Metode Transfer Gen pada Tanaman Transgenik

Metode transfer gen dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak langsung
(Herman, 1996). Contoh transfer gen secara langsung adalah penembakan eksplan gen
dengan gene gun atau divortex dengan silicon carbide (karbid silikon) dan perlakuan
pada protoplas tanaman dengan elektroporasi atau dengan polyethylene glycol (PEG).
Sedangkan transfer gen secara tidak langsung adalah melalui vector Agrobacterium.

Transfer Gen secara Langsung

1. Particle Bombardment (Penembakan partikel)

Teknik paling modern dalam transformasi tanaman adalah penggunaan metode
penembak-an partikel atau gene gun. Metode transfer gen ini diopera-sikan secara
fisik dengan menembakkan partikel DNA-coated langsung ke sel atau jaringan
tanaman (Klein et al., 1988). Dengan cara demikian, partikel dan DNA yang
ditambahkan me-nembus dinding sel dan mem-bran, kemudian DNA melarut dan
tersebar dalam sel secara independen. Telah didemonstra-sikan bahwa teknik I
efektif untuk mentransfer gen pada bermacam-macam eksplan. Penggunaa
penembakan partikel membuka peluang dan kemungkinan lebih mudah dalam
memproduksi tanaman transgenic dari berbagai spesies yang sebelumnya sukar
ditransformasi dengan Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil seperti padi,
jagung, dan turfgrass.
 Tahap metode penembakan

2. Electroporation (elektroforasi)
Metode transfer DNA yang umum digunakan pada tanaman monokotil adalah
elektroporasi dari protoplas, perlakuan poly-ethylene glycol (PEG) pada protoplas dan
kombinasi antara dua perlakuan tersebut (Joersbo dan Brunstedt, 1991). PEG
memudahkan presipitasi DNA dan membuat kontak lebih baik dengan protoplas, juga
melindungi DNA plasmid mengalami degradasi dari enzim nuclease (Mass dan Werr,
1989). Sedangkan elektroporasi dengan perlakuan listrik voltase tinggi menyebabkan
permiabilitas tinggi untuk sementara pada membran sel dengan membentuk pori-pori
sehingga DNA mudah penetrasi ke dalam protoplas. Integritas membran kembali
membaik seperti semula dalam beberapa detik sampai semenit setelah perlakuan listrik.
Jagung dan padi telah berhasil ditransformasi melalui elektroporasi dengan efisiensi
antara 0,1-1%. Kelemahan penggunaan protoplas sebagai explant untuk transformasi
adalah sulitnya regenerasi dari protoplas, dan ekstra komplikasi, serta variasi
somaklonal akibat panjangnya periode kultur.
3. Silicon carbide-mediated transformation (transformasi dengan media karbid
silikon)
Metode transfer gen lain yang kurang umum digunakan dalam transformasi tanaman
tetapi telah dilaporkan berhasil mentransformasi jagung dan turfgraas adalah
penggunaan karbit silikon. Suspensi sel tanaman yang akan ditransformasi dicampur
dengan serat karbid silikon dan DNA plasmid dari gen yang diinginkan dimasukkan ke
dalam tabung Eppendorf kemudian dilakukan pencampuran dan pemutaran dengan
vortex (Kaeppler et al., 1990). Serat silicon carbide berfungsi sebagai jarum injeksi
mikro (microinjection) untuk memudahkan transfer DNA ke dalam sel tanaman.

Transfer Gen secara Tidak Langsung

4. Agrobacterium-mediated transformation (metode transformasi dengan bantuan

Agrobacterium)
4.1 Teknologi transfer gen oleh Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri gram negative yang secara alamiah
menginfeksi tanaman dikotil dan menyebabkan tumor pada batang tanaman
(Gambar 1).

Gambar 1. Tumor pada batang tanaman dikotil yang disebabkan oleh

Agrobacterium tumafaciens
 (Sumber : Storey, 2015)

A.tumefaciens memiliki dua macam DNA, yakni DNA yang terletak di dalam
kromosom dan DNA plasmid yang berbentuk circular (melingkar) yang terletak di
luar kromosom (Gambar 2). Pada saat A.tumefaciens menginfeksi sel tanaman, ada
sepenggal DNA yang ada pada plasmid tersebut yang terintegrasi dengan stabil ke
genom tanaman, kemudian terekspresi dan menyebabkan tumor. Sepenggal DNA
tersebut dikenal sebagai T-DNA (Transferred-DNA).Sedangkan plasmid yang
membawa T-DNA disebut Ti plasmid (Ti=tumor inducing). T-DNA ini dibatasi
oleh Left border (LB) serta Right border (RB) yang panjangnya 25bp.

Gambar 2. Gambar Skhematis Sel Agrobacterium tumefaciens

Pada T-DNA terdapat dua tipe gen. Yang pertama adalah gen yang mengkode
pembentukan hormon auksin dan sitokinin. Ketika T-DNA terintegrasi ke genom
tanaman, gen ini terekpresi pada tanaman, maka auksin dan sitokinin akan
diproduksi secara berlebihan oleh tanaman dan menstimulasi pertumbuhan sel yang
tidak terorganisir sehingga terbentuk tumor. Yang kedua adalah gen untuk sintesis
opine. Gen sintesis opine ini terekspresi pada sel tanaman sehingga sel tanaman
mensintesis opine, dan opine ini selanjutnya digunakan oleh Agrobacterium sebagai
sumber karbon / nitrogen (makanan) untuk pertumbuhan Agrobacterium itu sendiri.
Selain itu plasmid juga membawa sekelompok gen Vir yang membantu dalam
proses transfer namun tidak ikut tertransfer dan terintegrasi ke genom tanaman.
Keberadaan gen Vir ini sangat penting dalam proses transfer. Proses transfer T-
DNA dimediasi oleh kerjasama dari protein - protein yang dikode oleh gen-gen Vir
tersebut yang terdapat pada virulence region pada Ti plasmid dan juga oleh gengen
yang terdapat pada kromosom bakteri. Secara alamiah pada pembentukan tumor
karena infeksi A.tumefaciens, sel tanaman yang luka menghasilkan asetosiringon
(AS) yaitu suatu senyawa kimia yang berfungsi sebagai ‘attractant’ bagi
Agrobacterium. AS mengaktifkan sekelompok gen Vir pada plasmid di dalam sel
bakteri sehingga menyebabkan gen Vir terekspresi dan menghasilkan protein Vir.
Protein Vir yang dihasilkan oleh gen Vir ini memungkinkan terjadinya transfer T-
DNA ke genom tanaman. Protein Vir inilah yang membantu terlepasnya T-DNA
sehingga masuk ke sitoplasma, kemudian ke inti sel dan terintegrasi ke DNA
tanaman pada kromosom. Selanjutnya T-DNA terekspresi dan secara fenotipik
terlihat sebagai tumor. Gambar 3 memperlihatkan secara skhematis T-DNA dengan
gen-gen yang ada di dalamnya.

Gambar 3. Plasmid (kiri) dan gen-gen yang ada pada T-DNA (kanan)
(Sumber: Shailes, 2013)

Sistem transfer T-DNA dari plasmid bakteri ke genom tanaman inilah yang
kemudian diadopsi oleh para pekerja rekayasa genetika untuk mentransfer gen yang
diinginkan (gene of interest) ke genom tanaman melalui A. tumefaciens.

4.2 Modifikasi Plasmid dalam Laboratorium

Teknologi transfer gen oleh Agrobacterium dimodifikasi untuk mentransfer gen
yang diinginkan ke genom tanaman. Teknologi transfer gen oleh A.tumefaciens
dapat diringkas sebagai berikut:
- Sepenggal DNA yang disebut T-DNA tertransfer ke genom tanaman ketika A.
tumefaciens menginfeksi tanaman.
- Pada T-DNA tersebut terdapat gen-gen pengkode hormon auksin dan sitokinin
yang terintegrasi ke genom tanaman dan terekpresikan oleh tanaman dan
menyebabkan tumor. Juga terdapat gen pengkode sintesa opine yang juga
terekspresi sehingga tanaman memproduksi opine untuk kelangsungan hidup
Agrobacterium.
Menurut Zupan & Zambryski (1995) dan Opabode (2006), untuk keperluan
rekayasa genetika, T-DNA dalam plasmid ini direkayasa secara buatan dalam
laboratorium sehingga dihasilkan plasmid modifikasi. Plasmid tersebut diisolasi,
kemudian dilakukan modifikasi sebagai berikut:
- Gen untuk sintesis auksin dan sitokinin dihilangkan supaya tidak terbentuk
tumor
- Gen sintesis opine juga dihilangkan karena produksi opine oleh sel-sel tanaman
akan mengganggu pertumbuhan sel tanaman disebabkan terpakainya bahan-
bahan fotosintat untuk sintesis opine.
- Ukuran plasmid yang besar (±200kbp) diperkecil dengan membuang segmen
DNA yang tidak diperlukan
- Ori (Origin of replication) untuk E.coli harus ditambahkan, agar plasmid dapat
diperbanyak dalam E.coli. Bakteri E.coli memiliki copy number yang besar
dalam replikasi plasmid, sehingga dalam rekayasa genetika digunakan untuk
kloning (memperbanyak plasmid yang membawa gen yang kita inginkan).
- Pada T-DNA kemudian disisipkan konstruksi gen yang diiinginkan.

Selanjutnya, plasmid modifikasi yang sudah membawa gene of interest tersebut

ditransformasi ke dalam A. tumefaciens kembali dan digunakan untuk mentransfer
gen ke genom tanaman. Maka ketika T-DNA yang sudah mengandung gene of
interest tersebut terintegrasi ke genom tanaman, selanjutnya terekspresi untuk
menghasilkan suatu karakter tanaman sesuai dengan karakter yang dibawa oleh gene
of interest tersebut.
4.3 Konstruksi Gen
Konstruksi gen yang dibuat menyerupai kondisi gen di alam, yakni terdiri dari:
1. Promoter sebagai penginisiasi dan pengarah ekspresi gen.
2. Terminator sebagai pengakhir ekspresi.
3. Selectable marker / reporter gene untuk seleksi awal dari sel-sel tanaman
yang ditransformasi, sehingga diketahui sel-sel yang diduga terinsersi oleh
transgen yang digunakan dalam transformasi. Yang baik digunakan untuk
selectable marker / reporter gene adalah gen dimana secara alamiah
tanaman tidak memilikinya.
Contoh konstruksi T-DNA dalam Agrobacterium dapat dilihat pada
Gambar 4.
Pada konstruksi ini, gen KNAT1 adalah gene of interest, sebagai selectable
marker digunakan gen NPTII. Pada masing-masing gen, baik KNAT1 maupun
NPTII, keduanya disertai dengan promoter (Pnos untuk gen NPTII dan 35S
RNA dari CaMV untuk gen KNAT1). Konstruksi gen ini disisipkan ke dalam
vektor pGreen (pG). Dari gambar konstruksi gen ini, jelas terlihat bahwa setiap
gen yang disisipkan pada T-DNA harus memiliki promoter (Pnos untuk gen
NPTII; 35S RNA dari CaMV untuk gen KNAT1) dan memiliki terminator
(Tnos untuk gen NPTII dan gen KNAT1).

Gambar 4. Contoh Konstruksi T-DNA

Keterangan: Plasmid biner pGreen digunakan sebagai vektor. Gen KNAT1

dikontrol oleh promoter 35S dari Cauli flower Mosaic Virus (CaMV). RB =
Right Border; LB = Left Border; Pnos = promoter dari gen nopalin synthase;
Tnos = polyadenylation site dari gen nopalin synthase; NPTII = Gen neomycin
 phosphotransferase yaitu gen ketahanan untuk antibiotik kanamisin KNAT1 F1
dan KNAT1 R1 adalah oligonukleotida primer spesifik untuk mengamplifikasi
gen KNAT1 sepanjang 1,2 kb (Sumber: Semiarti et al., 2007).

Dalam pembuatan konstruksi gen serta menyatukan T-DNA buatan ke

plasmid modifikasi diperlukan dua macam enzim yang sangat penting, yaitu
enzim endonuclease restriksi, yakni enzim yang bertugas memotong DNA
(memotong ikatan phospodiester); serta enzim DNA ligase, yakni enzim yang
bertugas menyatukan potongan-potongan DNA.

Referensi
Dwiyani R, dkk. 2016. Transformasi Genetik Pada Tanaman Melalui Agrobacterium
tumefaciens. Denpasar : Swasta Nulus.

Herman, M. 2002. Perakitan Tanaman Tahan Hama melalui Teknik Rekayasa Genetik.
Buletin AgroBio 5(1):1-13.