LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI TUMBUHAN

UJI SEROLOGI Dot Immuno Binding Assay (DIBA) Tobacco

Mosaic Virus (TMV) pada TANAMAN TEMBAKAU
(Nicotiana tabacum) dan Bean Common Mosaic Virus (BCMV)
pada TANAMAN KACANG PANJANG (Vigna sinensis)

CHEPPY WATI

A362190061

Dosen Pengampu Mata Kuliah:

Dr. Ir. Tri Asmira Damayanti, M. Agr

PROGRAM STUDI FITOPATOLOGI

SEKOLAH PASCA SARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2019
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Ada beberapa metode yang digunakan dalam uji serologi antara lain
Agarose gel precipitation test (AGPT), Dot blot immunobinding assay (DIBA),
Tissue blot immunosorbent assay (TBIA), Enzyme linked immunosorbent assay
(ELISA), dan immunoblotting (Harlow and Lane 1999). Metode serologi yang
telah berhasil dikembangkan untuk mendeteksi virus tumbuhan yaitu metode
DIBA. DIBA merupakan uji serologi menggunakan membran Nitropure
nitrocellulose (NPN) yang sangat efektif mendeteksi dan mendiagnosa virus
tanaman. Teknik ini menggunakan gerusan tanaman segar dan diblot pada kertas
membran (Lin et al. 1990). Metode ini mempunyai tingkat sensitivitas yang
tinggi, prosedur yang digunakan sangat sederhana dan dapat digunakan untuk
deteksi rutin dengan jumlah sampel yang banyak (Dijkstra and De Jager 1998).
Reaksi antara antibodi dan antigen terjadi pada reaksi pertahanan hewan
apabila kemasukan antigen (patogen atau benda asing). Sifat khas reaksi antibodi
dan antigen dimanfaatkan sebagai alat identifikasi patogen dan diagnosis penyakit
virus pada tanaman. Secara umum, reaksi serologi dapat digambarkan dengan
antibodi + antigen presipitasi (Akin 2006). Selain untuk mendeteksi dan
mengidentifikasi virus penyebab penyakit, uji serologi juga berguna dalam
mengukur konsentrasi virus dalam jaringan tumbuhan, mendeteksi virus
tumbuhan dalam tubuh serangga vektor dan untuk mengetahui hubungan
kekerabatan antar virus (Agrios 2005).
Praktikum ini mempelajari tentang teknik dan prinsip kerja dari DIBA
dalam memdeteksi TMV dalam jaringan tanaman.
Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah mempelajari tentang teknik dan prinsip
kerja dari DIBA dalam memdeteksi TMV dan BCMV dalam jaringan tanaman
dan pengujian serologi DIBA .
 BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Adapun waktu dilaksanakan praktikum adalah pada hari Kamis tanggal 31-
Oktober 2019. Tempat dilaksanakan praktikum di Laboratorium Virologi
Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian, Institut Pertanian
Bogor (IPB).
Alat dan Bahan
Alat:
Alat yang digunakan dalam kegiatan praktikum ini antaralain:
1. Kuas,
2. Kamera HP dan
3. shaker,
4. Pipet tetes.

Bahan:
Sedangakan bahan yang digunakan dalam praktikum ini antaralain:
a. Daun kacang panjang terinfeksi BCMV (0.1 g),
b. Daun tembakau yang yang terifeksi TMV,
c. kontrol negatif (daun bayam),
d. Antiserum Universal Potyvirus (1st dan 2nd universar antiserum GAR-AP:
goat anti rabbit-Alkalin posfatase),
e. sarung tangan,
f. tisu,
g. Tris buffer saline 0,02M [TBS: Tris-HCL 0.15 M, NaCl di dalam 100 ml
aquades pada pH 7,5 dengan perbandingan 1:10 (b/v)] blocking non fat milk,
Triton-100 2%,
h. Tween 20.
i. Antibodi sekunder (AbS),
j. Sigma.
k. Alkalin phosphatase buffer pH9.5 (Tris-HCl 0.1M, NaCl 0.1M dan MgCl2
5mM) dalam aquades steril).
l. membran Nitropure nitrocellulose,

Metode Kerja
Metode yang dilakukan pada praktikum ini melalui beberapa tahap:
1. Potong kertas membran nitroselulosa sesuai dengan banyaknya sample dan
letakan diatas kertas membran nitroselulos ( gunakan sarung tangan
selama proses blotting).
 2. Geus sampel yang (sakit dan sehat) dengan buffer TBS-TRIS Buffer saline
(0.02M Tris HCl,0.15 M NaC, PH 7.5) (1:10 b/v)
3. Setalah blotting membrane dikeringkan.kemudian, inkubasi membrane
kedalam buffer TBS yang mengandung 2% skim milkj dan Triton-100 2%
( volume tergantantung ukuran kertas membrane)dishaker pada 100 rpm
selama 1-2 jam sampai warna hijau daun menghilang.
4. Buang buffer (no 5), cuci membrane dentan aquades selama 5x (@ 5 min)
sambil di shaker pad 100 rpm.
5. Rendam membran dalam buffer TBS yang mengandung 2% skim milk
yang didalamnya diberi antiserum pertama tmv (1:5000), inkubasi
semalaman pada suhu ruang, di shaker pada kecepatan50 rpm.
6. Cuci membrane 5x, degan membrane TBST (TBS + 0.05% tween 20)
7. Rendam membrane dalam buffer TBS yang mengandung 2% skim milk
yang didlamnya diberi universal antiserum kedua (GAR-AP) (1:5000)
selama 1 jam pada suhu ruang, dioshaker pada kecepatan 50 rpm.
8. Cuci membran 5x dengan buffer TBST (TBS + 0.05% tween 20).
9. Rendam membran dalam buffer AP pH 9.5 (Tris-HCl 0.1M, NaCl 0.1M,
MgCl2 5Mm) yang diberi Nitrobluetetrazolim-NBT (75 mg/ml), dan 5-
bromo-4choloro-3-inbody-Phosfat –BCIM (50 mg/ml) (10 ml buffer AP+
35 ul BCIP + 45 ul NBT untuk 20 cm 2 membran nitroselulose). Inkubasi
pada suhu ruang/incubator suhu 37 oc dalam kondisin gelap. Cek
perubahan warna dot blot sampai menunjukan warna ungu.
10. Jika telah terjadi perubhan warna ungu pada sampel yang mengandung
virus, maka reaksi dihentikan dengan mencuci membrane dengan air
destilata, lalu biarkan kering.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengujian DIBA memiliki banyak persamaan dengan ELISA diantaranya

melibatkan Antibodi, Imunoprob, Antigen dan reagen lainnya. Praktikum uji
serologi dengan DIBA menggunakan virus TMV sebagai objek yang akan
dideteksi. Prinsip DIBA yang digunakan yaitu sama dengan direct ELISA,
artinya hanya menggunakan satu Antibogi sekunder (AbS) yang mengenali
antigen dan telah di labeli dengan enzim. Berdasarkan hasil pengujian Gambar.
Terlihat bahwa dari semua sampel, positif terdeteksi TMV dengan kontrol negatif
berfungsi normal. Negatif kontrol yang digunakan adalah banyam, pemilihan
bayam sebagai kontrol negatif dikarenakan diduga tidak banyak mengandung
senyawa polifenol yang menyulitkan dalam proses pencucian. Kandungan
senyawa polifenol yang tidak tercuci sempurna akan ikut bereaksi sehingga akan
nampak ungu pada hasil akhir pengujian.
Pada DIBA, perubahan warna membran menjadi ungu terjadi pada tempat
cairan perasan tanaman terinfeksi, yaitu TMV dan BCMV, sedangkan pada
tempat cairan perasan tanaman sehat diteteskan tidak terlihat adanya perubahan
warna menjadi ungu (Gambar 1). Bila dilihat pada daerah membran yang ditetesi
cairan perasan tanaman sehat ditemukan bahwa tidak terjadinya perubahan warna
menjadi ungu di tempat tersebut. Seperti yang terjadi pada TMV dan BCMV,
peristiwa ini menandakan bahwa antiserum hanya dapat berikatan dengan CP
TMV dan BCMV (dalam bentuk partikel virus) dan tidak dengan protein lain.
Kemampuan membedakan antara partikel TMV dan BCMV dengan komponen
tanaman mencerminkan kespesifikan dari antiserum ini.

1 2 3 4 5 6 7

A
B
C

Gambar 1. Reaksi antiserum SAP Tanaman bayam sebagai Kontrol (-) sample A,
BCMV sampel B, TMV sampel C pada Dot immonobinding assay.

Metode DIBA dilakukan berdasarkan metode Mahmood et al. (1997),

menggunakan membran nitroselulosa. Pada gambar 1 diatas terlihat jelas bahwa
pada membran nitroselulosa pada sampel B menunjukan wakna ungu, ini berarti
sampel tersebut memberikan reaksi positif yang ditandai dengan adanya
perubahan warna ungu pada membrane tersebut (Gambar 1). Perubahan warna
membran menjadi ungu pada DIBA sangat terlihat jelas pada sampel tanaman
yang terinfeksi BCMV dan tidak terjadi pada tanaman terinfeksi TMV dan
tanaman sehat (kontrol). ini diduga terjadi kesalahan saat pengerjaan atau alat
yang error pada saat penggunaan.
Metode DIBA sangat baik mengekspresikan reaksi serologi antiserum
ToCV dan TICV yang diuji. Pengujian DIBA, partikel virus target yang
terkandung dalam sap tanaman sumber virus diimobilisasi pada membran
Nitropure nitrocellulose, kemudian konjuget (yang terkandung dalam antiserum)
yang telah dilabeli enzin avidin akan berikatan dengan partikel virus pada epitope
yang dikenalinya sehingga terjadi rantai ikatan virus-AbS. Enzim (yang
dikonjugasikan pada konjugat) kemudian akan merubah warna substrat menjadi
ungu (Lin et al. 1990), substratnya yang digunakan yaitu nitroblue
tetrazolium/bromochloro indoleacetyl phosphate (NBT/BCIP) yang berwarna
ungu pada reaksi positif yang merupakan signal positif untuk DIBA. Reaksi
DIBA, jumlah enzim yang sedikit saja sudah dapat menyebabkan perubahan
warna substrat (Somowiyarjo 1997), sehingga DIBA dianggap metode yang
cukup sensitif.
 Pengenceran anti serum pada DIBA yang digunakan 1:5000 b/v sehingga
sangat hemat. Metode DIBA juga diketahui dapat mendeteksi keberadaan TMV
dan BCMV dalam ekstrak tanaman sakit. Kelebihan dari metode ini adalah
mampu menghemat biaya pengujian sehingga bisa menjadi rujukan dalam
mendeteksi patogen virus. Selain itu kelebihan tersebut ada juga kekuarangan
DIBA yaitu hasil yang diperoleh pada pengujiannya hanya bersifat kualitatif.

SIMPULAN

Metode DIBA menjadi salah satu bagian dalam pengujian untuk

mendeteksi virus dengan sensitivitas yang cukup tinggi. Perubahan warna
membran menjadi ungu pada DIBA sangat terlihat jelas pada sampel tanaman
yang terinfeksi BCMV dan tidak terjadi pada tanaman terinfeksi TMV dan
tanaman sehat (kontrol). Metode ini mempunyai kelebihan dalam penghematan
biaya pengujian dalam mendeteksi patogen virus.

DAFTAR PUSTAKA

Agrios GN. 2005. Plant Pathology. Ed. ke-5. New York (US): Academic Press.
Akin MH. 2006. Virologi Tumbuhan. Yogyakarta (ID): Penerbit Kanisisus
(Anggota IKAPI).
Dijkstra J, de Jager CP. 1998. Pratical Plant Virology. Protocol and Exercises.
New York (US): Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Lin NS, Hsu YH, Hsu HT. 1990. Immunological detection of plant viruses and a
mycoplasma-like organism by direct tissue blotting on nitrocellulose
membranes. Phytophatology. 80(9): 824-828.
Somowiyarjo S, Sumardiyono YB, Suharno. 1997. Pemanfaatan membran
nitroselulosa untuk pengiriman antigen uji dalam deteksi TMV dengan
DIBA.J Perlind Tan Indonesia.3(1):1-5.