Bioteknologi perlindungan

tanaman
1. PENGANTAR
 Pendahuluan
Bioteknologi
Teknik-teknik yang menggunakan organisme hidup untuk:
 membuat atau memodifikasi suatu produk

 Memperbaiki sifat-sifat orgnisme hidup

 Mengembang -ciptakan suatu organisme untuk tujuan tertentu

 Definisi bioteknologi
Aplikasi teknoloogi-teknologi yang terarah untuk menseleksi
atau mengembangkan novel-properti genetika atau proses
seluler dari suatu organisme yang dapat diwariskan guna
penciptaan produk-produk yang menguntungkanbagi
manusia,mahlik hidup lain dan planet
Sejarah munculnya bioteknologi dlm perlindungan tanaman:
1. GREEN REVOLUTION

1. Mengapa muncul?
 Pertambahan penduduk meningkat
 Kebutuhan pangan, sandang dan papan meningkat
2. Ekstensifikasi ? Intensfikasi?
3. “ENVIRONMENTAL PRESSURE”
4. “OUTBEAK HAMA DAN PENYAKIT”

Biodiversity PHT/IPM
2. GENE REVOLUTION

1. Dasar: Gregor Mendel (1884-86): hibridisasi tanaman

 Breeding for resistance secara konvensional
 Bagaimana kereta dapat berpacu dengan kudanya
(Robinson)
2. Crick dan Watson (1953-56)
3. Teknologi DNA rekombinan (Jackson et al. 1972)
4. Teknologi amplifikasi DNA (1990-1996)
 3. GENETIC ENGINEERING

1. Rekayasa genetika tanaman tahan cekaman biotik dan

abiotik
 Bioteknologi modern a. Cis/intragenesis
 b. Transgenesis
 c. Rekombinasi
 d. Rekayasa genom
2. Organisme/Tanaman transgenik (GMO)
 Manfaat dan keuntungannya
 Waspada GMO

Proteksi tanaman
Ada 2 teknologi yg digunakan dalam penciptaan tan transgenik
a. teknologi antisense
b. teknologi over-ekspresi

LacZ: gen dalam plasmid yang terligasi bersama dengan gen

insert, fungsinya mengkontrol sintesis β-galaktosidase
untuk menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan
galaktosa pada skrining koloni rekombinan. Bila media
tumbuh diberi X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-B-D-
galaktopiranosid) dan iso-propil tiogalaktosidase (IPTG),
antibiotic misalnya ampisilin, X-gal akan dipecah β-
galaktosidase. Akibatnya, koloni rekombinan yang
mengandung gen lacZ berwarna biru, dan koloni yang
rekombinasinya gagal (plasmid dan insertnya tidak
terligasi dengan baik) tetap berwarna putih.
Contoh:
Aplikasi bioteknologi di bidang
perlindungan tanaman
 BACULOVIRUS
 Virus pada insekta
 Pertamakali ditemukan pada Bombix mori
 Virus mempunyai kapsid diameter 40-50x 200-
400 nm
 Ds-DNA, sirkuler, 80-200 kb
 Membentuk struktur occlusion body, yaitu virus
+ selubung nukleokapsid yang dibungkus matrix
kristalin protein
 Nuclear polihydrosis virus (NPV), mempunyai
occlusion body yang besar: insektisida
 Virus dipelihara pada insect cell culture, yang
ditumbuhkan pada Grace’s medium
Baculovirus oryctes
 B. oryctes merupakan salah satu virus
patogen yang menginfeksi kumbang
nyiur, Oryctes rhinoceros.
 Larva yang terserang virus tubuhnya lemas,

berwarna lebih transparan, bila mati akan

berwarna krem atau coklat muda, kadang-
kadang pada anus keluar usus.
 Larva yang telah mati berbau busuk. Larva

yang baru mati berwarna putih transparan

merupakan bahan virus yang baik untuk
dibekukan.
Perbanyakan B. oryctes
 Perbanyakan virus dengan larva. Seekor larva yang
terinfeksi virus dipotong-potong, dicampur dengan media
kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi media
dan dimasukkan pula 2 ekor larva sehat. Setelah 1-6
minggu larva terinfeksi. Larva mati dpt disimpan dalam
refrigerator.

 Perbanyakan virus dengan kumbang. Kumbang mati

terinfeksi virus dibedah. Bagian ususnya berwarna putih,
membengkak dan bila dipotong akan mengeluakan cairan
putih kental. Usus dari 4-5 ekor kumbang dicampur
dengan sedikit gula pasir lalu dihancurkan sampai lumat
dan ditambahkan 1 sendok aquades. Larutan ini cukup
untuk menginfeksi 30 ekor kumbang sehat dengan cara
meneteskannya (2-3 tetes) ke mulut kumbang. Setelah 2-3
minggu, kumbang siap dilepas di lapang.
Aplikasi virus
 Sebanyak 4 ekor larva mati ditambah 1 l air
kemudian diblender.
 Campuran disaring dan suspansinya digunakan
untuk merendam kumbaag yang akan diiepas ke
pertanaman kelapa yang terserang.
 Sebanyak 1 L suspensi dapat digunakan untuk
merendam 100 ekor kumbang selama 5-7 menit.
 Kumbang dimasukkan ke dalam botol dan
dipuasakan sehari, kemudian dilepas.
 Sebelum dilepas, kumbang dipelihara dulu selama
4 hari dan diberi pakan tebu.
 Kumbang dilepas pada sore atau malam hari
sebanyak 10-12 ekor/ha.
 Evaluasi dilakukan 1-3 bulan setelah penyebaran.
 MEKANISME NVP MENYERANG LARVA INSEKTA
1. Larva makan daun/tanaman yang mengandung NVP (PIB)
2. PIB-kristalin matrix larut dlm cairan mitdgut insekta yg
alkalin
3. Embedded virion terbebas
4. Virion masuk sel-sel midgut melalui fusi ke membran
mikrofili, shg tjd polarisasi sel-sel midgut shg bagian
dalam dasar membran pecah dan baculovirus terbebas.
1. Virus masuk hemocoel kmd ditranspor mll
hemolymph ke jaringan lain.
2. Virus menginfeksi sel-sel epithelial tracheole yaitu
sel-sel yg berfungsi menyediakan O2 utk midgut.
3. Insekta kekurangan O2, dan mati
 PERMASALAHAN
1. Bagaimana memelihara kestabilan virus agar tetap
infeksius dalam kultur sel
2. Bagaimana meningkatkan efektivitasnya

REKAYASA GENETIK
1. Determinasi gen-gen virulensi, karakterisasi fungsi gen, dan
mekanisme regulasi gen-gen parental virus
2. Memilih transfer plasmid dan konstruksi gen-gen parental virus
dengan memilih promoter mis. polh, yaitu gen utk menandai
transfer plasmid utk (occ +/- dalam konstruksi plasmid –virusyg
mengandung lac Z (marker)
Occ + : white colonies, Occ- : blue colonies (skrining
keberhasilan terjadinya single/double recombinant)
3. Identifikasi pengexpresian gen :koexpresi dua atau lebih gen
target
4. Optimimisasi expresi gen:
 Bacillus thuringiensis,
(Bt')
 Bakteri insecticidal, diisolasi dari tanah
 Sudah dipasarkan secara meluas utk pest control
 Umum utk caterpillar Lepidoptera (butterflies and

moths), juga larva nyamuk, dan simuliid blackflies

yg merupakan vektor river blindness di Afrika.
 Produk Bt merupakan 1% dari total ‘agrochemical’

market (fungisida, herbisida dan insektisida)

 Produk Bt berupa tepung yg mengandung

campuran spora –spora kering dan kristal toxin

 Gen toxin sudah genetically engineered kedalam

beberapa tanaman pertanian (see: Agrobacterium).

 Metode yg digunakan, mode of action, dan host

range dr agen biokontrol ini sangat berbeda dng

milik Bacillus popilliae.
 Sejarah, produk dan insekta sbg host range
 Bacillus thuringiensis pertamakali ditemukan
pada 1911 sbg patogen pada kumbang
tepung di provinsi Thuringia, Germany.
 Semula digunakan sbg insektisida komersial

di Perancis pd 1938, kemudian di USA pd

1950an.
 Tapi produk ini kmd diganti dng suatu produk

yg lebih efektif pd 1960an, yaitu ketika

bermacam-macam strain yg sangat patogenik
ditemukan dng aktivitas yang lebih spesifik
melawan tipe-tipe insekta yg berbeda
Bacillus thuringiensis
 Di Alam: membentuk spora yang memproduksi kristal protein
yg dapat meracuni larva beberapa serangga hama.
 1982. Held et al. mengisolasi dan mengkarakterisasi protein
kristal yg berpotensi sebagai insektisida dari suatu strain Bt:
GEN cry
 Racun Bt melekat pd ephithelial glycoprotein dalam usus
(terutama usus tengah) serangga sehingga usus bocor &
cairan usus merembes ke daerah antara hemocoel & usus.
MATI.
 Transformasi gen cry dari Bt tipe liar ke tanaman:
mengexpresikan daya meracun yg rendah, karena sekuensi
gennya banyak mengandung A-T, dan ini menyebabkan
mRNA dalam tan transgenik tidak stabil
• Bacillus thuringiensis diamati dng phase contrast
microscopy.
• Sel-sel vegetatif mengandung endospora (phase
bright) dan kristal protein insektisidal toxin (delta
endotoxin).
• Kebanyakan sel-selnya lisis dan dibebaskan spora-
spora dan kristal toxin (Strukturnya berbentuk
bipyramidal).
 Studi struktur delta-endotoxin menunjukkan
ada tiga domain.
 Domain I berupa satu bendel 7 alpha-helices,
bbrp atau semua akan mensisipi kdlm membran
sel usus besar yg menyebabkan terbentuknya
pori shg ion-ion dapat melewatinya dgn bebas.
 Domain II tdr atas tiga antiparalel beta-sheets,
serupa dng daerah antigen-binding dari
immunoglobulins, sepertinya domain ini terikat pd
receptor dlm usus besar.
 Domain III dipaket beta-sandwich dng kuat yg
diprotek pd exposed end (C-terminus) dr toxin
aktif, melindungi dr cleavage berikutnya oleh
protease usus besar. Diphtheria toxin (dr bakteria
lain) memiliki struktur utama serupa dgn Bt toxin.
.

Diagram based on: J Li, J Carroll and DJ Ellar, 1991.Nature 353, 815-
821]
  Mode of action

 Kristal-kristal teragregasi mjd protein besar (130-140 kDa) yg

dsbt protoxin – yg harus diaktivasi dulu sebelum bekerja
 Protein kristal sangat tidak mudah larut pd kondisi normal,
jadi hrs masuk dulu ke manusia, hewan tingkat tinggi dan
insekta.
 Dpt mudah larut bila kondisi pH tinggi (diatas pH 9.5) – spt
kondisi dalam usus tengah larva lepidoptera . Bt adl agen
insecticidal spesifik yg sangat tinggi
 Setelah larut dlm usus insekta, protoxin di cleave oleh
protease usus utk memproduksi toxin aktif ~ 60kD.
 Toxin ini dsbt delta-endotoxin yg akan mengikat sel-sel
epithelial midgut utk menghasilkan pori dlm membran sell
dan meyebabkan ion-ion ter-ekuilibrasi (tjd perbedaan
osmosis).
 Hasilnya, usus segera ter- immobilisasi, sel-sel epithelial
lisis, larva berhenti makan, dan pH usus mjd rendah oleh
ekuilibrasi dgn pH darah. pH rendah mengakibatkan
spora bakteria berkacambah, dan bakteria mengivasi inang
dan meyebabkan lethal septicaemia.
 Racun Bt melekat pd ephithelial glycoprotein dalam usus
(terutama usus tengah) serangga sehingga usus bocor &
cairan usus merembes ke daerah antara hemocoel & usus ,
larva akhirnya MATI.
 Transformasi gen cry dari Bt tipe liar ke tanaman:
mengexpresikan daya meracun yg rendah, karena sekuensi
gennya banyak mengandung A-T, dan ini menyebabkan
mRNA dalam tan transgenik tidak stabil
Bacillus thuringiensis
 B.t. subspecies kurstaki is widely used in
caterpillar control in agriculture and forestry
 B.t. subspecies israelensis is active against

mosquitoes and black flies

 B.t. subspecies tenebrionis is active again beetle

larvae
Bt Uses
 Spray Applications
◦ Bt toxins degrade within a few days
◦ Endospores can survive for several years after spray
applications
 Genetic Engineering with Bt genes
◦ Transfer into crop plants
◦ Transfer other bacteria
Kultivar tahan hasil rekayasa genetika
1. Kapas Bt

Serangan insekta pada Cotton

Bt (kanan) dan non-Bt
bollworm Cotton boll
(kiri) pada cotton bolls
transgenik

envfor.nic.in/news/aprjun02/aftcbci.html
 2. Jagung Bt
Kanan: western corn rootworm,
D. virgifera virgifera LeConte, European Corn Borer
and (Kiri) the northern corn Ostrinia nubilalis
rootworm, D. barberi Smith and
Lawrence,

StarLink Corn
mengandung protein
YieldGard Rootworm Cry9 (gen Bt)
transgenic corn,

www.extension.umn.e
du
Bt Corn Reduce uses:
Insecticide Application Mycotoxin Production
Ulat jagung (corn earworm, Helicoverpa zea) dan
kupunya makan bulir jagung dan menyebarkan green
mold (Aspergillus flavus).
(Photo credit: Texas A&M University)
www.sciencedaily.com/.../05/040511042956.jpg
 J
A
J
G
A
U
G
N
U
G
N
Bt
G
Non Bt

Helicoverpa armigera (A dan B) dan Ostrinia furnacalis

(C, D, dan E) pada daun jagung 5 hari setelah infestasi
J
A J
G A
U G
N U
G N
G
Bt Non Bt
 Bt toxin dan klasifikasinya
 Strain-strain B. thuringiensis memprodukasi
dua tipe toxin. Tipe utama yaitu Cry (crystal)
toxins, yg dikode oleh cry genes yg berbeda,
dan berdasarkan hal ini diklasifikasikan bbrp
tipe Bt. Tipe yg kedua yi Cyt (cytolytic) toxins,
yg dapat me- augmentasi Cry toxins, shg
meningkatkan keefektivan pengendalian
insekta.
 Lebih 50 gen yg encode Cry toxins skg sudah

disekuensi dan berdasarkan kesamaan

sekuensi toxin diklasifikasikan mjd 15 grup.
 Tabel berikut adl klasifikasi 1995, dan skg

klasifikasi yag baru sdg dibuat.