GENETIKA BAKTERI

&
REKAYASA GENETIKA
Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran
Universitas Brawijaya

GENETIKA BAKTERI
Teori MENDEL (1900) pengetahuan genetika
berkembang
HEREDITY bentuk tetap yg diturunkan dari satu
generasi ke generasi berikutnya
HERITABLE VARIATION
Yg memegang peranan GENE
- menentukan sifat organisme
- tersusun dlm khromosom
- dpt mengalami mutasi

STRUKTUR & FUNGSI MATERI GENETIK

GENE terdiri atas DNA (deoxyribonucleic acid) yg
menyandi produk-2 fungsional PROTEIN
DNA makromolekul yg tersusun atas nukleotida
setiap nukleotida terdiri atas :
- NITROGENOUS BASE :
- PURINE : Adenine (A), Guanine (G)
- PYRIMIDINE : Cytosine (C), Thymine (T)
- DEOXYRIBOSE
- PHOSPHATE GROUP
Pasangan tetap : A T, G C
menyusun chromosome
DOUBLE HELIX
CELLS GENETIC LIBRARY dng genetic alphabet
4 huruf : A, T, C, G
Gene dng 1000 basa dpt tersusun dng variasi 4 1000
Dapat membawa informasi banyak sekali
DNA E.coli 4 juta bp. 1 mm

STRUKTUR DNA

REPLIKASI DNA
Dua untaian DNA asal double helix akan terpisah satu sama lain
Masing-masing akan membentuk pasangannya sendiri-sendiri
Titik awal pemisahan REPLICATION FORK
Enzim yang berperan :
- DNA polymerase
- DNA ligase
Proses replikasi DNA disebut SEMICONSERVATIVE REPLICATION

REPLIKASI DNA

RNA & SINTESA PROTEIN

DNA

TRANSKRIPSI

RNA

TRANSLASI

PROTEIN

TRANSKRIPSI : sintesa mRNA dng menggunakan bagian tertentu

dari DNA sebagai cetakan
A
T
G
C
A
T
Template DNA

U
A
C
G
U
A
mRNA

Hanya 1 untai DNA yg bertindak sebagai template SENSE STRAND

Untai DNA pasangannya ANTI SENSE STRAND
Enzim yg berperan : RNA-polymerase
Titik Awal Transkripsi Promoter Site
Titik Akhir Transkripsi Terminator Site

PROSES TRANSKRIPSI

TRANSLASI
Proses menggunakan informasi urutan nirogenous base dari mRNA
untuk menyusun asam amino suatu protein
mRNA berhubungan dng RIBOSOME (terdiri atas rRNA & protein)
Asam amino tertentu melekat pada tRNA
Pada bag tertentu dari tRNA tdp 3 nukleotida ANTICODON
Segmen 3 nukleotida pada mRNA CODON
Ribosome bergerak sepanjang rantai mRNA, setiap kali asamasam amino berikatan membentuk polypeptides
Bila beberapa ribosome melekat pada satu rantai mRNA disebut
POLYRIBOSOMES

KODE GENETIK

Codon mRNA dan Asam Amino yang disandinya

Terdapat kemungkinan 64 codons, tetapi Asam Amino hanya 20
1 Asam Amino bisa disandi oleh beberapa codons
keadaan ini disebut : DEGENERACY OF THE CODE
61 mrpk SENSE CODONS menyandi Asam Amino
3 mrpk NONSENSE CODONS mengakhiri sintesa protein
(TERMINATOR CODONS) :
UAA, UAG, UGA
INITIATOR CODON AUG utk Methionine memulai sintesa
protein

GENETIC CODES

BEBERAPA ISTILAH
GENOM

seluruh gen yg tdp dlm suatu organisme

GENOTYPE

komposisi genetik suatu organisme

gen normal/mutasi membawa sifat ttt

PHENOTYPE

ekspresi gen sifat morfologi/biokimia

yg dpt dilihat

PROTOTROPH

strain bakteri normal yg baru diisolir

AUXOTROPH

strain yang mengalami mutasi

MUTASI BAKTERI

Perubahan pada gen morfologi/biokimia

Melindungi thd seleksi alam
Dapat terjadi secara spontan
Dapat diturunkan ke generasi berikutnya
Dapat kembali ke bentuk semula BACK MUTATION

KECEPATAN MUTASI relatif konstan

dalam 1 generation time
Rumus : a =

a
M
N0
N1

:
:
:
:

M
N1 N 0

kecepatan mutasi
jumlah mutasi
jml sel mula-mula
jml sel setelah doubling

MORPHOLOGIC MUTANTS
Normal bakteria
Agar plate + mutagen
Observasi koloni kuman yang tumbuh
Bandingkan dengan koloni kuman normal
MUTASI dapat dipercepat 10 100 x dng bahan MUTAGEN
Fisis sinar x, sinar uv, sinar ,
Kemis nitrat, acridine, N-mustard

BIOCHEMICAL MUTANTS
E.coli normal + mutagen
ditanam pada complete media
Ditest pada SMM
Tak tumbuh (mutasi +)

tumbuh (mutasi - )
DIBUANG !

Observasi lbh lanjut + tryptophan

Tumbuh
Kuman diberi tanda
Tryptophan (-)

tak tumbuh
+ bahan lain,mis.adenine
tumbuh
kuman diberi tanda
adenine (-)

tak tumbuh
bahan lain
dst

AKIBAT MUTASI
Mutant strain memiliki daya resistensi
Misalnya terhadap : - antibiotika
- UV light
- Bacteriophage
Dapat juga terjadi DRUG DEPENDENCE, mis. thd sulfa
kuman kebal dpt mensintesa PABA
dlm jumlah banyak
PABA jml banyak berpengarfuh jelek
thd kuman MATI
supaya kuman tetap hidup, perlu
penambahan sulfa untuk menetralisir
PABA

MACAM MUTASI

- SUBSTITUTION
- ADDITION / DELETION
- INVERSION

Base Substitution

(c) Nonsense mutation

(a) Normal DNA molecule

(b) Missense mutation

(d) Frameshift mutation

PEMINDAHAN MATERI GENETIK

HARUS ADA SEL DONOR & SEL RESIPIEN

MACAM :
1.TRANSFORMATION
2.TRANSDUCTION
3. CONJUGATION

TRANSFORMASI

- Kali pertama diamati oleh Frederick Griffith (1928)

pada kuman Streptococcus pneumoniae
- Sel Donor lisis mengeluarkan DNA
- Sel Resipien mengambil DNA terlarut yang dilepaskan
oleh sel Donor

Percobaan Griffith

TRANSFORMATION

TRANSDUCTION

Pemindahan materi genetik dari suatu kuman ke kuman

yang lain dengan perantara bacteriophage

1. Generalized Transduction
2. Restricted Transduction

TRANSDUCTION

CONJUGATION

Pada proses ini perlu kontak antara 2 sel SEX PILI

Sel donor adalah F+, sel resipen FF+ ( F factor ) merupakan Plasmid dapat ditransfer
Jika F factor integrasi ke dlm khromosom HFr
( High Frequency of Recombination)

PLASMID
Extrachromosomal Genetic Element yg tdp dlm sel bakteri
dalam bentuk bebas
Mengandung circular DNA 1 5 % dari ukuran khromosom
bakteri
Dapat mengadakan replikasi sendiri
Dapat dipindahkan pada umumnya dng conjugasi
beberapa dng transduksi
CONTOH :
1. F Factor
2. Col Factor
3. R Factors (Resistance Factors) :
terdiri atas :
- resistance transfer factor (RTF) gen utk replikasi dan
conjugasi
- r- determinant resistance genes menyandi produksi
enzim inaktivasi obat tertentu
4. Penicillinase plasmid resisten thd penicillin
transduksi

TRANSPOSONS
Adalah segmen DNA pendek yg dpt berpindah (transposisi)
dari satu bagian dari molekul DNA ke bagian yg lain dalam
khromosom yg sama, atau ke khromosom yg lain, atau plasmid
Seringkali disebut jumping genes
Ukuran : 700 - 40,000 bp
Frekwensi : 10-5 - 10-7 per generation
Yang paling sederhana disebut : insertion sequences ( IS ),
hanya mengandung gen yg menyandi enzim (transposase) dan
recognition site
Complex transposons mengandung gen lain yg tidak
berhubungan dengan proses transposisi, misalnya mengandung
gen utk toksin atau utk resisten thd antibiotika.
Dapat menyebar dari satu organisme ke organisme yang lain

TRANSPOSON

OPERON MODEL

STRUCTURAL GENES : - gen yg menyandi protein tertentu

enzim
- membentuk mRNA
OPERATOR GENES

: mengatur kerja structural genes

REGULATOR GENES : membentuk bahan represor

Lac operon

Allolactose
molecules

GENETIC ENGINEERING (REKAYASA GENETIK)

Pengetahuan ttg plasmid dan enzim yg terlibat dlm metabolisme
DNA memungkinkan untuk Isolasi gen dari berbagai organisme
dan menyatukannya ke dalam sel bakteri
Rekayasa genetik prosedur pembuatan dan manipulasi materi
genetik
DNA rekombinan hasil dari saling berikatannya DNA dari
sumber yang berbeda
Dibutuhkan : Restriction Enzymes (Endonucleases)
utk memotong :
- bacterial plasmid
- segmen DNA dari organisme lain

KLONING GEN
GEN pada DNA :
mempunyai tugas masing-masing
untuk mempelajari harus dipisahkan
perlu cloning vector transformed cells

TAHAPAN :
1. ISOLASI DNA
2. PEMOTONGAN DNA enzim restriksi
3. PENYISIPAN KE DALAM VEKTOR
4. TRANSFORMASI
5. PEMURNIAN HASIL

1. ISOLASI DNA
- DNA dlm sel sel dibuat lisis pisahkan dng struktur
lain dng bahan-bahan kimia sentrifugasi

2.ENZIM RESTRIKSI (RESTRICTION ENDONUCLEASES)

-

Molecular scalpel utk memotong DNA pd tempat tertentu

Memecah ikatan fosfodiester
Mengenal kombinasi urutan basa nukleotida tertentu ( 4,6,8 bp )
Banyak dihasilkan kuman (dikenal > 2000 enzim)
Titik potong :
blunt-ended fragments
sticky ends
- Diberi nama sesuai dng organisme prokariotik yg menghasilkan :
Hae III

GG CC
CC GG

Eco RI

G AATTC
CTTAA G

ANALISA HASIL PEMOTONGAN DNA DENGAN

ENZIM RESTRIKSI
AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS
VISUALISASI Ethidium Bromide UV light
Methylene Blue
Berbagai ukuran fragmen DNA dapat dipisahkan dalam
bentuk pita (bands)

Agarose Gel Electrophoresis

3. PENYISIPAN KE DALAM CLONING VECTOR

CLONING VECTOR DNA
Memiliki origin of replication
Memiliki 1 cloning site
Memiliki gen yg menyandi produk pembeda antara :
transformed cells dengan untransformed cells
Macam :
- Plasmid : > circular DNA molecules extrachromosomal
> pada bakteri
> ukuran kecil ( 5000 bps )
> replikasin otonom
-

Cosmid
Bacteriophage
Phage M 13
dll.

 Dengan menggunakan Enzim Restriksi yg sama DNA vector

dan DNA yg mengandung gen pilihan dipotong
Gen pilihan disisipkan pd DNA vector
Disambung dng enzim ligase
Hasil gabungan Recombinant DNA

Recombinant DNA

Enzim Restriksi (EcoRI) membuat DNA rekombinan

4. TRANSFORMASI E.coli DNG PLASMID DNA

Vector + DNA pilihan Sel Inang sel kompeten

CaCl2

5. PEMURNIAN HASIL
Prinsip harus terdapat perbedaan antara sel inang yang
mengandung DNA rekombinan dan yang tidak
BLUE-WHITE SCREENING
Plasmid mengandung :
- gen ampR resisten thd penisilin
- gen lacZ enzim -galactosidase

Metode seleksi recombinant bacteria

PELACAK DNA (DNA PROBES)

Suatu potongan DNA pendek yg spesifik utk suatu lokasi gen/

khromosom tertentu
Dapat berupa cDNA atau fragmen restriksi kecil dari DNA genom
Harus mampu berhibridisasi dng rangkaian asam nukleat
tertentu secara spesifik
Harus diberi label radioaktif 32P / 35S
non radioaktif : avidin biotin
HIBRIDISASI
Prinsip : rantai DNA/RNA yg identik dpt mendekatkan diri dan
berpasangan antara Pelacak dan Sasaran
Macam :
- Southern Hybridization DNA : DNA/RNA
- Northern Hybridization RNA : RNA/DNA
- Colony Hybridization
- In Situ Hybridization
Sifat

: spesifik identifikasi DNA

Hibridisasi koloni menggunakan

DNA probe

Southern Blotting

APLIKASI REKAYASA GENETIK

UNTUK KEPERLUAN PENGOBATAN :
1. Gen sintetis (utk insulin) vektor plasmid E.coli
produksi insulin
2. Subunit vaccines Hepatitis B
3. Membuat produk mikrobial antibiotika
4. dll.
UNTUK PENELITIAN DASAR & APLIKASI MEDIS
1. DNA fingerprinting kedokteran forensik
2. Terapi Gen
3. PCR (polymerase chain reaction)
4. DNA sequencing
5. DNA probes utk identifikasi patogen

PCR

DNA Fingerprinting
untuk Kedokteran Forensik

CLONING
Adalah membuat/membentuk suatu organisme yang merupakan
exact genetic copy dari yang lain
CLONE adalah suatu sel atau organisme yang secara
genetik identik dengan sel yang lain atau
organisme
Cloning an animal membuat exact genetic copy dari
hewan/organisme tersebut
Cloning a gene mengisolasi suatu exact copy gen
tunggal dari genom suatu organisme.
Biasanya melibatkan penggandaan urutan
DNA ke dalam plasmid

CLONING OF DOLLY
Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)
Single set dari khromosom sel telur dihilangkan, kemudian
diganti dengan nukleus yang berasal dari sel somatik
Seperti fertilized zygote
Berkembang menjadi embryo
Implantasi ke induk angkat sampai
genap bulan