Dasar-dasar Bioteknologi

Teknik Transfer Gen:

Mikroinjeksi
Dohan Pramudia 1810211013
Rizka Pertiwi 1810211031
Puti Tasya 1810212031
Mikroinjeksi
 Mikroinjeksi adalah penggunaan mikropipet kaca untuk
menyuntikkan zat cair pada tingkat mikroskopis atau garis
batas makroskopik. Sasarannya seringkali berupa sel hidup
tetapi mungkin juga termasuk ruang antar sel. Mikroinjeksi
adalah proses mekanis sederhana yang biasanya
melibatkan mikroskop terbalik dengan kekuatan perbesaran
sekitar 200x (meskipun kadang-kadang dilakukan
menggunakan mikroskop stereo pembedahan pada 40-50x
atau mikroskop tegak majemuk tradisional dengan kekuatan
yang sama dengan model terbalik).
 Untuk proses seperti injeksi seluler atau pronuklir, sel target
ditempatkan di bawah mikroskop dan dua mikromanipulator
— satu memegang pipet dan satu lagi memegang jarum
mikrokapiler biasanya berdiameter antara 0,5 dan 5 µm
(lebih besar jika menyuntikkan sel induk ke dalam embrio) —
adalah digunakan untuk menembus membran sel dan / atau
selubung inti. [1] Dengan cara ini proses tersebut dapat
digunakan untuk memasukkan vektor ke dalam sel tunggal.
Mikroinjeksi juga dapat digunakan dalam kloning organisme,
dalam studi biologi sel dan virus, dan untuk mengobati
subfertilitas pria melalui injeksi sperma intrasitoplasma
JUDUL : TRANSFER GEN PENYADI HORMON
PERTUMBUHAN IKAN NILA (tiGH) PADA IKAN LELE
(Clarias sp.) DENGAN METODE MIKROINJEKSI.
 Ikan lele banyak digemari di
Indonesia, namun produksi ikan lele
tidak mengalami peningkatan.
Pertumbuhan ikan lele yang
dibudidayakan masyarakat menjadi
lebih lambat bila dibandingkan pada
saat ikan lele pertama kali
dibudidayakan di Indonesia. Perlu
dilakukan suatu upaya untuk
meningkatkan laju pertumbuhan
ikan lele.
Solusi
 Metode untuk mengatasi permasalahan ini yaitu teknologi
transgenesis. Tekonologi ini merupakan suatu teknik
rekayasa genetik dengan cara mengintroduksi gen yang
khas pada ikan untuk mendapatkan keunikan yang memiliki
nilai tambah.
 Teknologi transfer gen telah dikembangkan untuk
memperbaiki karakter kuantitatif dan kualitatif. Gen dari
individu suatu spesies diisolasi, dihubungkan ke promotor
(sebagai sekuens pengatur DNA atau on/off switches),
diklon, diperbanyak terutama dalam plasmid (Dunham, 2003)
Metode
 Pemeliharaan Induk dan Pemijahan
 Pembuatan Gel Agarosa Penahan Embrio
 Perbanyakan Konstruksi Gen
 Mikroinjeksi
 Penetasan Telur dan Pemeliharaan Larva
 Identifikasi Individu membawa Transgen
Pembuatan Gel Agarosa Penahan
Embrio
 Gel dibuat pada cawan petri dengan komposisi yaitu 0,6
gram agarosa dicampur akuades 30 ml
 dipanaskan dalam microwave selama dua menit, kemudian
setelah suhunya turun dituang pada cetakan marmer.
 Setelah agarosa membeku cetakan marmer dapat dilepas
hingga akhirnya terbentuk sebuah cekungan.’ Gel penahan
embrio bisa digunakan beberapa kali dan setelahnya dicuci
dengan 70% ethanol dan dibilas dengan air destilasi.
 Gel yang telah digunakan ditutup dengan plastik dan
disimpan pada 4°C.
Perbanyakan Konstruksi Gen
 Konstruksi gen berupa plasmid pmBP-tiGH berisi gen GH
ikan nila (Oreochromis niloticus) dengan promoter β-Aktin
(mBP) dari ikan medaka (Oryzias latipes).
Mikroinjeksi
 Dilakukan pada embrio ikan lele fase 1,
 larutan DNA diambil dari larutan stok yang berisi konstruksi plasmid
Mbp –tiGH.
 Embrio yang telah disuntik diinkubasi pada wadah terkontrol yang
terpisah dari wadah inkubasi untuk embrio normal tanpa penyuntikan.
 Teknik penanganan dan pendederan benih sesuai standar. Jumlah
telur yang dimikroinjeksi sebanyak 100 butir.
 Telur kemudian dipindahkan ke lubang gel penahan embrio
menggunakan pipet, jarum mikroinjeksi diatur posisinya dengan
bantuan mikromanipulator.
 Jarum diposisikan pada bagian atas telur dan cairan DNA diinjeksikan
dengan perlahan pada blastodick. Normalnya, cairan DNA diinjeksikan
mencapai kira – kira seperlima dari volume telur yang diinjeksi.
 Embrio kemudian dipindahkan ke cawan petri dan diinkubasi pada
suhu 28°C.
Penetasan Telur dan Pemeliharaan
Larva
 Telur hasil mikroinjeksi dipindahkan dalam akuarium inkubasi
yang telah diberi Methylene Blue, kemudian diberi aerasi sedang.
 Wadah dilengkapi pemanas agar temperatur air tetap stabil, yakni
28°C. Telur yang tidak dibuahi akan mengalami deformasi dan
dibuang 4 – 5 jam setelah mikroinjeksi.
 Telur yang telah diinjeksi akan menetas pada jam ke-24 setelah
pembuahan.
 Pemeliharaan larva dilakukan dengan pemberian pakan alami
dari hari ke2 hingga ke-4.
 Pada hari ke-3 larva diberi pakan berupa cacing alami rambut
yang telah dicacah sampai hari ke-14.
Identifikasi Individu membawa
Transgen
 Identifikasi individu menggunakan metode PCR pada cetakan
DNA genomik yang telah diekstrasi dari sirip ekor pada umur 4
minggu.
 PCR menggunakan dua set primer spesifik yang bisa
membedakan tiGH dengan gen GH endogenous ikan lele.
 Program PCR yang digunakan adalah 1 siklus (95°C selama 5
menit), 35 siklus (95°C selama 20 detik, 62°C selama 15 detik,
72°C selama 20 detik), dan 1 siklus (72°C selama 3 menit ).
 Selanjutnya hasil PCR dapat dianalisis dengan eletroforesis
atau disimpan pada pendingin dengan suhu 4°C.
Pembesaran Ikan Transgenik F0
 Benih ikan lele yang positif membawa transgen dipelihara
sampai berumur 3 bulan. Benih diberi pakan 3 kali dengan
kisaran 3%-5% perhari. Jenis pakan yang diberikan adalah
pakan buatan dan pakan alami. Pakan alami seperti Artemia,
Daphnia, dan cacing rambut, sedangkan pakan buatan
dalam bentuk pelet.
Analisis Ekspresi Transgen
 Ekspresi transgen pada benih ikan akan dianalisis
menggunakan metode RT-PCR. RNA diekstrasi dari sirip
ekor ikan transgenik F0. Ekstrasi RNA diperoleh dari sampel
jaringan sirip ekor yang dimasukan dalam mikrotube 1,5 mL
yang berisi ISOGEN dan dihancurkan sampai lisis. Hasil
PCR dielektroforesis menggunakan 0,7% gel agarose, di
staining dengan etidium bromida, dan difoto dengan kamera
digital dalam kondisi disinari dengan cahaya ultraviolet.
Hasil
 Berdasarkan hasil analisis RT-PCR, ada satu individu yang
menunjukan ekspresi transgen. Hal ini memperlihatkan
bahwa gen yang telah disisipkan tersebut tereksripsi,
walaupun tidak semua mengekspresian transgen. Gen
penyandi hormon pertumbuhan ikan nila (tiGH) dapat
ditransfer pada ikan lele dilihat dari individu yang membawa
transgen yaitu 42,86% (12 dari 28 ekor). Berdasarkan
analisis RT-PCR menggunakan cetakan cDNA, gen tiGH
terekspresi pada ikan lele