Tugas 1C Bioteknologi Pertanian

Problem Based Learning Perakitan Tanaman Transgenik

DISUSUN OLEH :
Alma Zahra Tunnisa 150510170097
Heryanto Simatupang 150510170154
Siti Sarah Maulika 150510170215

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS PADJAJARAN
SUMEDANG
2019
 1. Kenapa harus menggunakan teknik transfer gen untuk memperoleh biji
padi/beras yang mengandung beta karoten?
Jawab : Karena padi tidak mampu menghasilkan beta karoten dengan sendirinya.
Sehingga dilakukan penerapan teknologi transfer gen yang memungkinkan penyisipan
hanya gen-gen penting saja, sehingga sifat lain diharapkan tidak berubah. Pada
tanaman padi, secara garis besar ada dua teknik transfer gen yang telah berhasil
diterapkan, yaitu transfer gen secara langsung (misalnya dengan senyawa kimia
polyethylene glycol (PEG), alat elektroporator, atau penembak DNA), atau secara
tidak langsung dengan menggunakan bantuan bakteri tanah Agrobacterium
tumefaciens (Slamet-Loedin 1994).

2. Gen apa dan berasal dari mana saja yang diinsersikan ke dalam tanaman padi
tersebut?
Jawab : gen psy (sintase phytoene) dari dari tanaman daffodil (Narcissus
pseudonarcissus = bunga narsis/bakung), crtl dari tanah bakteri Erwina uredovora,
dan lyc (lycopene) gen adenilat. Disisipkan ke tanaman padi sehingga padi mampu
memproduksi beta karoten berwarna oranye kekuningan, yang kemudian disebut
sebagai golden rice.)

3. Dengan teknik transfer gen yang seperti apa, gen-gen asing tersebut bisa
disisipkan?
Jawab : rekayasa tanaman padi dengan teknik overekspresi gen yang bertanggung jawab
terhadap biosintesa beta-karoten dengan menggunakan promotor spesifik pada endosperma
padi, telah menghasilkan suatu padi transgenik yang dapat mensintesa beta-karoten yang
dikenal dengan nama Golden Rice, dengan bantuan vektor Agrobacterium tumefaciens.
Agrobacterium tumefaciens menginfeksi tanaman dan mengintroduksikan sebagian dari
plasmid-Ti (tumor inducing) yang disebut dengan T-DNA (transfer DNA) ke dalam genom
tanaman.

4. Bagaimanakah cara mengkontruksi gen betacarotene yang akan digunakan ?

Jawab :

Endosperma pada padi yang belum matang memang mampu mensintesis gerhanylgeranyl
difosfat (GGDP) akan tetapi secara alami padi tidak menghasilkan phytoene karena terjadi
penghambatan fungsi dari enzim phytoene synthase (PHY) dalam mengubah GGDP menjadi
phytoene . Meskipun demikian, penghambatan fungsi enzim tersebut bisa dihilangkan dengan
cara mengintroduksi gen PHY dari tanaman daffodil (bunga narsis/bakung : GenBank nomor
aksesi X78814) dan phytoene desaturase rial bacte-(crtI) yang berasal dari bakteri Erwinia
uredovora ( Nomor aksesi GenBank D90087) dengan menggunakan promoter spesifik untuk
endosperma. Selain itu, masih ada satu enzim lagi yang diperlukan untuk mengubah lycopene
menjadi beta-karoten yaitu lycopene cyclase (LYC) yang juga berasal dari tanaman daffodil.
Secara ringkas pembentukan gen betacarotene adalah sebagai berikut :
Melalui jalur biosintesa, GGDP akan diubah menjadi phytoene, diteruskan menjadi lycopene,
dan selanjutnya diubah lagi menjadi beta karoten.. Perubahan dari GGDP menjadi phytoene
dilaksanakan oleh enzim phytoene synthase yang disandi oleh gen PHY. Selanjutnya, gen crtl
mengkode enzim phytoene desaturase yang bertanggung jawab untuk mengubah phytoene
menjadi lycopene. Hanya likopena siklase lycopene cyclase yang tidak diintroduksi dari
sumber asing.

5. Plasmid apa yang digunakan?

jawab :

Terdapat 3 jenis plasmid yang digunakan yaitu pB19hpc (single transforman), pZPsC dan
pZLcyH (co-transforman).

Vektor pB19hpc menggabungkan urutan untuk PHY yang berasal dari daffodil dengan urutan
coding untuk phytoene desaturase rial bacte-(crtI) yang berasal dari bakteri Erwinia
uredovora yang ditempatkan di bawah kendali masing-masing glutelin spesifik (Gt1) dan
konstanta CaMV (kembang kol mosaik virus)35S. masing-masing promotor CDNA phytoene
synthase berisi kode 5-urutan untuk peptida transit fungsional, dan crtI genberisi urutan
peptida transit (tp) dari subunit kecil kacang polisco (11). Plester ini harus mengarahkan
pembentukan likopen dalam endosperma plastid, tempat pembentukan geranylgera- nyl-
difosfat.
Untuk menyelesaikan jalur biosintesis-karoten, dilakukan transformasi bersama dengan
vektor pZPsC dan pZLcyH. Vektor pZPsC membawa psy dan crtI, seperti pada pB19hpc
plasmid, tetapi tidak memilikipenanda yang dapat dipilih aphIV kaset ekspresi. Vektor
pZLcyH menyediakan lycopene -cyclase dari Narcissus pseudonarcissus (12) (nomor akses
Gen-Bank X98796) yang dikendalikan oleh promotor glutelin beras dan aphIV yang
gendikendalikan olehCaMV 35S promotorsebagai penanda yang dapat dipilih. Lycopene
-cyclase membawa transit peptide fungsional yang memungkinkan impor plastid (10).

6. Selectable marker gene apa yang digunakan?

Jawab :

Selectable marker gene yang digunakan dalam hal ini adalah sebuah penanda bernama aphIV.

7. Teknik insersi apa yang digunakan untuk memasukkan plasmid DNA ke dalam
tanaman?

Jawab :

Terdapat 3 teknik atau metode dalam menginsersi dna plasmid ke sel tanaman yairtu
diantaranya :

a. Metode senjata gen atau penembakan mikro-proyektil. Metode ini sering digunakan
pada spesies jagung dan padi. Menggunakan senjata yang dapat menembakkan mikro-
proyektil berkecepatan tinggi ke dalam sel tanaman. Mikro-proyektil tersebut akan
mengantarkan DNA untuk masuk ke dalam sel tanaman. Penggunaan senjata gen
 memberikan hasil yang bersih dan aman, meskipun ada kemungkinan terjadi
kerusakan sel selama penembakan berlangsung.

b. Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens. Diketahui

bahwa bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami
karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen
asing.Di dalam plasmid Ti terdapat gen yang menyandikan sifat virulensi untuk
menyebabkan penyakit tanaman tertentu. Gen asing yang ingin dimasukkan ke dalam
tanaman dapat disisipkan di dalam plasmid Ti. Setelah itu, A. tumefaciens secara
langsung dapat memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA)
tanaman. Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang
diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan.

c. Metode elektroporasi. Sel tanaman yang akan menerima gen asing harus mengalami
pelepasan dinding sel sampai menjadi protoplas (sel yang kehilangan dinding sel).
Selanjutnya sel diberi kejutan listrik dengan voltase tinggi untuk membuka pori-pori
membran sel tanaman sehingga DNA asing dapat masuk ke dalam sel dan bersatu
(terintegrasi) dengan DNA kromosom tanaman.Kemudian, dilakukan proses
pengembalian dinding sel tanaman.

Dari ketiga teknik tersebut, dalam jurnal yang kami jadikan literatur adalah
dengan bantuan mikroorganisme Agrobacterium, teknik ini merupakan teknik yang sering
digunakan karena dianggap mudah dan menggunakan mikroorganisme yang bermanfaat.
Digunakan Agrobacterium sebagai media transformasi untuk memperkenalkan seluruh
jalur bio-sintetik karoten ke dalam endosperma padi dalam upaya transformasi tunggal
dengan tiga vektor. Embrio padi belum matang yang belum dikultur (n 800) diinokulasi
dengan Agrobacterium LBA4404 / pB19hpc. Tanaman Hygromycin tahan(n 50)
dianalisis untuk kehadiran psy dan crtI gen(Gbr. 2). Pencernaan Meganuclease I – Sce I
merilis insersi 10 kb yang berisi kaset berapi aphIV, psy, dan crtI . Kpn I digunakan
untuk memperkirakan nomor salinan penyisipan. Semua sampel dianalisis membawa
transgen dan mengungkapkan sebagian besar sisipan tunggal. Embrio padi yang belum
menghasilkan (n 500) diinokulasi dengan campuran Agrobacterium LBA4404 / pZPsC
dan LBA4404 / pZLcyH. Tanaman yang ditransformasikan bersama diidentifikasi dengan
hibridisasi Selatan, dan keberadaan pZPsC dianalisis dengan pembatasan pencernaan.
Kehadiran kaset ekspresi pZLcyH ditentukan dengan menyelidik I-Sce I – dan Spe IDNA
genomik denganinternal –dispesifikasilcy fragmen. Dari 60 jalur regenerasi yang dipilih
secara acak, semuanya positif untuk lcy dan 12 pZPsC yang terkandung seperti yang
ditunjukkan oleh adanya fragmen yang diharapkan: 6,6 kb untukI-Sce I - psy dan crtI
yang kaset ekspresidiekspresikan dari pZPsC dan 9,5 kb untuk LCY dan aphIV gendari
pZCycH.

8. langkah/prosedur apa saja yang harus disiapkan untuk merakit tanaman transgenik?

 Pertama pemulia mencari dan mengidentifikasi gen yang diinginkan dan

menghasilkan sifat tertentu
  Gen yang diinginkan dapat diambil dari gen hewan, tanaman, cendawan, atau bakteri
 Setelah gen yang diinginkan didapatkan maka dilakukan perbanyakan gen atau yang
biasa disebut dengan istilah kloning gen
 Pada tahap kloning, DNA asing akan dimasukkan kedalam vektor kloning (agen
pembawa DNA), contohnya plasmid (DNA yang digunakan untuk transfer gen)
 Kemudian, vektor kloning akan dimasukan kedalam bakteri sehingga DNA dapat
diperbanyak seiring dengan pengembangbiakan bakteri tersebut
 Apabila gen yang diinginkan telah diperbanyak dalam jumlah yang cukup maka akan
dilakukan transfer gen asing tersebut kedalam sel tumbuhan yang berasal dari bagian
tertentu
 Transfer gen ini dapat dilakukan dengan beberapa metode, yaitu metode senjata gen,
metode transformasi DNA yang diperantarai bakteri sebagai vektor, dan elektroporasi

9. bagaimana cara menyeleksi tanaman pada tahap invitro dan tahap pertanaman di
lapangan?

Seleksi InVitro :
Seleksi in vitro merupakan salah satu metode keragaman somaklonal yang telah
banyak dimanfaatkan untuk meningkatkan keragaman genetik. Metode keragaman
somaklonal pertama kali dikemukakan oleh Larkin dan Scowcraft (1981), yaitu keragaman
genetik yang ditimbulkan dari sel somatik dan potensial digunakan dalam pemuliaan untuk
merakit varietas baru.
Teknik in vitro melalui variasi somaklonal dan perlakuan mutasi fisik seperti iradiasi
sinar gamma pada jaringan atau sekelompok sel (kalus) merupakan alternatif untuk
mendapatkan varian yang diinginkan. Melalui seleksi in vitro varian tersebut dapat
diseleksi untuk mendapatkan varian tanaman yang toleran terhadap kekeringan (Sutjahjo,
et. al., 2007).
Dalam hal ini, ada 3 hal penting yang perlu diperhatikan dalam seleksi in vitro. 
a. Pertama, sistem regenerasi pada sel atau kalus yang resisten hasil seleksi. 
b. Kedua, kemampuan sel/kalus untuk memelihara integritas genetik ketahanan pada
material yang diseleksi. 
c. Ketiga, perubahan genetik pada proses seleksi tidak hanya sekedar adaptasi fisiologis
saja (Chopra et al., 1989). Salah satu metode untuk seleksi cekaman kekeringan
secara in vitro yang digunakan adalah penggunaan senyawa osmotic stress seperti
polyethylen glycol (PEG).
Selain itu, kelebihan dari seleksi in vitro adalah tempat yang dibutuhkan lebih
sempit dan efektivitas seleksi lebih tinggi serta tidak dipengaruhi oleh musim.
Seleksi Lapangan :
A. Tanaman Menyerbuk Sendiri
1. Mass Selection / Seleksi massal
 Prosedur:

2. Pure line Selection / Seleksi Galur Murni

 Prosedur:
3. Pedigree Selection
 Prosedur:

4. Bulk Population Breeding

Prosedur:
5. Single Seed Descent

6. Back Cross ( Silang Balik )

Langkah-langkah umum dalam pemuliaan sifat dominan dengan metode

backcross.
 Langkah-langkah umum dalam pemuliaan sifat resesif dengan
metode backcross.

A. Tanaman Menyerbuk Sendiri

1. Seleksi Tongkol ke Baris (ear to row selection)

2. Seleksi Daur Ulang (recurrent selection)

a. Seleksi daur ulang fenotipe
 Prosedur
 b. Seleksi daur ulang daya gabung umum
c. Seleksi daur ualang resiprok

10. teknik molekuler apa yang digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa tanaman yang
kita peroleh itu benar-benar tanaman transgenic?

Dengan menggunakan teknik blotting yaitu teknik untuk menapis klona

bakteri. Dengan metode ini peneliti dapat mendeteksi sekuens nukleotida di dalam
sampel DNA yang kompleks.

1. Preparasi Fragmen Restriksi

Setiap sampel DNA dicampur dengan enzim restriksi yang sama. Digesti dari
setiap sampel menghasilkan campuran dari ribuan fragmen restriksi
2. Elektrofiresis Gel
Fragmen restriksi pada setiap sampel dipisahkan melalui elektroforesis,
membentuk pola pita yang khas
3. Transfer DNA (blotting)
Dengan gel yang disusun mulai dari bawah yaitu larutan alkali, spons, gel,
membrane nitroselulose, tisu dan beban berat, daya kapilaritas menarik larutan
alkalin ke atas kea rah gel, mentransfer DNA ke membrane nitroselulosa,
menghasilkan blot. DNA terdenaturasi dalam proses ini (versi lain dapat
menggunakan arus listrik untuk mempercepat transfer DNA). Untai tunggal
 DNA yang menempel ke nitroselulosa membentuk pita pita yang sesuai pada
gel
4. Hibridisasi dengan kuar radioaktif
Blot nitroselulosa dipaparkan ke larutan yang mengandung kuar berlabel
radioaktif. Kuar berpasangan basa dengan fragmen yang mengandung sekuens
DNA target.
5. Deteksi Kuar
Selembar film fotografik diletakkan diatas blot. Radioaktivitas dalam kuar
terikat akan terpapar ke film sehingga terbentuk citra yang sesuai dengan pita
pita pengandung DNA yang berpasangan basa dengan kuar.

Daftar Pustaka
Muladno, MSA. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetik. Bogor. Pustaka Wirausaha
Muda.

http://makalahbiologiku.blogspot.com/2010/04/tanaman-transgenik.html

Ali, 2012, Bioteknologi,(online), (aliebios3.staff.ub.ac.id/files/2012/12/B-i-o-t-e-k-n-o-l-o-g-

i.docx, diakses tanggal 27 September 2013 pukul 10:02 WITA).

Pine, dkk. 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through Q1 increased pro
vitamin A content. http://www.goldenrice.org/Content2-How/how1_sci.php

Golden Rice website http://www.goldenrice.org/Artikel Golden Rich

http://www.goldenrice.org/PDFs/Al-Babili_Beyer_TIPS_2005.pdf
BB Biogen. 2011.Padi Emas: Salah Satu Jawaban untuk Kebutuhan vitamin A
http://biogen.litbang.pertanian.go.id/wp/wp-content/uploads/kalins-pdf/singles/padi-
emas-salah-satu-jawaban-untuk-kebutuhan-vitamin-a.pdf Campbell, Reece. 2010.
BIOLOGI.Penerbit Erlangga : Jakarta

Rahmawati, S., & KM, J. R. B. (2006). Status perkembangan perbaikan sifat genetik padi
menggunakan transformasi Agrobacterium.

Apriana, A., Sisharmini, A., Enggarini, W., Sudarsono, S., Khumaida, N., & Trijatmiko, K.
R. (2011). Introduksi konstruk over-ekspresi kandidat gen OsWRKY76 melalui
Agrobacterium tumefaciens pada tanaman padi Nipponbare. Jurnal AgroBiogen, 7(1),
19-27.

Zannati, A. (2015). Sang Penyelenggara itu disebut Promotor. BioTrends, 4(1), 31-34.

Wulansari, D., Nurfatin, Z. W. (2015). Penerapan Rekayasa Genetik Golden Rice

Ye, Xudong. dkk. 2000. Engineering the Provitamin A (Beta-Carotene) Biosynthetic Pathway
into (Carotenoid-Free) Rice Endosperm. Science . 287(5451):303-5.

Wulansari, Dian. 2015. Bioteknologi Modern “Genetically Modified Organism”. 18September 2019.
https://www.academia.edu/12939162/Penerapan_Rekayasa_Genetika_Golden_Rice_