Pengeditan genom - teknologi tepat waktu untuk tanaman

Suatu alat untuk mutagenesis yang aman dan spesifik lokasi telah lama dicari oleh ahli biokimia
tanaman. Munculnya baru-baru ini teknologi pengeditan genom Clinded Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats (CRISPR) menjawab kebutuhan ini. Dengan menggunakan teknologi ini, genom
selada baru-baru ini diedit tanpa menggunakan pengiriman DNA konvensional yang diperantarai
Agrobacterium. Karena metode ini tidak meninggalkan jejak DNA asing dalam genom tanaman, ia
berjanji untuk memajukan bidang bioteknologi tanaman untuk organisme rekayasa genetika (GMO)
tanpa beban proses de-regulasi yang mahal.

Pentingnya mutan dalam

penemuan gen

Fenotip yang terlihat dari hilangnya fungsi atau penguatan

of-function mutan memberikan petunjuk berharga untuk

fungsi gen yang menarik. Misalnya, sebuah

analisis satu set mutan kerdil pertumbuhan terhambat dari

model tanaman Arabidopsis thaliana mengungkapkan keduanya

jalur transduksi metabolik dan sinyal oleh

dimana hormon steroid tanaman, brassinosteroids

(BRs), tingkatkan pertumbuhan. Namun, dengan mutan

cacat pada beberapa langkah enzimatik sulit dipahami. Di

kasus seperti itu, mutagenesis spesifik urutan akan

menjadi pendekatan yang berguna untuk menganalisis fungsi gen;

Namun, berbeda dengan situasi pada tikus, ragi

dan Escherichia coli, rekombinasi homolog-

teknik mutagenesis berbasis tidak tersedia untuk

Arabidopsis. Dengan demikian, studi genetik di Arabidopsis

melibatkan mutagenesis acak, diikuti oleh

identifikasi mutan dengan cacat spesifik

gen yang menarik.

Dimediasi agrobakterium

mutagenesis penandaan gen

Feldmann dan rekannya menggunakan Agrobacterium-

mediated Transfer (T) -DNA mutagenesis insersional

untuk menandai gen secara acak di Arabidopsis. Inisial

koleksi mutakhir T-DNA Feldmann mengarah ke

penemuan sejumlah gen yang terlibat dalam berbagai

proses fisiologis dalam Arabidopsis1, seperti

sebagai AGAMOUS (yang berfungsi dalam organ bunga tekad), GLABRA1 (pengembangan rambut),

COP1 (pensinyalan cahaya), AUX1 (transport auksin)

dan HYPOCOTYL3 (pensinyalan phytochrome B). Untuk

tanggal, ratusan ribu mutan T-DNA miliki

telah dihasilkan dalam Arabidopsis, dan genomik

Urutan DNA yang mengapit tag T-DNA telah

diurutkan dalam upaya untuk memetakan penyisipan individu

peristiwa dalam genome2. Proyek bernilai jutaan dolar

menghasilkan mutan penyisipan T-DNA selama lebih dari 80%

~ 28.000 gen hadir dalam Arabidopsis2.

Meskipun ketersediaan komunitas luas

Populasi mutan T-DNA Arabidopsis dan luas

analisis genetik, lebih dari 20.000 gen tidak memilikinya

terkait fenotip terlihat3. Banyak gen Arabidopsis

ada sebagai salinan ganda dan secara fungsional berlebihan,

dan dengan demikian kehilangan fungsi salah satu dari gen-gen ini

tidak menghasilkan fenotipe yang terlihat. Contohnya,

244 cytochrome P450 (CYP) gen4 dan 694 F-box

gen protein telah dilaporkan di Arabidopsis5, the

mayoritas yang menunggu karakterisasi fungsional.

Satu pendekatan untuk menghasilkan fenotipe yang terlihat

gen yang secara fungsional berlebihan melibatkan penciptaan yang lebih tinggi

memesan mutan. Namun, ini memakan waktu dan

tidak selalu mungkin, terutama ketika gen

bunga terkait erat pada kromosom yang sama.

Mutagenesis yang ditargetkan untuk satu atau beberapa gen adalah

strategi elegan untuk menghasilkan mutan bagi ribuan orang

gen tanpa penyisipan T-DNA yang terkait, dan

mutan tingkat tinggi untuk fungsi yang berlebihan

gen. Sementara ini terkadang dapat dicapai oleh RNA

interferensi (RNAi), teknologi ini memiliki keterbatasan;

pengeditan genom menawarkan alternatif yang menjanjikan.

Gambar 1. Pengeditan genom berbasis protein Cas9 dalam sel tanaman. Protoplas (sel-sel yang tidak
memiliki dinding sel) dibuat dengan pengobatan dengan enzim pencerna dinding sel. Protein Cas9 dan
gRNA secara independen disiapkan dan dirakit secara in vitro sebelum dimasukkan ke dalam
protoplas. Protoplas dibagi setelah memulihkan dinding sel mereka. Membagi sel membentuk kalus
(massa sel tanaman yang tidak berdiferensiasi). Kalus independen yang berasal dari protoplas tunggal
diuji untuk keberhasilan penyuntingan genom oleh Polymerase Chain Reaction (PCR), Polymorphism
Panjang Pembatasan Fragmen Panjang (RFLP) dan sekuensing dalam. Seluruh tanaman diregenerasi
dari kalus yang mengandung mutasi.

Pengeditan genom spesifik situs pada tanaman dapat dikirim ke sekuens DNA spesifik. ZFN bisa

direkayasa untuk mengandung domain modular Zn-jari

Tiga jenis utama penyuntingan genom spesifik situs yang mengikat urutan DNA tertentu yang menarik.
Itu

teknik yang tersedia untuk tanaman, termasuk komponen pengikat DNA Zinc chimeric dari enzim
tersebut

Finger Nuclease (ZFN) 6, Aktivasi Transkripsi- terkait dengan domain endonuklease DNA FokI. Itu

Seperti Effector Nuclease (TALEN) 6 dan DNA sintetis CRISPR-Cas9 yang mengkode enzim yang
direkayasa

sistem nuclease7. ZFN, TALEN dan CRISPR-Cas9 dikirim ke sel tanaman melalui konvensional

masing-masing terdiri dari dua bagian fungsional, satu yang mengarahkan metode pengiriman gen,
seperti Agrobacterium- atau

enzim ke urutan DNA spesifik dalam genom, transformasi dimediasi bombardemen biolistik.

dan yang lainnya berfungsi sebagai endonuklease DNA. Demikian pula, TALEN menggunakan
seperangkat DNA modular

Enzim pengeditan genom ini membelah domain pengenalan target yang berasal dari patogen
tanaman

DNA menghasilkan double strand break (DSB). Ketika bakteri dari genus Xanthomonas, dan
masing-masing dari 34

domain pengulangan asam amino yang tidak homolog akhir bergabung (NHEJ) mengenali satu
pasangan basa

mengikat DSB, penghapusan kecil atau penyisipan DNA DNA. Set domain yang ditautkan bersama
untuk mengidentifikasi yang diinginkan
terjadi, yang sering mengganggu informasi genetik. urutan dapat menyatu dalam-frame dengan FokI
endonuklease

Di sisi lain, jika DNA homolog membentang untuk membentuk enzim restriksi spesifik-genom. Jadi,
ZFN

DSB hadir pada saat NHEJ, teknologi DNA dan TALEN ini melibatkan protein- wajib

dapat dimasukkan ke dalam genom. langkah rekayasa dan validasi empiris bahwa

Karena bagian ZFN dan TALEN yang mengarahkan protein rekombinan hanya berhasil membelah
target

enzim untuk urutan DNA spesifik terletak urutan, membuat pendekatan ini memakan waktu.

dalam protein, kedua enzim ini membutuhkan Sebaliknya, endonuklease yang dipandu CRISPR-Cas9

rekayasa sebelumnya dari urutan protein sehingga mereka (RGEN) diarahkan ke urutan DNA spesifik
bukan oleh protein tetapi oleh RNA, khususnya, RNA panduan molekul tunggal (gRNA) yang
panjangnya sekitar 100 nukleotida. Lebih lanjut, protein Cas9 memiliki dua subdomain nuklease
endogen, HNH dan RuvC, sehingga menghapuskan kebutuhan untuk penghubungan buatan dengan
FokI7.

Karena CRISPR-Cas9 RGEN ditargetkan ke DNA dalam suatu mekanisme yang melibatkan RNA
daripada protein, lebih mudah untuk merancang, mensintesis dan menggabungkan molekul
penargetan ke dalam Cas9 nuclease apoprotein. Munculnya CRISPR-Cas9 RGEN miliki merevolusi
bidang pengeditan genom; memang, pencarian Google menggunakan "CRISPR-Cas9" sebagai kata
kunci menghasilkan 48.000 hit pada April 2016. Mengingat bahwa teknologi ini pertama kali muncul
pada 2012, cepat menjadi teknik rutin. Sementara CRISPR-Cas9 pertama kali digunakan untuk
mengedit genom virus dan sel prokariotik, sekarang banyak digunakan dalam sel eukariotik, termasuk
manusia dan tanaman.

Gen yang mengkode komponen CRISPR-Cas9 telah berhasil diekspresikan secara stabil dan sementara
pada tanaman. Beberapa target dapat diedit secara bersamaan ketika beberapa gRNA diekspresikan
dalam satu sel. Mempertimbangkan bahwa gen redundan adalah umum dalam genom tanaman,
pengeditan genome multiplexed yang dimediasi CRISPR-Cas9 dapat menghasilkan mutan orde tinggi
dengan relatif mudah dibandingkan dengan metode persilangan konvensional.

Apakah pabrik direkayasa dengan GMIS CRISPR-Cas9?

Tanaman rekayasa genetika konvensional

dihasilkan dengan memasukkan DNA ke dalam sel atau kelompok

sel yang dapat menimbulkan atau diregenerasi menjadi

tanaman utuh. Namun, masing-masing komponen RGEN

dapat secara terpisah disiapkan dan dirakit secara in vitro

dan kemudian dimasukkan ke dalam protoplas selada

untuk mengedit genom, bukan langsung mengimpor

DNA plasmid yang mengkode protein struktural Cas9

dan gRNA8. Tanaman regenerasi yang berasal dari

sebuah protoplas rekayasa tunggal mewarisi mutasi

dalam mode Mendel. Selain itu, berbeda

ke sistem berbasis plasmid, DNA asing tidak

dimasukkan. Ketika Cas9 RGEN diberikan sebagai DNA,

DNA terfragmentasi dimasukkan ke dalam genom8.

Gambar 1 menggambarkan prosedur berbasis protein

pengeditan genom pada tanaman.

Munculnya pengeditan genom bebas DNA

pada tanaman menimbulkan pertanyaan apakah tanaman

seharusnya diedit secara genetik dengan teknologi ini

diklasifikasikan sebagai GMO. Departemen Amerika Serikat

Pertanian (USDA) Kesehatan Hewan dan Tumbuhan

Layanan Inspeksi (APHIS) menunjuk tanaman sebagai GM

jika diproduksi menggunakan patogen tanaman dan mengandung

gen asing9. Setelah tanaman secara genetik

dimodifikasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens dan

tanaman transgenik mengandung gen asing, seperti

penanda seleksi antibiotik, tanaman secara legal

ditetapkan sebagai GMO dan dikenai ketat

prosedur pengaturan sebelum komersialisasi.

Meskipun ada kelebihan teknologi GM, seperti

pengenalan cepat dari sifat-sifat novel, kecil dan menengah

perusahaan benih berukuran cenderung menghasilkan non-transgenik

benih, untuk menghindari biaya yang terlibat dalam memperoleh ‘de-

status regulasi GMO mereka 10. Karena itu, disana adalah minat dalam mengembangkan teknologi
baru untuk menghasilkan tanaman yang diedit secara genetika sedemikian rupa sehingga mereka
tidak dikategorikan sebagai GMO. Teknik pengeditan DNA yang baru dilaporkan yang didasarkan pada
metode transfeksi kimia konvensional dan bukan Agrobacterium dan tidak melibatkan DNA asing
menawarkan pendekatan alternatif untuk memproduksi tanaman yang diedit secara genetika yang
tidak secara legal akan ditetapkan sebagai GMO. Setelah diberikan penunjukan non-transgenik,
teknologi tersebut dapat mempercepat pengembangan benih yang diedit secara genetika yang
menimbulkan tanaman dengan sifat yang diinginkan, seperti peningkatan nilai gizi, ketahanan
terhadap penyakit, toleransi terhadap tekanan abiotik, arsitektur hemat energi, dan peningkatan
hasil.
Gambar 2 Tanaman selada pada generasi T1. Mutasi dihasilkan oleh genom bebas DNA

rekayasa dengan CRISPR-Cas9 pra-rakitan in vitro secara stabil diwariskan pada generasi T1.

Masalah paten

Selain peraturan ini, perang paten menunda penggunaan luas teknologi CRISPR-Cas9 (lihat see Siapa
yang memiliki pengeditan gen? Paten pada saat CRISPR PR26). Setidaknya tiga kantor yang mewakili
Broad Institute, Universitas California di Berkeley dan ToolGen, Inc. mengajukan aplikasi paten untuk
teknologi CRISPR-Cas9 dalam sistem eukariotik dengan Kantor Paten dan Merek Dagang Amerika
Serikat (USPTO). Pada Februari 2016, USPTO telah mengeluarkan paten dengan klaim CRISPR-Cas9 ke
Broad Institute, MIT dan kelompok-kelompok yang berafiliasi untuk mencakup penggunaan teknologi
dalam sel mamalia. Teknologi CRISPR-Cas9 adalah metode pengubah permainan yang dapat sangat
membantu para ilmuwan di dunia akademis dan industri menyelesaikan masalah kemanusiaan,
seperti kekurangan pangan, perlindungan lingkungan, dan perawatan farmakologis. Oleh karena itu,
resolusi cepat dari negosiasi lisensi dan pembentukan struktur biaya lisensi akan menjadi dorongan
luar biasa bagi para pemula yang bertujuan untuk menggunakan teknologi yang kuat ini untuk
membuat generasi produk bioproduk.

Sebuah laporan baru-baru ini bahwa jamur CRISPR yang diedit-gen tidak tunduk pada regulasi AS11
menandakan bahwa benih CRISPR di masa depan mungkin dibebaskan dari regulasi. Setelah masalah
paten diselesaikan, beragam CRISPR menghasilkan dengan kualitas yang diinginkan, seperti
peningkatan nilai gizi dan bebas pestisida, kemungkinan akan muncul di toko bahan makanan.