BIOEKNOLOGI PERLINDUNGAN

TANAMAN
KULIAH 2
 Kloning gen:
memproduksi suatu material genetik yang identik
dalam jumlah banyak tanpa melalui proses fertilisasi

Mengapa perlu Kloning gen?

1. untuk memperoleh gen/DNA spesifik yg murni dalam
jumlah banyak
2. menjawab masalah-masalah yang berhubungan dgn
gen terapi dan penyakit degenerasi, ketuaan yang
terlalu cepat
3. memproduksi senyawa penting: obat, antibiotik,
hormon dll
4. menduga penyakit yg berhub. dgn genetika suatu
organisme
5. mengkonstruksi gen-gen tanaman, hewan agar
sifatnya menjadi lebih baik
 Kloning gen

Genetically engineering offspring

(progeni) dari jaringan non-sexual
Telah dilakukan dan sukses pada
mammalia seperti Dolly in 1996.
Dolly
• Pada 1996, Ian Wilmut
meng-klon Dolly dari
domba dewasa, dng
cara transfer inti sel
somatik utk kloning.
• Dolly mati ketika
berumur 6 th karena
respiratory problem yang
selalu terjadi diantara
domba-domba
Cloning
 Sistem transformasi DNA target ke sel tumbuhan
secara kimia dan mekanis
1. Penyatuan potongan-potongan DNA target pada fragmen
kromosom atau plasmid, ke dalam DNA/kromosom vektor
atau protoplasma dengan bantuan kation yang dihasilkan
senyawa tertentu dalam medium, misalnya fusagen (PEG)
pada suhu kamar selama 10-15 menit atau dengan
sonifikasi.
2. Elektrotransformasi campuran protoplasma dengan DNA
target mll tenaga listrik bergelombang pendek. Tenaga
listrik ini akan menusuk membran sel protoplasma dan
memberi peluang utk masuknya DNA target, kemudian
protoplasma diregenerasikan menjadi tumbuhan.
3. Mikroinjeksi langsung DNA target ke dalam sel tumbuhan.
4. Elektrik gun particle bombartment, menembakan langsung
DNA target ke sel tumbuhan dengan tenaga elektron.
 Biolistics (Biological Ballistics)

Useful for engineering corn, rice, wheat, barley, & other crops

http://faculty.abe.ufl.edu/~chyn/age2062/lect/lect_09/10_19A.GIF
 Helios Gene Gun

Uses an adjustable burst low-pressure helium to sweep DNA- or RNA-coated

gold pellets from the inner wall of a small plastic cartridge directly onto a
target

http://www.bio-rad.com
Plant Cloning

http://www.webschoolsolutions.com/biotech/transgen.htm
 Contoh:
Aplikasi bioteknologi di bidang
pertanian
 Agricultural
Biotechnology
• Genetically modified organisms (GMO)
dengan gen-gen yang diinsertkan.

• Genetically Modified plants a. l.

resisten thd penyakit, frost, insekta

• GM dapat juga sebagai pabrik utk

pharmaceuticals: tanaman tobacco
yang memprodukasi Hemoglobin

• Hasil tanaman lebih sehat dan lebih

tinggi d.p. tanaman non-GO, shg
meningkatkan suplai makanan kita
CONTOH PRODUK TEKNOLOGI TANAMAN TRANSGENIK
CALGENE FLAVR SAVRTM TOMATO
MASALAH:
• Buah recalsitrant
• Hasil pertama dari teknologi antisense PG-gen
• Gen pereduksi pembentukan enzim poli-(1,4--D-
galakturonida) glikan hidrolase
• Fungsi enzim: melunakkan lamela tengah dinding sel mjd
pektin yg mudah larut
Prosedur:
1. isolasi klon PG-cDNA dan dideteksi secara imunologi
2. Karakterisasi PG-mRNA yg diexpresikan dalam plant transformats
(level PG-mRNA, protein dan aktivitas enzim)
3. field trials: reduksi tingkat kemasakan buah tua sampai 95-99%
setelah 25 hari panen
4. karakterisasi textur/sifat buah:
a. viskositas juice lebih kental
b. textur buah lebih keras/firm
c. resisten thd jamur patogen: soft rot, Rhizopus stolonifer dan
sour rot, Geotrichum candidum
5. mutan tomat tahan G. candidum: Nr (Neverripe)
6. 1989. Daftar ke Animal & Plant Health Inspection (Aphis) untuk
field trial oleh USDA untuk uji ketahanannya terhadap plant
pests dan pengaruhnya terhadap lingkungan.
7. 1990-91. Daftar ke US Food & Drug Administration (FDA) untuk
commercial sale Tidak ada pembeli ????
8. Saran FDA: lengkapi dengan menyebutkan
a. selectable marker gene yg digunakan, misalnya gen
marker kanr dan produk gennya: neomycin
phosphotransferase [APH(3’)II], kmd disertai dgn data:
b. apakah gen ini bersifat horizontal gene transfer, yi gen
kanr dpt dipindahkan dr tan transgenik ke organisme lain,
bila dapat bgmn akibat dari perpindahan ini,
c. apakah produk gen yi APH(3’)II bersifat sebagai toxin atau
alergen,
 d. apakah APH(3’)II setara dgn penggunaan dosis oral
kanamisin atau neomisin sbg terapi antibiotik pd
manusia.

5. Selama pengujian no.8: Bussiness strategy. 1992-94.

Calgene Fresh menjual non- transgenic tomato
MacGregor, vine-ripened tomato. LAKU BETUL.

6. Kemudian: Jual tomato transgenik dan

LAKU KERAS
 BACULOVIRUS
• Virus pada insekta
• Pertamakaliditemukan pada Bombix mori
• Virus mempunyai kapsid diameter 40-50x 200-
400 nm
• Ds-DNA, sirkuler, 80-200 kb
• Membentuk struktur occlusion body, yaitu virus +
selubung nukleokapsid yang dibungkus matrix
kristalin protein
• Nuclear polihydrosis virus (NPV), mempunyai
occlusion body yang besar: insektisida
• Virus dipelihara pada insect cell culture, yang
ditumbuhkan pada Grace’s medium
MEKANISME NVP MENYERANG LARVA INSEKTA hama
1. Larva makan daun/tanaman yang mengandung NVP (PIB)
2. PIB-kristalin matrix larut dlm cairan mitgut insekta yg
alkalin
3. Embedded virion terbebas
4. Virion masuk sel-sel midgut melalui fusi ke membran
mikrofili, shg tjd polarisasi sel-sel midgut shg bagian
dalam dasar membran pecah dan baculovirus terbebas.
1. Virus masuk hemocoel kmd ditranspor mll
hemolymph ke jaringan lain.
2. Virus menginfeksi sel-sel epithelial tracheole yaitu
sel-sel yg berfungsi menyediakan O2 utk midgut.
3. Insekta kekurangan O2, dan mati
 PERMASALAHAN
1. Bagaimana memelihara kestabilan virus agar tetap
infeksi dalam kultur sel
2. Bagaimana meningkatkan efektivitasnya

REKAYASA GENETIK
1. Determinasi gen-gen virulensi, karakterisasi fungsi gen, dan
mekanisme regulasi gen-gen parental virus
2. Memilih transfer plasmid dan konstruksi gen-gen parental virus
dengan memilih promoter mis. polh, yaitu gen utkenandai transfer
plasmid utk (occ +/- dalam konstruksi plasmid –virusyg
mengandung lac Z (marker)
Occ + : white colonies, Occ- : blue colonies (skrining
keberhasilan terjadinya single/double recombinant)
3. Identifikasi pengexpresian gen :koexpresi dua atau lebih gen
target
4. Optimalisasi expresi gen:
 Bacillus thuringiensis, (Bt')

• Bakteri insecticidal, diisolasi dari tanah

• Sudah dipasarkan secara meluas utk pest control
• Umum utk caterpillar Lepidoptera (butterflies and
moths), juga larva nyamuk, dan simuliid blackflies
yg merupakan vektor river blindness di Afrika.
• Produk Bt merupakan 1% dari total ‘agrochemical’
market (fungisida, herbisida dan insektisida)
• Produk Bt berupa tepung yg mengandung
campuran spora –spora kering dan kristal toxin
• Gen toxin sudah genetically engineered kedalam
beberapa tanaman pertanian (see: Agrobacterium).
• Metode yg digunakan, mode of action, dan host
range dr agen biokontrol ini sangat berbeda dng
milik Bacillus popilliae.
 Sejarah, produk dan insekta sbg host range
• Bacillus thuringiensis pertamakali ditemukan
pada 1911 sbg patogen pada kumbang tepung
di provinsi Thuringia, Germany.
• Semula digunakan sbg insektisida komersial di
Perancis pd 1938, kemudian di USA pd 1950an.
• Tapi produk ini kmd diganti dng suatu produk yg
lebih efektif pd 1960an, yaitu ketika bermacam-
macam strain yg sangat patogenik ditemukan
dng aktivitas yang lebih spesifik melawan tipe-
tipe insekta yg berbeda
 Bacillus thuringiensis
• Di Alam: membentuk spora yang memproduksi kristal
protein yg dapat meracuni larva beberapa serangga hama.
• 1982. Held et al. mengisolasi dan mengkarakterisasi protein
kristal yg berpotensi sebagai insektisida dari suatu strain
Bt: GEN cry
• Bacillus thuringiensis diamati dng phase
contrast microscopy.
• Sel-sel vegetatif mengandung endospora (phase
bright) dan kristal protein insektisidal toxin
(delta endotoxin).
• Kebanyakan sel-selnya lisis dan dibebaskan
spora-spora dan kristal toxin (Strukturnya
berbentuk bipyramidal).
Studi struktur delta-endotoxin menunjukkan ada
tiga domain.
• Domain I berupa satu bendel 7 alpha-helices,
bbrp atau semua akan mensisipi kdlm membran
sel usus besar yg menyebabkan terbentuknya
pori shg ion-ion dapat melewatinya dgn bebas.
• Domain II tdr atas tiga antiparalel beta-sheets,
serupa dng daerah antigen-binding dari
immunoglobulins, sepertinya domain ini terikat pd
receptor dlm usus besar.
• Domain III dipaket beta-sandwich dng kuat yg
diprotek pd exposed end (C-terminus) dr toxin
aktif, melindungi dr cleavage berikutnya oleh
protease usus besar. Diphtheria toxin (dr bakteria
lain) memiliki struktur utama serupa dgn Bt toxin.
.

Diagram based on: J Li, J Carroll and DJ Ellar, 1991.Nature 353, 815-821]
 Mode of action
• Kristal-kristal teragregasi mjd protein besar (130-140 kDa) yg
dsbt protoxin – yg harus diaktivasi dulu sebelum bekerja
• Protein kristal sangat tidak mudah larut pd kondisi normal,
jadi hrs masuk dulu ke manusia, hewan tingkat tinggi dan
insekta.
• Dpt mudah larut bila kondisi pH tinggi (diatas pH 9.5) – spt
kondisi dalam usus tengah larva lepidoptera Bt adl agen
insecticidal spesifik yg sangat tinggi
• Setelah larut dlm usus insekta, protoxin di cleave oleh
protease usus utk memproduksi toxin aktif ~ 60kD.
• Toxin ini dsbt delta-endotoxin yg akan mengikat sel-sel
epithelial midgut utk menghasilkan pori dlm membran sell dan
meyebabkan ion-ion ter-ekuilibrasi (tjd perbedaan osmosis).
• Hasilnya, usus segera ter- immobilisasi, sel-sel epithelial lisis,
larva berhenti makan, dan pH usus mjd rendah oleh ekuilibrasi
dgn pH hemolimf. pH rendah mengakibatkan spora bakteria
berkacambah, dan bakteria mengivasi inang dan meyebabkan
lethal septicaemia.
• Racun Bt melekat pd ephithelial glycoprotein dalam usus
(terutama usus tengah) serangga sehingga usus bocor &
cairan usus merembes ke daerah antara hemocoel & usus
akhirnya MATI.
• Transformasi gen cry dari Bt tipe liar ke tanaman:
mengexpresikan daya meracun yg rendah, karena sekuensi
gennya banyak mengandung A-T, dan ini menyebabkan mRNA
dalam tan transgenik tidak stabil.
 Bt toxin dan klasifikasinya
• Strain-strain B. thuringiensis memprodukasi dua
tipe toxin. Tipe utama yaitu Cry (crystal) toxins, yg
dikode oleh cry genes yg berbeda, dan
berdasarkan hal ini diklasifikasikan bbrp tipe Bt.
Tipe yg kedua yi Cyt (cytolytic) toxins, yg dapat
me- augmentasi Cry toxins, shg meningkatkan
keefektivan pengendalian insekta.
• Lebih 50 gen yg encode Cry toxins skg sudah
disekuensi dan berdasarkan kesamaan sekuensi
toxin diklasifikasikan mjd 15 grup.
• Tabel berikut adl klasifikasi 1995, dan skg
klasifikasi yag baru sdg dibuat.