tipe 1 penyebab luka dingin
dan herpes simpleks keratitis, sedangkan HSV-2 bertanggung jawab untuk herpes genital.
cytomegalovirus manusia (HCMV) adalah penyebab virus yang paling umum dari cacat bawaan
dan bertanggung jawab untuk penyakit serius pada individu immuno-dikompromikan. virus
Epstein-Barr (EBV) dikaitkan dengan mononukleosis menular dan berbagai keganasan, termasuk
limfoma Burkitt, karsinoma nasofaring, penyakit Hodgkin, dan limfoma pasca transplantasi. Virus
herpes bertahan dalam inangnya mereka untuk hidup dengan membentuk infeksi laten yang
terganggu oleh peristiwa reaktivasi periodik selama replikasi terjadi. perawatan obat antivirus saat
ini menargetkan manifestasi klinis tahap produktif ini, tetapi mereka tidak efektif untuk
menghilangkan virus ini dari host yang terinfeksi. Di sini, kami berangkat untuk memerangi infeksi
virus herpes produktif dan laten dengan memanfaatkan CRISPR sistem / Cas9 untuk menargetkan
elemen genetik virus penting untuk kebugaran virus. Kami menunjukkan pencabutan efektif HCMV
dan HSV-1 replikasi dengan menargetkan gRNAs untuk gen virus penting. penargetan simultan
HSV-1 dengan beberapa gRNAs benar-benar dihapuskan produksi partikel menular dari sel
manusia. Menggunakan pendekatan yang sama, EBV dapat hampir sepenuhnya dibersihkan dari
sel-sel tumor manusia EBV-berubah terinfeksi secara laten
Virus herpes seperti HSV-1, HSV-2, HCMV dan EBV yang sering menjadi penyebab penyakit dan
mengobati infeksi virus herpes ini tetap menjadi tantangan utama. terapi saat ini terutama diarahkan
membatasi infeksi produktif dengan menargetkan replikasi virus melalui obat antivirus seperti
acyclovir analog guanosin dan gansiklovir. Meskipun senyawa ini efektif menghambat polimerase
DNA virus selama replikasi, mereka memiliki dampak terbatas pada tahap laten infeksi virus herpes
yang bergantung pada polimerase tuan rumah untuk pemeliharaan genom virus dalam membagi sel
[7]. Strategi untuk mempengaruhi tahap laten infeksi sering bergantung pada reaktivasi dari infeksi
laten dengan menggunakan agen kemoterapi dan penargetan berikutnya dari sel-sel ini dengan mis
gansiklovir [49]. Strategi tersebut tidak selalu efektif dan dapat mengakibatkan hilangnya sel target.
Meskipun pendekatan ini mungkin bermanfaat untuk membersihkan sel-sel kanker EBV-driven,
kasus lain meminta hemat dari sel yang terinfeksi, misalnya dalam HSV-1, HSV-2 dan neuron VZV
yang terinfeksi. Oleh karena itu, ada kebutuhan untuk strategi langsung dan ampuh untuk
membatasi infeksi virus herpes dengan secara khusus menargetkan genom virus atau pemeliharaan.
Disukai, pendekatan tersebut harus berdampak baik litik dan infeksi virus herpes laten. Memang,
saat ini, HSV-1 genom telah ditargetkan dengan menggunakan meganucleases [50, 51]. Di sini,
kami melakukan proof-of-konsep penelitian menunjukkan bahwa CRISPR / Cas9 sistem rekayasa
genom dapat digunakan secara efisien untuk membatasi atau menghilangkan tiga dari virus herpes
yang paling umum dari sel manusia: HSV-1, HCMV dan EBV.
EBV bergantung pada EBNA1 untuk pemeliharaan episom virus. EBNA1 adalah protein dipelajari
dengan baik yang konsisten dinyatakan dalam sel EBV yang terinfeksi, termasuk semua EBV
terkait keganasan [38, 52-54]. Memang, selektif penghambatan EBNA1 melalui Sirnas [55],
inhibitor kecil molekul [56, 57], atau bentuk dominan-negatif protein [58] merusak EBV latency
dan hasil pada hilangnya episomes EBV dari sel yang terinfeksi. Dalam penelitian ini, kami
menunjukkan bahwa CRISPR / sistem Cas9 memang bisa menargetkan EBNA1 urutan protein-
coding atau peraturan EBNA1 situs mengikat pada genom EBV, sebagai sarana untuk menghambat
EBV pemeliharaan episom. Kami menunjukkan bahwa CRISPR sistem / Cas9 dapat menargetkan
dan mengedit gen EBV dalam sel alami EBV-berubah dari limfoid dan asal epitel. Diperhitungkan
bahwa garis sel karsinoma lambung SNU719 membawa 800 genom EBV / sel [59], efisiensi
editing tinggi. Memang, penargetan gen EBNA1 penting menggunakan gRNAs tunggal dalam sel
Akata-BX1 mengakibatkan hilangnya% 50-60 dari EBV laten dari sel. Namun, sebagian dari sel-sel
masih berisi EBV, yang bisa berupa EBV diedit berat, atau EBV mutan yang telah menerima
CRISP / mutasi Cas9-dimediasi di kawasan target sementara tetap mempertahankan aktivitas
EBNA1 (misalnya oleh dalam penghapusan di-frame). Pengenalan berikutnya dari gRNA kedua
menargetkan wilayah yang berbeda pada gen EBNA1, bagaimanapun, lebih ditingkatkan
penghapusan untuk hingga 95% dari genom EBV. Kami berhipotesis bahwa pemberian simultan
dari beberapa anti-EBV gRNAs ke dalam sel yang terinfeksi secara laten akan lebih meningkatkan
destabilisasi episomes EBV dan dapat memfasilitasi pemberantasan lengkap virus. cukai ini bisa
mengakibatkan hilangnya tumorigenic, sel siklus-mempromosikan fungsi EBV-didorong, fitur anti-
apoptosis, dan fungsi anti-inflamasi produk gen EBV-dikodekan dan dengan demikian dapat
berfungsi sebagai strategi terapi baru untuk memerangi EBV terkait keganasan. Memang, sebuah
studi independen menunjukkan bahwa transfeksi sementara dari beberapa anti-EBV gRNAs
dibersihkan EBV dari subset kecil dari yang terinfeksi secara laten Raji B-sel, sehingga mendorong
penangkapan proliferasi pada sel-sel ini [29]. Pendekatan kami bergantung pada ekspresi stabil anti-
EBV gRNAs melalui vektor lentiviral dan menginduksi hilangnya hampir lengkap episomes EBV,
menunjukkan bahwa optimasi lebih lanjut dari pendekatan ini memungkinkan untuk penghapusan
lengkap dari EBV dari sel manusia.
CRISPR / Cas9 penargetan HCMV penting dan HSV-1 gen efisien dibatalkan replikasi virus dalam
sel manusia. Mekanisme perlindungan dengan CRISPR gRNAs kemungkinan tiga kali lipat.
Memperkenalkan istirahat dsDNA di genom virus dapat merusak kemasan dari genom virus utuh,
membatasi produksi partikel virus. Kedua, dsDNA memotong dalam suatu gen penting dapat
mengganggu produksi protein yang ditargetkan, dan karenanya mempengaruhi biologi replikasi
virus. Ketiga, setelah perbaikan CRISPR / Cas9 diinduksi dsDNA istirahat dengan mesin host 'non-
homolog akhir bergabung, situs target sering bermutasi, mengakibatkan pembentukan mutan virus
dengan fungsi protein (sering) terganggu. Dalam kasus terakhir, generasi partikel virus baru dapat
terhambat langsung, atau DNA bermutasi dapat benar dikemas menjadi partikel virus baru, tetapi
replikasi kemudian dihentikan di sel yang baru terinfeksi. Dalam ketiga kasus, replikasi virus akan
terganggu. Memang, untuk HSV-1 kita amati blok di replikasi virus ketika kita menargetkan gen
baik penting atau tidak penting. Hal ini menunjukkan bahwa dsDNA memotong dalam HSV-1
genom saja sudah cukup untuk mempengaruhi replikasi virus, mungkin karena partikel virus dirakit
kurang benar dihasilkan, sehingga menghalangi infeksi berikutnya sel naif. Dengan menargetkan
penting HSV-1 gen, kita mengamati penurunan meningkat dari HSV-1 replikasi. Di sini, efek ini
kemungkinan disebabkan oleh kombinasi dari genom destabilisasi dan gangguan ekspresi gen
penting
Hal ini menunjukkan bahwa dsDNA memotong dalam HSV-1 genom saja sudah cukup untuk
mempengaruhi replikasi virus, mungkin karena partikel virus dirakit kurang benar dihasilkan,
sehingga menghalangi infeksi berikutnya sel naif. Dengan menargetkan penting HSV-1 gen, kita
mengamati penurunan meningkat dari HSV-1 replikasi. Di sini, efek ini kemungkinan disebabkan
oleh kombinasi dari genom destabilisasi dan gangguan ekspresi gen penting. Efek terakhir ini lebih
ditingkatkan dengan penargetan simultan dari dua gen penting menggunakan dua gRNAs. Di sini,
genom virus dapat terfragmentasi, yang menambah potensi diamati untuk tunggal anti-HSV-1
gRNAs. Memang, ketika menargetkan dua lokasi di bagian linear tertentu DNA, sebagian besar
dapat dipotong dari manusia [17, 60], virus [23, 24, 29, 30, 61], dan terintegrasi genom HIV
dsDNA [32-36 ]. Menariknya, kita tidak mengamati penurunan replikasi virus bila menargetkan
tidak penting HCMV gen US7, US10, atau US11, sedangkan menargetkan gen penting lakukan.
Hasil ini tak terduga, dan mungkin disebabkan oleh perbedaan kinetika replikasi antara HCMV dan
HSV-1. Sejak HCMV adalah virus perlahan mereplikasi, perbaikan mesin DNA mungkin memiliki
waktu yang cukup untuk perbaikan lengkap dari genom virus dibelah terjadi. Sejak in vitro replikasi
dari HCMV mutan tidak terpengaruh oleh mutasi pada gen yang tidak penting, virus dapat
mereplikasi seefisien virus tipe liar. Namun, untuk virus cepat-replikasi seperti HSV-1, kecepatan
replikasi bisa melebihi waktu yang diperlukan untuk menyelesaikan istirahat perbaikan dsDNA.
Memang, nonhomolog akhir-bergabung (NHEJ) studi kinetik [62] menunjukkan bahwa 75% dari
dsDNA istirahat di MRC5 sel diperbaiki dalam jangka waktu dua jam, sedangkan perbaikan
lengkap membutuhkan sekitar 24 jam terjadi. Sejak HSV-1 memiliki siklus replikasi kurang dari 18
jam [63], adalah mungkin bahwa lambat NHEJ kinetika dampak HSV-1 lebih mendalam daripada
HCMV yang memiliki siklus replikasi 72 jam