BAKTERIOLOGI PERTANIAN
Disusun Oleh:
Nama
: Yekti Agus S.
Nim
: 125040200111017
Kelompok
: Kamis 13.20
Asisten
: Iriyanti
I.
PENDAHULUAN
1.
Latar Belakang
Penyakit tumbuhan adalah salah satu permasalahan petani yang banyak menjadi progress
pemikiran utamanya oleh kalangan ahli. Dalam kepentingan pengandaliannya, sudah
semestinya harus mengetahui terlebih dahulu penyebab dari penyakit yang menyerang suatu
tanaman. Proses identifikasi perlu dilakukan untuk mengetahui secara pasti karakteristik dari
suatu
pathogen
sehingga
dapat
mempermudah
pengambilan
keputusan
untuk
Tujuan
Manfaat
II.
TINJAUAN PUSTAKA
1.
a.
Bakteri
Definisi
Bakteri adalah salah satu golongan organisme prokariotik (tidak memiliki selubung inti).
Bakteri sebagai makhluk hidup tentu memiliki informasi genetik berupa DNA, tapi tidak
terlokalisasi dalam tempat khusus (nukleus) dan tidak ada membran inti. Bentuk DNA bakteri
adalah sirkuler, panjang dan biasa disebut nukleoi. Pada DNA bakteri tidak mempunyai
intron dan hanya tersusun atas akson saja. Bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal
yang tergabung menjadi plasmid yang berbentuk kecil dan sirkuler (Jawetz, 2004).
b. Klasifikasi
1. Bakteri Gram-negatif
1. Bakteri Gram-positif
Staphylococcus
Berbentuk bulat, biasanya tersusun bergerombol yang tidak teratur seperti anggur.
Beberapa spesies merupakan anggota flora normal pada kulit dan selaput lendir, yang
lain menyebabkan supurasi dan bahkan septikemia fatal. Staphylococcus yang
patogen sering menghemolisis darah, mengkoagulasi plasma dan menghasilkan
berbagai enzim ekstraseluler. Tipe Staphylococcus yang berkaitan dengan medis
adalah Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis dan Staphylococcus
saprophyticus.
Streptococcus
Merupakan bakteri gram-positif berbentuk bulat yang mempunyai pasangan atau
rantai pada pertumbuhannya. Beberapa streptococcus merupakan flora normal
manusia tetapi lainnya bisa bersifat patogen pada manusia. Ada 20 spesies
diantaranya:
Streptococcus
pyogenes,
Streptococcus
agalactiae,
dan
jenis
Enterococcus.
(Jawetz, 2004).
c.
kelembaban, angin, ketinggian, dan lain-lain. Temperatur dan kelembaban relatif adalah dua
faktor penting yang menentukan viabilitas dari mikroorganisme dalam aerosol. Studi dengan
Serratia marcesens dan E. coli menunjukkan bahwa kelangsungan hidup udara terkait erat
dengan suhu. Peningkatan suhu menyebabkan penurunan waktu bertahan (Jawetz, 2004).
d. Cara pengendalian
Menurut Abadi (2005), ada tiga strategi yang dapat dilakukan untuk pengendalian
penyakit tumbuhan yaitu : (1) strategi untuk mengurangi inokulum awal, (2) strategi untuk
mengurangi laju infeksi, dan (3) strategi untuk mengurangi lamanya epidemi.
Strategi untuk Mengurangi Inokulum Awal
Taktik-taktik yang dapat digunakan untuk mengurangi inokulum awal patogen adalah sebagai
berikut:
1. Avoidan mengurangi tingkat penyakit dengan memilih waktu tanam atau memilih
lahan yang mempunyai jumlah inokulum yang rendah atau karena faktor lingkungan
tidak sesuai untuk infeksi
2. Ekslusi mengurangi jumlah inokulum awal yang berasal dari luar lingkungan
tersebut
Metode perbanyakan
Lactose Broth. Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran
koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (preenrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh
bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk
memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat
difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas
adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3%
ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.
EMBA (Eosin Methylene Blue Agar). Media Eosin Methylene Blue mempunyai
keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang
memfermentasikan laktosa sepertiS. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba
yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan
kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna.
Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun
demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh
terutama P.
Aerugenosadan
Salmonella
sp
dapat
menimbulkan
keraguan.
Nutrient Agar. Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA
juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak
selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media
sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu
media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air,
sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel
pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Untuk
komposisi nutrien agar adalah eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat
1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi
dengan autoklaf pada 121C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang
dibutuhkan.
3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama, 3.Atur pH
sampai 7,0, 4.Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml, dan 5.Sterilisasi dengan autoklaf.
-
MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar). MRSA merupakan media yang diperkenalkan
oleh De Mann, Rogosa, dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan
mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung
polysorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak
sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar
tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc
serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung: Protein dari kasein 10
g/L, Ekstrak daging 8,0 g/L, Ekstrak ragi 4,0 g/L, D (+) glukosa 20 g/L, Magnesium
sulfat 0,2 g/L, Agar-agar 14 g/L, Dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L, Tween 80
1,0 g/L, Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L, Natrium asetat 5 g/L, dan Mangan sulfat
0,04 g/L. MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk
cair/broth.
Trypticase Soy Broth (TSB). TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum,
untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak
digunakan untuk isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung
pertumbuhan mayoritas bakteri patogen. Media TSB mengandung kasein dan pepton
kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang
membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa
adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik.
Dikalium fosfat ditambahkan sebagai buffer untuk mempertahankan pH.
Plate Count Agar (PCA). PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik
dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan
(casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk
suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121C).
Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena
di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan
asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai
vitamin B kompleks.
glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik
untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media
dalam 1 liter air yang telah didestilasi. campur dan panaskan serta aduk. Didihkan
selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121C
selama 15 menit. Dinginkan hingga suhu 40-45C dan tuang dalam cawan petri
dengan pH akhir 5,6+0,2.
-
VRBA (Violet Red Bile Agar). VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok
bakteri Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa,
sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati.
Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang dibutuhkan
untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu, glukosa, neutral
red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air
yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan
hingga 50-60C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4.
Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast
ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri.
Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar
merupakan agen pemadat.
g.
Jenis-jenis sterilisasi
Sterilisasi adalah cara untuk mendapatkan suatu kondisi bebas mikroba atau setiap proses
yang dilakukan baik secara fisika, kimia, dan mekanik untuk membunuh semua bentuk
kehidupan terutama mikroorganisme. Sterilisasi yang sering dilakukan pada praktikum
biologi terbagi menjadi sterilisasi kering dan sterilisasi basah (Hadioetomo,1993).
Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme
yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Ketika untuk pertama kalinya melakukan
pemindahan biakan bakteri secara aseptic, sesungguhnya hal itu telah menggunakan salah
satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran. Namun, kebanyakan peralatan dan media yang umum
dipakai di dalam pekerjaan mikrobiologi akan menjadi rusak bila dibakar. Untungnya tersedia
berbagai metode lain yang efektif (Hadioetomo,1993).
h. Teknik isolasi
Bakteri jarang terdapat dalam keadaan murni bila berada di alam. Kebanyakan bakteri
merupakan campuran berbagai macam spesies bakteri. Cara yang umum untuk mengisolasi
bakteri adalah:
1. Cara Goresan (Streak Plate Method)
Cara ini dasarnya adalah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri
pada permukaan medium agar yang sesuai dalam cawan petri. Setelah inkubasi maka
pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel
bakteri, sehingga dapat diisolasi lebih lanjut.
2. Cara Taburan (Pour Plate Method)
Cara ini dasarnya adalah menginokulasi medium dengan agar yang sedang mencair
pada temperatur 50 0C dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri, kemudian
menuangkan ke dalam cawan petri. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-koloni yang
tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri sehingga dapat
diisolasi lebih lanjut.
3. Cara Pengenceran (Dillution Plate)
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Lister berhasil
menghasilkan biakan murni Stretococcus lactis yang diisolasi dari susu yang sudah
masam. Caranya dengan mengencerkan suspensi yang berupa campuran bermacammacam species kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran ini
diambil 1 ml untuk diencerkan lagi, bila perlu diencerkanlagi hingga seterusnya.
Langkah selanjutnya adalah dari pengenceran diatas, diambil 0,1 ml untuk disebarkan
pada suatu medium padat, sehingga kita mendapatkan beberapa koloni tumbuh dlaam
media tersebut, tetapi bisa saja hanya satu koloni yang tumbuh.. dalam ha; demikian ,
kita telah memperoleh sat koloni murni, dan selanjutnya spesies ini dapat kita jadikan
biakan murni. Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril.
Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari
substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi
bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki
permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda
tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan
mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud
kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan
terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada
permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll.
Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades
Cara Penuangan
Penemuan metode penuangan ini ada dua orang yang berjasa yaitu Petri yang
menciptakan cawan dengan tutup, yang sekarang dikenal dengan cawan petri. Orang
kedua adalah Hense yang menemukan agar-agar untuk menggantikan gelatin. Hal ini
dikarenakan agar-agar memiliki sifat yang lenbih baik daripda gelatin untuk bahan
pengental suatu medium. Agar-agar tidak lekas mencair, karena titik cairnya 950C.
Sehingga teknik ini sekarang lebih dikenal sebagai teknik agar tuang.
Prinsip melakukan pengenceran adlaah menurunkan jumlah mikroorganisme
sehingga suatu saat hanya ditemukan satu sel dalam satu tabung. Demikian juga dengan
cara penuangan.
5.
Cara Penggoresan
Cara ini lebh menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi
memerlukan ketrampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna akan
menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara ini bakteri-nakteri anaerob
tidak dapat hidup tumbuh. Ada beberapa teknik penggoresan, yakni:
Goresan T
Goresan Kuadran
Goresan Radian
Goresan Sinambung
dengan pipet lain, tetesan dipindahkan ke suatu medium encer dnegan tujauna bakteri
tersebut berbiak lebih dahulu. Dari biakan ini kan diperoleh piaraan murni
(Waluyo, 2010).
2.
a.
Patogen Praktikum
Kalasifikasi Patogen
Xanthomonas oryzae
Menurut Amrullah (2008), klasifikasi bakteri Xanthomonas oryzae adalah sebagai
berikut:
Divisi
: Gracilicutes
Kelas
: Proteobacteria
Bangsa
: Pseudomonadales
Suku
: Pseudomonadaceae
Marga
: Xanthomonas
Jenis
Xanthomonas glycine
Menurut Amrullah (2008), klasifikasi bakteri Xanthomonas glycine adalah sebagai
berikut:
Divisi
: Gracilicutes
Kelas
: Proteobacteria
Bangsa
: Pseudomonadales
Suku
: Pseudomonadaceae
Marga
: Xanthomonas
Jenis
: Xanthomonas glycine
Erwinia carotovora
Menurut Astuti (2012), klasifikasi bakteri Erwinia carotovora adalah sebagai berikut:
Kingdom
: Bakteria
Phylum
: Protobacteria
Class
: Gammaproteobacteria
Order
: Enterobacterialles
Family
: Enterobacteriaceae
Genus
: Erwinia
Speceis
: Erwinia carotovora
Ralstonia solanacearum
: Prokaryotae
Divisi
: Gracilicutes
Subdivisi
: Proteobacteria
Famili
: Pseudomonadaceae
Genus
: Ralstonia
Spesies
: R. solanacearum
Xanthomonas oryzae
Koloni bakteri pada media padat yang mengandung glukosa (glucose yeast extract
agar) berbentuk bulat, cembung, berlendir dan berwarna kuning karena memproduksi pigmen
xanthomonadin yang menjadi karakteristik dari genus ini (Bradbury, 1984) dalam Puspitasari
(2014). Koloni bakteri pada media NA berbentuk lingkaran, halus, cembung, tidak tembus
cahaya, dan warna awalnya kuning pucat kemudian berubah warna menjadi kuning jerami.
Koloni mencapai 1-2 mm setelah 5-7 hari dan kelangsungan hidup bakteri pada media padat
pendek.
Xanthomonas glycine
Bakteri berbentuk batang dengan flagel polar, membentuk kapsul, dan tidak
Erwinia carotovora
Koloni berwarna putih susu, berlendir, mengkilat, tepi rata dan tampak cembung
setelah diinkubasi selama 24 jam. Bakteri E. carotovora berwarna bening sampai putih susu,
mengkilat, bulat dan bertepi rata (Sallytha et al., 2014).
Ralstonia solanacearum
Jika bakteri ditumbuhkan pada medium YPA ditambah tetrazolium salt dan diinkubasi
selama 24 jam maka akan terlihat koloni berwarna putih, fluidal dengan pusat koloni
berwarna merah jambu (Nasrun 2005). Tipe koloni ini merupakan koloni R. solanacearum
virulen (Hayward 1994).
Xanthomonas oryzae
Bakteri Xoo mempunyai ciri-ciri berupa sel berbentuk batang pendek, tidak
membentuk spora dan bisa bergerak (motil) dengan 1 flagel. Sel-sel individu ukurannya
bervariasi dengan panjang sekitar 0,7 m-2,0 m dan lebar sekitar 0,4 m-0,7 m. Bakteri ini
termasuk gram negatif (Bradbury, 1984) dalam Puspitasari (2014).
Xanthomonas glycine
Morfologi bakteri ini berbentuk batang dengan flagellum polar, bersifat aerobic
dengan ukuran 0.4-0.9 x 0.6-2.6 m . Membentuk kapsula, tidak menghasilkan spora. Biakan
yang dihasilkan memiliki warna putih kekuningan, berbentuk bundar, permukaan tepi halus
serta berlendir. Hampir semuanya monotrichus, bersifat gram negative yaitu bakteri yang
tidak dapat diberi warna atau menyerap warna oleh pewarna crystal violet (pewarna gram),
menyebabkan nekrose (kematian jaringan setempat) pada tumbuhan monokotil dan dikotil
(NurAinun, 2011).
Erwinia carotovora
Sel
bakteri
berbentuk
batang
dengan
ukuran
(1,5x2,0)x(0,6x0,9)
mikron,umumnya membentuk rangkaian sel-sel seperti rantai, tidak mempunyai kapsul, dan
tidak berspora. Bakteri bergerak dengan menggunakan flagella yang terdapat di keliling
bakteri. Erwinia carotovora adalah bakteri bergram negatif, berbentuk batang yang hidup
soliter atau berkelompok dalam pasangan atau rantai. Merupakan bakteri tanpa spora
berflagella. Batkeri ini termasuk jenis fakultatif anaerob (Astuti, 2012).
Ralstonia solanacearum
Ralstonia solanacearum berbentuk batang, bersifat gram negatif, aerob, tidak
berspora, bergerak dengan satu flagel di kutub, berukuran 0,5-0,7 x 1,5-2,0 m, bereaksi
negatif terhadap hidrolisis pati, gelatin, arginin, dan produksi levan, dan bereaksi positif
terhadap uji katalase, oksidase, akumulasi poly-hydroxybutyrate (PHB) dan denitrifikasi.
Bakteri dapat tumbuh pada NaCl 2% dengan pH 4-8,5 dengan suhu 13 - 37 C, sedangkan
pada suhu 41 C bakteri tidak dapat tumbuh. Bakteri tidak mengeluarkan pigmen fluoresen
(Nasrun 2005).
Xanthomonas oryzae
Gejala yang ditimbulkan oleh bakteri ini tergolong khas, yaitu mulai dari
terbentuknya garis basah pada helaian daun yang akan berubah menjadi kuning kemudian
putih. Gejala ini umum dijumpai pada stadium anakan, berbunga, dan pemasakan. Serangan
penyakit pada tanaman yang masih muda dinamakan kresek, yang dapat menyebabkan daun
berubah menjadi kuning pucat, layu, dan kemudian mati. Kresek merupakan bentuk gejala
yang paling merusak (Wahyudi et al., 2011).
Xanthomonas glycine
Gejala awal berupa bercak kecil berwarna hijau pucat, tampak pada kedua permukaan
daun, menonjol pada bagian tengah lalu menjadi bisul warna coklat muda atau putih pada
permukaan bawah daun. Gejala ini sering dikacaukan dengan penyakit karat kedelai. Tetapi
bercak karat lebih kecil dan sporanya kelihatan jelas. Bercak bervariasi dari bintik kecil
sampai besar tak beraturan, berwarna kecoklatan. Bercak kecil bersatu membentuk daerah
nekrotik yang mudah robek oleh angin sehingga daun berlubang-lubang. Pada infeksi berat
menyebabkan daun gugur (Hasna, 2011).
Erwinia carotovora
Gejala yang umum pada tanaman kubis-kubisan adalah busuk basah, berwarna coklat
atau kehitaman, pada daun, batang, dan umbi. Pada bagian terinfeksi mula-mula terjadi
bercak kebasahan. Bercak membesar dan mengendap (melekuk), bentuknya tidak teratur,
coklat tua kehitaman. Jika kelembaban tinggi, jaringan yang sakit tampak kebasahan,
berwarna krem atau kecoklatan, dan tampak agak berbutir-butir halus. Di sekitar bagian yang
sakit terjadi pembentukan pigmen coklat tua atau hitam (Astuti, 2012).
Ralstonia solanacearum
Penyakit layu bakteri di tandai dengan gejala daun layu dan diakhiri kematian dalam
waktu singkat. Kelayuan terjadi pada tanaman muda dan tua (dari cabang ke cabang secara
tidak teratur). Gejala awal terlihat daun layu pada salah satu daun pucuk dan diikuti dengan
daun bagian bawah. Setelah terlihat gejala lanjut dengan intensitas penyakit diatas 50% ,
tanaman akan mengalami kematian dalam waktu 7-25 hari. Pada gejala serangan lanjut
terjadi pembusukan akar dan pangkal batang dengan terlihat adanya massa bakteri berwarna
kuning keputihan seperti susu yang merupakan ciri khas dari serangan bakteri (Nasrun 2005).
3. Identifikasi Bakteri
a.
Isolasi
Menurut Mahatmi (2008).
mikroba sangat kecil, sehingga untuk melakukan isolasi sangat sulit. Salah satu cara untuk
melakukan isolasi adalah dengan menggoreskan suspensi campuran sel pada permukaan
media padat dalam cawan petri, kemudian menginkubasinya. Dengan cara ini setiap sel akan
tumbuh membentuk koloni. Sehingga akan mudah untuk memisahkannya.
Menurut Mahatmi (2008). Ada beberapa teknik goresan yang dapat dilakukan untuk
mendapatkan hasil yang baik, yaitu:
1. Streak Culture.
Pada teknik ini dibuat beberapa garis goresan terputus dengan ose pada permukaan
agar.
2. Streak Dilution Technique.
Teknik ini sangat baik untuk mendapatkan koloni tunggal terpisah sehingga dapat
digunakan untuk mengamati morfologi koloni dan untuk keperluan mendapatkan
kultur murni untuk kultivasi.
3. Spot Inoculation.
Teknik ini biasanya dilakukan pada media padat dalam tabung reaksi.
4. Lawn Culture.
Pada teknik ini mikroba disebarkan pada permukaan medium dengan cara
menempatkan inokulum pada permukaan medium dengan menggunakan pipet
kemudian disebarkan dengan menggunakan spreader (gelas bengkok), seperti pada
perhitungan jumlah sel mikroba.
mikroorganisme
dalam
satu
media,purifikasi
ini
dilakukan
untuk
c.
Uji Patogenisitas
Isolat bakteri yang menunjukkan reaksi hipersensitif diambil beberapa nomor isolate
untuk diuji patogenisitasnya pada tanaman inangnya. Inokulasi bakteri dilakukan dengan
memasukkan suspense bakteri dengan kepekatan populasi bakteri 108 sel/ml dengan
menggunakan jarum inokulasi pada pangkal batang tanaman inang yang sehat. Masingmasing perlakukan diulangi 3 kali dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL).
Perkembangan gejala diamati dua minggu kemudian dengan mencatat waktu muncul gejala
peyakit layu bakteri. Isolate bakteri yang paling virulen ditentukan berdasarkan gejala
penyakit (Lelliot dan Stead.1987).
d. Uji Hipersensitif
Pengujian reaksi hipersensitif dilakukan denga menyuntikkan suspense bakteri ke dalam
daun tembakau (Klement et al., 1990). Perkembangan gejala klorosis layu daun tembakau
diamati sampai 7 hari.
e.
Uji Gram
Uji pengecatan gram dimulai dengan meneteskan suspensi bakteri di atas preparat dan
dikeringanginkan diatas Bunsen. Setelah itu ditambahkan Kristal violet dan diamkan selama 20
detik hingga berwarna biru keunguan. Cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan diatas
Bunsen. Kemudian ditambahkan Iodin dan didiamkan selama 20 detik untuk menetralkan.
Setelah itu cuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan diatas Bunsen. Kemudian
ditambahkan akohol, dicuci dan dikeringanginkan diatas Bunsen. Setelah itu ditambahkan
safranin sebagai indikator warna merah.Setelah itu cuci dengan air mengalir dan
dikeringanginkan diatas Bunsen. Gram positif menunjukkan warna ungu dan gram negatif
menunjukkan warna merah (Klement et al., 1990).
f.
Uji Oksidatif-Fermentatif
Bakteri yang bersifat gram negatif diuji pertumbuhannya secara anaerob dengan
menginokulasikan bakteri dalam media sebanyak 5 ml dalam tabung reaksi dan dilapisi
dengan waer agar. Media terdiri atas: pepton 2 gram, NaCl 5 gram, KH2PO4 0,3 gram,
Bromothymol blue 1% 3 ml. Bahan-bahan dilarutkan dalam aquades 1 liter dan diatur pada
pH 7,1. Media disterilisasi pada 121C selama 20 menit. Setelah disterilisasi, setiap tabung
ditambahkan larutan glukosa 10% sebanyak 0,5 ml.
Pengujian dilakukan dengan menggunakan 2 tabung reaksi, salah satu tabung ditutup
dengan water agar steril sebanyak 2 ml, sedangkan tabung lain tanpa water agar. Pada tabung
tanpa water agar reaksi positif terjadin jika warna media dari biru menjadi kuning hal tersebut
menunjukkan bakteri dapat tumbuh secara aerob. Sedangkan pada tabung yang diberi parafin
reaksi positif terjadi jika tidak adanya perubahan warna dari biru menjadi kuning hal tersebut
menunjukkan bakteri tidak dapat tumbuh secara anaerob (Klement et al., 1990).
g.
Uji KOH
KOH 3% diteteskan di preparat. Kemudian isolat bakteri endofit diletakkan diatas larutan
KOH yang telah diteteskan di preparat. Setelah itu diratakan dengan jarum ose. Kemudian
jarum ose diangkat dan diamati larutan berlendir atau tidak. Jika berlendir menandakan
bahwa bakteri tersebut termasuk gram negatif dan tidak berlendir termasuk gram positif
(Klement et al., 1990).
h. Uji Katalase
Pengujian dilakukan dengan larutan H2O2. Larutan H2O2 dituang ke dalam tabung reaksi
sebanyak 2 ml kemudian satu jarum ose bakteri uji dimasukkan ke dalam larutan tersebut.
Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung oksigen sedangkan reaksi
negatif tidak terbentuk gelembung (Klement et al., 1990).
Bahan:
1. PDA
2. Spiritus
3. Aquades steril
4. Alkohol 70%
5. Tissue steril
6. Tanaman tembakau
7. Biakan murni bakteri: Xanthomonas oryzae, Xanthomonas glycine, Erwinia
carotovora, Ralstonia solanacearum
8. Kristal violet
9. Iodin
10. Safranin
11. KOH
12. Larutan H2O2
c.
Metode pelaksanaan
Pengenalan gejala
Amati gejala sampel tanaman berpenyakit dengan mata
telanjang, lup atau mikroskop stereo
Pengamatan pada bagian tanaman yang diserang, bentuk ukuran,
warna gejala dan ada tidaknya water soak.
Daun
Dipotong kecil-kecil
Pembuatan media
Mempersiapkan alat dan bahan
Melarutkan 250 ml air + 7 gr NA
Masak hingga mendidih
Sterilisasi
Jaringan tanaman
Suspensi pathogen
Purifikasi patogen
Uji hipersensitif
Buat suspense dari hasil purifikasi
Uji patogenisitas
Buat suspense dari hasil purifikasi patogen
Identifikasi bakteri
Uji gram
Gelas objek + suspensi
Di keringkan dibawah bunsen
Kristal violet (1 menit)
Cuci dan kering anginkan
Iodine (1 menit)
Cuci + kering angin
Larutan safranin
Cuci + keringangin
Mikroskop
Uji oksidatif-fermentatif
Pepton 2 gr, NaCl 5 gr, KH2PO4 0.3 gr, Agar 3 gr, bromotimol blue
Media bassa dilarutkan dalam 100 ml air
Cek pH 7,1, tuang media ke tabung reaksi 5 ml
Sebelum sterilisasi + glukosa 10% (5ml)
Sterilisasi
Inokulasi bakteri ke 2 tabung (paraffin (2 ml) dan non parafin
Inkubasi 4-7 hari
Amati perubahan warna
Uji KOH
Bakteri berumur 48 jam diletakkan diatas gelas objek steril
Uji katalase
Bakteri berumur 48 jam diletakkan diatas gelas objek steril
IV. PEMBAHASAN
a.
sakit, dapat diketahui bahwa tanaman sakit yang benar-benar menunjukkan gejala penyakit
yang dikehendaki adalah: Erwinia carotovora dan Xanthomonas glycine. Gejala Erwinia
carotovora tampak ada umbi wortel dengan ciri-ciri tanaman tampak busuk berlendir dan
menunjukkan perubahan warna menjadi coklat kehitaman. Menurut Astuty (2012), pada
bagian terinfeksi mula-mula terjadi bercak kebasahan. Bercak membesar dan mengendap
(melekuk), bentuknya tidak teratur, coklat tua kehitaman. Jika kelembaban tinggi, jaringan
yang sakit tampak kebasahan, berwarna krem atau kecoklatan, dan tampak agak berbutirbutir halus. Di sekitar bagian yang sakit terjadi pembentukan pigmen coklat tua atau hitam.
Sedangkan gejala serangan Xanthomonas glycine ditemukan pada tanaman kedelai dengan
ciri-ciri tanaman yang terserang timbul adanya pustul/bisul berwarna coklat hijau kehitaman.
Gejala yang parah menyebabkan tanaman mudah sobek.
Menurut Hasna (2011), gejala awal berupa bercak kecil berwarna hijau pucat, tampak
pada kedua permukaan daun, menonjol pada bagian tengah lalu menjadi bisul warna coklat
muda atau putih pada permukaan bawah daun. Gejala ini sering dikacaukan dengan penyakit
karat kedelai. Tetapi bercak karat lebih kecil dan sporanya kelihatan jelas. Bercak bervariasi
dari bintik kecil sampai besar tak beraturan, berwarna kecoklatan. Bercak kecil bersatu
membentuk daerah nekrotik yang mudah robek oleh angin sehingga daun berlubang-lubang.
Pada infeksi berat menyebabkan daun gugur.
Gejala dan tanda pada tanaman sakit berikutnya adalah Xanthomonas oryzae dan
Ralstonia solanacearum. Namun, selama praktikum gejala yang disebabkan patogen ini tidak
ditemukan di lapang sehingga terjadi kekeliruan dalam pengambilan sampel. Wahyudi et
a.,(2011) menyebutkan bahwa gejala yang ditimbulkan oleh bakteri ini tergolong khas, yaitu
mulai dari terbentuknya garis basah pada helaian daun yang akan berubah menjadi kuning
kemudian putih. Gejala ini umum dijumpai pada stadium anakan, berbunga, dan pemasakan.
Serangan penyakit pada tanaman yang masih muda dinamakan kresek, yang dapat
menyebabkan daun berubah menjadi kuning pucat, layu, dan kemudian mati. Kresek
merupakan bentuk gejala yang paling merusak. Sedangkan pada Ralstonia solanacearum
gejala awal terlihat daun layu pada salah satu daun pucuk dan diikuti dengan daun bagian
bawah. Setelah terlihat gejala lanjut dengan intensitas penyakit diatas 50% , tanaman akan
mengalami kematian dalam waktu 7-25 hari. Pada gejala serangan lanjut terjadi pembusukan
akar dan pangkal batang dengan terlihat adanya massa bakteri berwarna kuning keputihan
seperti susu yang merupakan ciri khas dari serangan bakteri (Nasrun 2005).
Hasil isolasi
Nama Patogen
Erwinia carotovora
Dokumentasi
Xanthomonas campestris
Xanthomonas oryzae
Xanthomonas glycine
Hasil purifukasi
Nama Patogen
Erwinia carotovora
Xanthomonas campestris
Dokumentasi
Xanthomonas oryzae
Xanthomonas glycine
Berdasarkan hasil pengamatan isolasi dan purifikasi, semua isolat yang telah dibiakkan
pada media NA menunjukkan hasil adanya kontaminasi mikroba lain yang tidak dikehendaki.
Hal ini disebabkan karena selama proses isolasi kondisi lingkungan yang tidak steril, begitu
pula dalam penyimpanan. Karena adanya kontaminasi pada semua isolat, maka dilakukan
isolasi dan purifikasi ulang oleh asisten, sehingga didapatkan jenis-jenis patogen:
Xanthomonas glycine, Xanthomonas oryzae, Xanthomonas campestris, dan Ralstonia
solanacarum.
Sementara, Puspitasari (2014) menyebutkan bahwa koloni Xanthomonas oryzae pada
media NA berbentuk lingkaran, halus, cembung, tidak tembus cahaya, dan warna awalnya
kuning pucat kemudian berubah warna menjadi kuning jerami. Bakteri Xanthomonas glycine
berbentuk batang dengan flagel polar, membentuk kapsul, dan tidak membentuk spora.
Erwinia carotovora koloni berwarna putih susu, berlendir, mengkilat, tepi rata dan tampak
cembung setelah diinkubasi selama 24 jam. Bakteri E. carotovora berwarna bening sampai
putih susu, mengkilat, bulat dan bertepi rata (Sallytha et al., 2014). Sedangkan koloni
Ralstonia solanacarum berwarna putih, fluidal dengan pusat koloni berwarna merah jambu
(Nasrun 2005).
c.
Hasil Identifikasi
Uji patogenisitas
Nama Patogen
Erwinia carotovora
Dokumentasi
Ralstonia solanacearum
Xanthomonas glycine
setelah inokulasi bakteri. Sedangkan pada kedelai ditandai adanya luka kuning kecoklatan
bada bagian yang diinokulasi. Luka pada daun ini menyebar dan mudah sobek.
Uji hipersensitif
Hari ke1 hsi
2 hsi
3 hsi
4 hsi
5 hsi
Dokumentasi
6 hsi
7 hsi
Uji hipersensitif dilakukan dengan cara menginfeksi daun tembakau dengan suspensi
bakteri dan mengamati gejala yang timbul selama 24-48 jam. Apabila timbul gejala
hipersensitif atau nekrosis berarti bakteri patogen tersebut virulen, sedangkan apabila klorosis
muncul setelah 3 hari, maka bakteri tersebut adalah saprofit.
Uji hipersensitif adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui patogenesitas patogen
(kemampuan patogen dalam menyebabkan penyakit). Teknik pengujian ini dilakukan dengan
cara menginokulasikan suspensi patogen pada tanaman sukulen muda kemudian
menginkubasikan tanaman tersebut dalam suhu yang sesuai (Schaad, dkk., 2000). Suswanto
dkk. (1996) menggunakan tanaman tembakau sebagai tanaman indikator untuk uji
hipersensitif. Dalam uji ini, respon hipersensitif ditunjukkan dengan terjadinya pencoklatan
daun pada daerah yang diinokulasi bakteri yang diakibatkan kematian lokal jaringan daun
(nekrosis).
Berdasarkan hasil praktikum, gejala nekrosis timbul setelah 1 hari setelah inokulasi
pada daun tembakau untuk bakteri Xanthomonas oryzae dan Ralstonia solanacearum. Hal ini
menunjukkan bahwa suspensi bakteri yang diinokulasikan merupakan bakteri patogen yang
bersifat virulen. Sedangkan bakteri Erwinia carotovora tidak menimbulkan gejala nekrosis
pada tembakau yang menunjukkan bahwa bakteri ini bukan merupakan patogen, melainkan
bakteri saproba.
Uji gram
Nama Patogen
Erwinia carotovora
Dokumentasi
Ralstonia
solanacearum
Xanthomonas glycine
Hasil uji gram menunjukkan bahwa semua bakteri patogen (Erwinia carotovora,
Ralstonia solanacearum, dan Xanthomonas glycine) tergolong bakteri gram negatif yang
ditandai warna merah pada bakteri. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri gram negatif tersusun
atas peptidoglikan yang tipis. Pada bakteri Ralstonia solanacearum bentuk bakteri basil,
begitu pula pada Xanthomonas glycine. Berdasarkan literatur, Morfologi bakteri
Xanthomonas glycine berbentuk batang dengan flagellum polar, bersifat aerobic dengan
ukuran 0.4-0.9 x 0.6-2.6 m. Membentuk kapsula, tidak menghasilkan spora. Hampir
semuanya monotrichus, bersifat gram negative yaitu bakteri yang tidak dapat diberi warna
atau menyerap warna oleh pewarna crystal violet (pewarna gram) (NurAinun, 2011).
Ralstonia solanacearum berbentuk batang, bersifat gram negatif, aerob, tidak berspora,
bergerak dengan satu flagel di kutub, berukuran 0,5-0,7 x 1,5-2,0 m, bereaksi negatif
terhadap hidrolisis pati, gelatin, arginin, dan produksi levan, dan bereaksi positif terhadap uji
katalase, oksidase, akumulasi poly-hydroxybutyrate (PHB) dan denitrifikasi (Nasrun 2005).
Sedangkan pada Erwinia carotovora bakteri berbentuk coccus. Hal ini berlawanan
dengan literatur yang menyebutkan bahwa Erwinia carotovora adalah bakteri bergram
negatif, berbentuk batang yang hidup soliter atau berkelompok dalam pasangan atau rantai.
Merupakan bakteri tanpa spora berflagella. Batekeri ini termasuk jenis fakultatif anaerob
(Astuti, 2012). Perbedaan antara hasil pengamatan dengan studi literatur dapat diduga bahwa
isolat bakteri yang diambil bukan merupakan bakteri Erwinia carotovora yang dikehendaki,
atau juga dapat disebabkan oleh adanya kontaminan dari bakteri lain.
Uji oksidatif-fermentatif
Sebelum inkubasi
Bakteri
WA
Tanpa WA
Erwinia carotovora
kontaminasi
Kuning
Xanthomonas glycine
Kuning
Kuning
Ralstonia solanacearum
Kontaminasi
Kuning
Kontrol
kontaminasi
Tanpa perubahan
Pengujian dilakukan dengan menggunakan 2 tabung reaksi, salah satu tabung ditutup
dengan water agar steril sebanyak 2 ml, sedangkan tabung lain tanpa water agar. Pada tabung
tanpa water agar reaksi positif terjadin jika warna media dari biru menjadi kuning hal tersebut
menunjukkan bakteri dapat tumbuh secara aerob. Sedangkan pada tabung yang diberi parafin
reaksi positif terjadi jika tidak adanya perubahan warna dari biru menjadi kuning hal tersebut
menunjukkan bakteri tidak dapat tumbuh secara anaerob (Klement et al., 1990).
Berdasarkan hasil pengujian, menunjukkan bahwa Erwinia carotovora menghasilkan
warna kuning pada medium tanpa water agar, sedangkan pada medium water agar terjadi
kontaminasi sehingga belum diketahui secara pasti apakah bakteri ini termasuk aerob atau
anaerob. Menurut Astuti (2012), batekeri ini termasuk jenis fakultatif anaerob.
Bakteri Xanthomonas glycine menghasilkan warna kuning pada medium water agar,
sedangkan pada medium water agar terjadi kontaminasi sehingga belum diketahui secara
pasti apakah bakteri ini termasuk aerob atau anaerob. NurAinun (2011), menyebutkan bahwa
bakteri Xanthomonas glycine tergolong ke dalam bakteri aerob.
Sedangkan pada Ralstonia solanacearum menghasilkan warna kuning pada kedua
medium water agar dan tanpa water agar. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri ini tergolong
anaerob. Namun, hail ini bertentangan dengan Nasrun (2005) yang menjelaskan bahwa
Ralstonia solanacearum berbentuk batang, bersifat gram negatif, aerob, tidak berspora.
Uji KOH 3%
Nama Patogen
Dokumentasi
Keterangan
Erwinia
carotovora
Ralstonia
solanacearum
benang lendir.
benang lendir.
Xanthomonas
glycine
Menghasilkan benang-benang
lendir.
Uji KOH bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri mampu mengikat KOH atau
tidak. KOH 3% diteteskan di preparat. Kemudian isolat bakteri endofit diletakkan diatas
larutan KOH yang telah diteteskan di preparat. Setelah itu diratakan dengan jarum ose.
Kemudian jarum ose diangkat dan diamati larutan berlendir atau tidak. Jika berlendir
menandakan bahwa bakteri tersebut termasuk gram negatif dan tidak berlendir termasuk
gram positif (Klement et al., 1990).
Berdasarkan hasil uji KOH 3%, dapat diketahui bahwa bakteri Xanthomonas glycine
bereaksi positif terhadap KOH yang ditandai adanya benang-benang lendir pada saat ose
diangkat. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri ini merupakan bakteri gram negatif. Sedangkan
bakteri Erwinia carotovora dan Ralstonia solanacearum tidak menghasilkan benang-benang
lendir yang menunjukkan bahwa kedua bakteri ini bereaksi negatif terhadap KOH, sehingga
dapat digolongkan dalam bakteri gram positif berdasarkan uji KOH 3%.
Uji katalase
Nama Patogen
Dokumentasi
Keterangan
Erwinia
carotovora
Bakteri menghasilkan
Ralstonia
solanacearum
Bakteri menghasilkan
gelembung.
gelembung.
Xanthomonas
glycine
Bakteri menghasilkan
gelembung.
Menurut Klement et al., (1990), pengujian katalase dilakukan dengan larutan H2O2.
Larutan H2O2 dituang ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml kemudian satu jarum ose bakteri
uji dimasukkan ke dalam larutan tersebut. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya
gelembung-gelembung oksigen sedangkan reaksi negatif tidak terbentuk gelembung.
Berdasarkan
hasil
praktikum,
ketiga
bakteri
(Erwinia
carotovora,
Ralstonia
V.
SIMPULAN
Berdasarkan hasil pengamatan gejala dan tanda yang ditemukan pada tanaman yang
sakit, dapat diketahui bahwa tanaman sakit yang diisolasi adalah: Erwinia carotovora,
Xanthomonas glycine, Ralstonia solanacearum, dan Xanthomonas oryzae.
Hasil uji patogenisitas pada 3 tanaman inang (kentang, kedelai, dan tomat), ketiga
tanaman tersebut menunjukkan gejala tanaman sakit yang sesuai dengan tanaman hasil
isolasi. Uji hipersensitif pada tembakau menunjukkan adanya gejala nekrosis timbul setelah 1
hari setelah inokulasi pada daun tembakau untuk bakteri Xanthomonas oryzae dan Ralstonia
solanacearum. Hal ini menunjukkan bahwa suspensi bakteri yang diinokulasikan merupakan
bakteri patogen yang bersifat virulen. Sedangkan bakteri Erwinia carotovora tidak
menimbulkan gejala nekrosis pada tembakau yang menunjukkan bahwa bakteri ini bukan
merupakan patogen, melainkan bakteri saproba.
Uji gram pada ketiga isolat menunjukkan bahwa semua bakteri yang diidentifikasi
merupakan bakteri gram negatif. Hasil uji KOH 3% menunjukkan reaksi positif pada
Xanthomonas glycine, sedangkan Ralstonia solanacearum dan Erwinia carotovora
menunjukkan reaksi negatif. Uji katalase menunjukkan reaksi positif pada ketiga isolat. Hasil
uji oksidatif-fermentatif dapat diketahui bahwa bakteri Erwinia carotovora merupakan
kelompok bakteri anaerob yang sesuai dengan literatur. Untuk bakteri Ralstonia
solanacearum menunjukkan hasil anaerob yang bertentangan dengan literatur yang
menyebutkan bahwa bakteri ini merupakan kelompok bakteri aerob. Sedangkan
Xanthomonas glycine merupakan bakteri aerob.
DAFTAR PUSTAKA
Abadi, Abdul Latief. 2003. Ilmu Penyakit Tumbuhan. Malang: Bayumedia Publishing
Amrullah, Isa. 2008. Uji Potensi Daun Sirih Sebagai Antimikroba Terhadap Bakteri
Xanthomonas oryzae dan Jamur Fusarium oxysporum (skripsi). Malang: Universitas
Islam Negeri Malang
Anonima.
2015.
Basisdata
Hama
dan
Penyakit
Tanaman
(online).
siti.
2013.
Pengendalian
R.
Solanacearum
(online).
Qolamul.
2011.
Macam-macam
Penyakit
Kedelai
(online).
http://planthospital.blogspot.com/2011/08/macam-macam-penyakit-kedelai_260.html.
Diakses: 18-05-2015
Hayward, A.C. 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related
bacteria. p. 123135. In A.C. Hayward and G.L. Hartman (Eds.). Bacterial Wilt. The
disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum. CAB International
Jawetz, Melnick, dan Adelbergs. 2004. Mikrobiologi Kedokteran, Ed 23, Penerbit Buku
Kedokteran EGC, Jakarta, page 233, 235.
Lelliot, R. A. an D.E. Stead.1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plant.
Methods in Plant Pathology, British Society for Plant Pathology. Blackweel Scientific
Publications (2) p 212. Dalam Nasrun dkk. 2003. Karakteristik Fisiologis Ralstonia
solanacearum Penyebab Layu Bakteri Nilam. Jurnal Littri 13 (2).
Mahatmi, Hapsari. 2008. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Veteriner I Fakultas Kedokteran
Hewan. Denpasar : Universitas Udayana.
Nasrun, Christanti, T. Arwiyanto, dan I. Mariska. 2005. Pengendalian Penyakit Layu Bakteri
Nilam Menggunakan Pseudomonas fluoresen. Jurnal Penelitian Tanaman Industri 11
(1): 19-24.Persley et al., 1985
NurAinun.
2011.
Pengendalian
Hayati
dan
Pengelolaan
Morfologi,
Xhantomonas
Habitat
Fisiologi
axonopodis
glycine
dan
Rhizobakteria
(Rizosfer,
Rizoplan,
Dan
Endofitik)
(online).