TUGAS INDIVIDU

MAKALAH REKAYASA GENETIKA

ENZIM RETRIKSI

DISUSUN
OLEH:
WIWIT ZURIATI UNO
NIM: P2500215001

PROGRAM PASCASARJANA FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN
2016

BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Bioteknologi adalah cabang ilmu yang memanfaatkan makhluk hidup
atau produk yang dihasilkan oleh makhluk hidup dalam proses produksi yang
meghasilkan produk barang atau jasa. Bioteknologi berkembang dengan
pesat sehingga ditemukan berbagai macam teknologi yang menggunakan
makhluk

hidup

rekombinasi

seperti

DNA,

dan

rekayasa

genetika,

banyak

bioteknologi

kultur

jaringan,

modern

kloning,

lainnya.

Pada

perkembangannya bioteknologi telah mencapai tingkat rekayasa yang lebih

terarah sehingga produk yang dihasilkan lebih baik dan dapat dikendalikan.
Teknik ini menggunakan manipulasi DNA, salah satunya yaitu rekombinasi
DNA.
Teknik rekombinasi DNA mengombinasikan materi genetik yang baru
dengan cara memotong kemudian menyisipkan molekul DNA ke dalam suatu
vektor sehingga memungkinkan terjadinya integrasi dan perbanyakan sel
vektor pembawa DNA rekombinan ini di dalam sel inang. Pemotongan DNA
dalam teknik rekombinasi DNA ini menggunakan suatu enzim yaitu enzim
restriksi endonuklease. Enzim restriksi endonuklease memunyai kemampuan
memotong urutan nukleotida pada basa-basa secara spesifik sehingga
pemotongannya bersifat terarah.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apa yang dimaksud dengan enzim restriksi endonuklease?
2. Bagaimana
pemotongan
DNA
menggunakan
enzim

restriksi

endonuklease pada teknik rekombinasi DNA?

3. Bagaimana manfaat pemotongan DNA dalam teknik rekombinasi DNA
1.3 Tujuan Penulisan
1. Mengetahui maksud dari enzim restriksi endonuklease
2. Mengetahui
pemotongan
DNA menggunakan

enzim

restriksi

endonuklesae pada teknik rekombinasi DNA

3. Mengetahui manfaat pemotongan DNA dalam teknik rekombinasi DNA
1.4 Manfaat Penulisan
Manfaat yang dapat diambil bagi penulis dan seluruh pembaca dari
penulisan makalah ini adalah dapat meningkatkan pengetahuan mengenai
enzim retriksi pada rekayasa genetika serta cara pemotongan DNA
menggunakan enzim restriksi endonuklease.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

3.1 Definisi Enzim Retriksi (Allison, L. A. 2007)

Enzim restriksi merupakan enzim yang membelah tulang belakang
gula-fosfat dari untai DNA. Mereka membawa fungsi pertahanan rumah untuk
sel. Enzim ini dapat mengenali urutan basa DNA spesifik dan membelah
kedua untai molekul DNA beruntai ganda pada atau dekat lokasi pengenalan.
Enzim endonuklease adalah salah satu enzim yang banyak digunakan
dalam bidan rekayasa genetika, karena mampu memotong ADN atau ARN
pada posisi tertentu. Karena kemampuannya ini endonuklease dijuluki
gunting Biologi. Berikut ini adalah artikel tentang mengenal enzim
endonuklease.
Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim
dari mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut
sekarang dikenal dengan enzim restriksi endonuklease atau sering disebut
endonuklease. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuen
spesifik yang panjang 4 sampai dengan 6 pasang basa nitrogen.
Kerja enzim tersebut dalam tubuh inangnya adalah mengenali dan
memotong DNA (termasuk DNA faga tertentu) yang asing bagi bakteri
tersebut. Maksud dari kegiatan memotong DNA asing tersebut tidak lain
sebagai mekanisme perlindungan bakteri terhadap DNA yang menyelinap
dari organisme lain seperti virus atau sel bakteri lain.
Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong-motong DNA pada lokasilokasi yang spesifik- mengenali daerah atau urutan DNA pendek dalam

molekul

DNA dimana

urutan

DNA yang

dikenali

tersebut

bersifat

PALINDROME. Selanjutnya enzim tersebut akan memotong DNA pada titik

tertentu di dalam urutan DNA tersebut. Sel bakteri ini melindungi DNA-nya
sendiri dari restriksi dengan menambahkan gugus metil (CH3) pada adenine
atau sitosin di dalam urutan yang dikenali oleh enzim restriksi tersebut.
Enzim-enzim restriksi yang telah ditemukan dan telah tersedia secara
komersial telah berjumlah ratusan.
Enzim ini selalu memotong molekul DNA pada sekuen spesifik dengan
panjang situs pengenalan enam pasang basa. Enzim restriksi endonuklease
(enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA
pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Enzim ini
telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena
pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus
bakteri. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri
memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk
ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali
adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari
Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong DNA pada
urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen
seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat
segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang
dapat digunakan untuk mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen.

3.2 Klasifikasi Enzim Retriksi (Gholizadeh et.al., 2009)

Enzim restriksi dapat diklasifikasikan dalam tiga kelas: I, II dan III dan
IV. Keempat jenis enzim ini digolongkan berdasarkan pada komposisi, jenis
kofaktor, target DNA yang akan dipotong, dan posisi sisi aktif enzim relatof
terhadap target DNA. Keempat jenis enzim tersebut antara lain :
1. Tipe I, enzim membelah di lokasi terpencil dari sisi pengenalan,
membutuhkan baik ATP dan S-adenosyl-L-methionine berfungsi; protein
multifungsi dengan aktivitas restriksi dan metilasi.
2. Tipe II, enzim bersatu dalam atau pada jarak tertentu dari sisi pengenalan,
paling membutuhkan magnesium, fungsi tunggal enzim tidak bergantung
metilasi. Tipe II DNA endonuklease restriksi umumnya berupa enzim
proteineous bakteri yang mengenali urutan nucelotide sasaran secara
spesifik (situs pengenalan/recognition site) dalam DNA beruntai ganda,
yang menyebabkan kerusakan obligasi internal antara nukleotida tertentu
dalam target tersebut. Mereka adalah bagian dari modifikasi restriksi
bakteri sistem R-M, dan dapat berfungsi melindungi sel terhadap DNA
asing. Beberapa jenis bakteri sistem R-M telah diklon, diurutkan dan
diekspresikan terutama dalam sistem heterolog karena memiliki aplikasi
yang

berpotensi

dan

bermanfaat

secara

komersial.

Restriksi

endonuklease EcoRI adalah enzim restriksi tipe II yang secara khusus

mengakui dan memotong palindrom hexanucleotide yang terdefinisikan
dengan baik (GAATTC). Enzim restriksi ini terdiri dari polipeptida yang

mengandung 277 asam amino dan memiliki bobot molekul tunggal

mencapai 29 kDa yang telah dimurnikan sebelumnya dari strain bakteri
Escherichia coli klinis RY13
3. Tipe III, enzim membelah di lokasi jauh dari sisi pengenalan,
membutuhkan ATP (tetapi

tidak

menghidrolisisnya),

S-adenosyl-L-

metionin merangsang reaksi namun tidak diperlukan, ada sebagai bagian

dari kompleks modifikasi metilasi.
4. Tipe IV, enzim menarget DNA termetilasi
Tabel 1. Karakteristik dari masing-masing tipe endonuklease (Howe, 2007;
Reece, 2004).

Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim
restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil
pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim

restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan

sekuens yang diinginkan (gambar 1). Berikut adalah Gambar 1. Pemotongan
molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease tipe I, II, dan III

3.3 Sifat Khusus Enzim Restriksi (Neb, 2010).

1. Isochizomer
Isochizomer adalah enzim-enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan
yang sama. Hasil pemotongannya bisa sama dan bisa juga berbeda.
Misalnya HpaII (situs pengenalan: CCGG) dan MspI (situs pengenalan:
CCGG) adalah isoschizomer, begitu pula AatI (AGGCCT) dan StuI
(AGGCCT).
2. Neoschizomer
Neoschizomer

adalah

bagian

dari

isoschizomer,

memiliki

situs

pengenalan yang sama tetapi memotong pada tempat yang berbeda

sehingga hasil pemotongannya pun berbeda. Misalnya AatII (situs

pengenalan: GACGTC) dan ZraI (situs pengenalan: GACGTC).
3.4 Sekuens pengenal Enzim Retriksi (Reinhart, C.A. 2005)
Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek
akan menghasilkan banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai
sekuen pengenalan yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang lebih
sedikit. Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun
panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika.
Panjang dari sekuens pengenalan mempengaruhi seringnya enzim
retriksi memotong DNA dalam ukuran tertentu. Misalnya pada enzim yang
memiliki panjang 4 basa, enzim ini diperkirakan akan memotong setiap 256
nukleotida. Perhitungan tersebut diperoleh dengan mengasumsikan setiap
basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar
(kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan
mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4)6= 1/4096.
Berapa sekuen bisa jadi lebih sering atau lebih jarang ditemui dalam suatu
oorganisme. Seperti pada mamalia, sekuen CG sangat jarang ditemui
sehingga enzim HpaII yang mempunyai sekuen pengenalan CCGG akan
lebih jarang memotong pada DNA mamalia.
Enzim retriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan
menghasilkan banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen
pengenalan yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang kebih sedikit.

Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun panjang,

mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika.
2.5 Keadaan Restriksi (Rinehart, C.A., 2005)
Enzim restriksi pada umumnya bekerja pada pH 7,4; suhu 37C; dan
memerlukan

bermacammacam

kekuatan

ionik,

tergantung

dari

jenis

enzimnya. Akan tetapi, beberapa enzim memerlukan optimasi khusus agar

proses restriksi berjalan dengan baik. Dalam larutan stok, enzim restriksi
biasanya dikemas bersama dengan 10X larutan penyangga reaksi yang telah
dioptimasi. (Rinehart, C.A., 2005) Buffer reaksi dapat digolongkan menjadi
empat jenis berdasarkan kekuatan ionik-nya: 1. 0 mM NaCl = low salt buffer
(L) 2. 50 mM NaCl = medium salt buffer (M) 3. 100 mM NaCl = hi salt buffer
(H) 4. 150 mM NaCl = very high salt buffer (VH) Ketika melakukan digesti
dengan 2 atau lebih enzim restriksi yang berbeda buffer reaksinya, perlu
dilihat rujukan tabel aktivitas enzim tersebut pada buffer reaksi tertentu.
Misalnya: reaksi digesti dilakukan dengan menggunakan EcoRI (garam
tinggi) dan HpaII (garam rendah, KCl). Setelah dilihat pada tabel, kedua
enzim aktif pada keadaan garam sedang. Oleh karena itu, digunakan buffer
reaksi dengan konsentrasi KCl sedang.
Buffer reaksi yang digunakan adalah KCl karena HpaII memerlukan
KCl, bukan NaCl; sedangkan EcoRI dapat menggunakan kedua garam
tersebut. Kondisi optimal ketika melakukan proses digesti sangat penting.
Karena jika kondisi optimal tidak tercapai, enzim akan memotong secara

tidak normal. Contohnya: EcoRI pada buffer reaksi dengan konsentrasi

garam rendah tidak hanya memotong pada situs pengenalan normal
GAAATTC, namun akan juga memotong situs pengenalan AATT. Aktifitas
seperti ini dinamakan star activity. (Rinehart, C.A., 2005) Setelah proses
inkubasi

selesai,

reaksi

digesti

enzim

dapat

dihentikan

dengan

menambahkan EDTA. Penambahan EDTA akan mengkelat ion logam; dalam

reaksi ini ion logam yang dikelat adalah Mg2+. Untuk beberapa tipe enzim
lainnya, inaktivasi dapat dihentikan dengan cara pemanasan; menggunakan
pendenaturasi protein, contohnya fenol atau kloroform; atau memisahkan
enzim dari DNA menggunakan kolom kromatografi. (Rinehart, C.A., 2005)
2.6 Enzim yang digunakan dalam laboratorium dibagi menjadi tiga
berdasarkan perkiraan pemotongan (Old, 2003).
1.

6-cutters
Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs pemotongan
yang spesifik pada 6 nukleotida. Ezim ini cocok digunakan untuk
pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim ini sering memotong satu atau
dua situs pada plasmid, namun jarang memotong bagian penting seperti
titik asal replikasi (origin of replication) atau gen resisten ampisilin. Contoh
enzim 6-cutters adalah HindIII (AAGCTT) yang memotong genom

bakteriofage (48 kbp) pada 7 situs.

2. 8-cutters
Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida;
cocok digunakan untuk membentuk kromosom menjadi potongan-

potongan yang spesifik dalam ukuran yang besar. Sebagai contoh: PacI
(enzim 8-cutters) memotong-motong kromosom E. coli menjadi 20 bagian,
sedangkan BamHI (enzim 6-cutters) memotong sekitar 300 bagian. Jika
langsung menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen yang dihasilkan
terlalu kecil dan banyak. Untuk itu digunakan enzim 8-cutters terlebih
dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan enzim 6-cutters.
3. 4-cutters
Enzim

restriksi

ini

cocok

untuk

percobaan

yang

menginginkan

pemotongan pada beberapa situs yang potensial. Contohnya: jika ingin

mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan pada potongan tersebut
terdapat gen yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial
digestion) menggunakan enzim 4-cutters
2.7 Ciri Utama Enzim Retriksi (Liu, 2007).
Enzim retriksi (RE) atau disebut juga retriksi endonuklease merupakan
protein yang dihasilkan oleh bakteri. Fungsi enzim retriksi ini adalah untuk
menjaga sel bakteri dari DNA asing dari bakteriofage. Enzim retriksi
mencegah DNA virus bereplikasi dengan cara memotong DNA virus menjadi
beberapa potongan. DNA bakteri sendiri tidak terpotong oleh enzim DNA
metiltransferase. Enzim tersebut mengenali urutan DNA yang sama dengan
pengenalan

enzim

retriksi,

namun

metiltransferase

tidak

memotong

meIainkan melindungi situs tersebut dengan metilasi basa pada untai DNA
(Liu, 2007).

Enzim retriksi kelas I mempunyai berat molekul sebesar 300.000

dalton yang terdiri dari subunit identik serta membutuhkan Mg 2+, ATP
(adenosine triphosphate) dan SAM (S adenosyl methinine) sebagai
kofaktornya. Kelas II berukuran lebih kecil, yaitu sekitar 20.000 sampai
100.000 dalton dan hanya memmbutuhkan Mg 2+ untuk melakukan aktivitas.
Kelas III berukuran 200.000 dalton dan membutuhkan 2 kofaktor yaitu Mg 2+
dan ATP (Sudjadi, 2008). Ciri utama enzim retriksi adalah setiap enzim
mengenal urutan spesifik pada molekul DNA yang akan dipotong (tabel 2.2).
Enzim retriksi tertentu akan memotong pada urutan pengenal dan tidak
memotong daerah urutan lainnya, beberapa enzim mengenali urutan
heksanukleotida BamHI yaitu GGATCC, tetranukleotida AluI yaitu AGTC, atau
pentanukleotida denngan basa pengenalan umum misalnya HinfI yaitu
GANCT (Fatchiyah dkk, 2011).

Hasil pemotongan enzim retriksi dapat menghasilkan enzim tumpul

(blunt end) maupun ujung lancip (sticky end). Hal yang perlu diketahui adalah
aktivitas enzim akan maksimal pada komposisi buffer yang spesifik,
terkadang bagi enzim yang aktivitasnya rendah bisa dimaksimalkan dengan
bovine serum albumin (BSA) sebagai aktivator. Akan tetapi, untuk RE yang
mempunyai

aktvitas

tinggi

seperti

EcoRI,

penambahan

BSA

akan

menurunkan aktivitas enzim secara tajam (Fatchiyah dkk, 2011)

2.8 Pola Pemotongan dan Keragaman Genetik (Tarwinangsih dkk, 2011).
Pola pemotongan atau haplotipe adalah urutan DNA atau kombinase
alel dari lokus yang berdekatan yang berasal dari kromosom induk. Haplotipe
bisa diperoleh dengan memotong fragmen DNA menggunakan enzim retriksi
(Tarwinangsih dkk, 2011).
Hasil pemotongan dengan menggunakan enzim retriksi dapat
berbeda-beda, baik pada speies yang sama ataupun pada spesies yang
berbeda. Perbedaan pola pemotongan tersebut disebabkan oleh perbedaan
pada urutan nukleotida masing-masing spesies ataupun individu. Campbell
(2010) menyatakan bahwa jika perbedaan nukleotida antara alel terjadi
dalam situs restriksi, maka akan menghasikan campuran fragmen yang
berbeda dan pola pita tersendiri dalam elektroforesis gel.
Hasil

pemotongan

pada

satu

individu

spesies

juga

dapat

menghasilkan beberapa pita DNA. Hal tersebut disebabkan karena

disepanjang untaian DNA terdapat pengulangan basa-basa nitrogen (DNA

repetitif) pada daerah yang berbeda-beda. Oleh karena itu, enzim retriksi
dapat memotong basa-basa yang dikenali pada daerah yang bebrbeda pula.
Pada pemotongan yang dihasilkan dari pemotongan fragmen DNA
dapat tergolong ataupun monomorfik. Polimorfik berarti fragmen-fragmen
DNA yang dipotong oleh enzim retriksi berbeda-beda ukurannya sehingga
mempunyai banyak bentuk pol pemotongan (Raven dkk, 2002). Sedangkan
monomorfik adalah jika fragmen-fragmen DNA yang dipotong oleh enzim
retriksi sama ukurannya. Pola pemotongan, baik polimorfik ataupun
monomorfik dijadikan dasar dalam penyusunan komposit haplotipe untuk
memperkirakan tingkat keragaman genetik.
Terbentuknya pola pemotongan yang bervariasi oleh enzim retriksi
endonuklease disebabkan urutan basa DNA diantara beberapa individu
berbeda-beda. Enzim retriksi akan memotong urutan basa DNA yang dikenali
saja, sehingga pola pemotongan yang terbentuk diantara individu-individu
yang diuji (baik sama ataupun beda) dapat dijadikan acuan dalam
memperkirakan keragaman urutan DNA atau keragaman genetik.
Semakin banyak komposit haplotipe yang didapatkan maka semakin
tinggi keragaman genetik suatu populasi. Begitu juga sebaliknya, jika
semakin sedikit komposit haplotipe yang didapatkan maka semakin rendah
tingkat keragaman genetik populasi tersebut. Tingkat keragaman genetik
yang tinggi berhubungan dengan kualitas genetik seperti pencegahan

homozigositas akibat inbreeding. Homozigositas menandakan adanya alel

identik untuk gen tertentu (Campbel, 2010). Homozigositas dalam metode
RFLP ditunjukkan oleh pita-pita yang monoformik. Homozigositas akibat
inbreeding harus dicegah karena dapat menurunkan kekebalan tubuh
organisme dan kecepatan pertumbuhan (Murtidjo, 2001).
Keragaman genetik juga berhubungan dengan kemampuan populasi
untuk beradaptasi terhadap lingkungannya. Haplotipe yang semakin beragam
menunjukkan kemampuan adaptasi yang baik. Hal ini dikarenakan semakin
beragamnya gen yang dimiliki oleh individu-individu di dalam populasi,
sehingga dengan dimilikinya berbagai gen maka berbagai perubahan
lingkungan yang terjadi akan dapat direspon lebih baik (Fahri, 2002).

2.9 Cara Kerja Enzim Endonuklease (Allison, 2007; Reece, 2004).

Adapun cara kerja enzim endonuklease tersebut berbeda-beda. Enzim
endonuklease tipe II telah diketahui strukturalnya yang sisi katalitiknya

tersusun atas 5 macam protein sekunder dalam bentuk -sheet yang diapit
oleh 2 protein sekunder dalam bentuk -heliks (Gambar 2).
Enzim restriksi endonuklease tersebut dapat melakukan scanning
pada untain molekul DNA jika tidak menemukan restriction sites yang
spesifik. Peristiwa tersebut dinamakan mekanisme sliding.
Mekanisme sliding tersebut

melibatkan

pergerakan

di

sepanjang

lekukan DNA. Namun enzim restriksi endonuklease tersebut akan mengubah

konformasinya ketika mengenali daerah restriction sites yang spesifik. Ketika
sudah mengenali daerah spesifik, maka enzim tersebut akan memotong dua
ikatan gula deoksiribosa dengan fosfat dari double helix DNA yang berbeda
dan menghasilkan gugus 3 hidroksil (OH) dan gugus 5 fosfat (PO 4-).
Selanjutnya DNA tersebut menjadi fragmen-fragmen yang sesuai dengan
daerah pemotongannya. Enzim endonuklease tidak selamanya memotong
DNA menjadi fragmen yang ujungnya simetris (blunt ends), namun ada juga
yang ujungnya asimetris (sticky ends) (Gambar 3).
Pola potongan simetris atau tidaknya tergantung kinerja enzim
endonuklease seperti yang tertera pada Tabel 1(Allison, 2007; Reece, 2004).

Enzim BamHI ini memiliki kofaktor berupa ion Mg 2+, sehingga dalam
prosedur protokol restriksi suatu sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation
bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid
yang dibutuhkan untuk meningkatkan aktivitas enzim restriksi (Ausubel, 2003;
Reece, 2004). Adapun kinerja enzim BamHI tersebut mampu memotong
ikatan fosfodiester pada urutan DNA pada sisi:
5 GG-A-T-C-C 3
3 C-C-T-A-GG 5
Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotida yang
sama (G-G), sehinggaBamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil

potongan oleh enzim BamHI berupa formasi 5PO4 dan 3OH yang bagian
terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends. (Ausubel, 2003; Becker et
al., 1996).
Enzim BamHI bekerja dengan cara melakukan scanning sekuens nonspesifik di sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), setelah itu ketika
enzim tersebut menemukan sekuens spesifik berupa 5 G-G-A-T-C-C 3 maka
akan berupa konformasinyan dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong
ikatan fosfodiester antara nukleotida G menjadi fragmen yang terpisah
(Allison, 2007).

2.10 Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi

Endonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari
Fragmen yang Terpotong (Liu, P.T., Stenger, S., Tang, D.H., Modilin,
R.L. 2007)
Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA
polimerase, ligase, enzim yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan
nuklease. Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan
memutuskan ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida
berikutnya. Jenis nuklease ada dua yaitu eksonuklease dan endonuklease.
Endonuklease merupakan nuklease yang memotong bagian internal DNA
tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil pemotongan molekul DNA oleh enzim
restriksi endonuklease tepat pada urutan tertentu dan menghasilkan sekuens

yang double-stranded, dengan demikian sekuens yang akan dipotong dapat

diprediksi urutan basa nitrogennya.
Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II adalah EcoRI. Enzim
EcoRI diisolasi dari E. coli dan memotong molekul DNA pada urutan
heksanukleotida 5GAATTC-3.

Selain EcoRI, enzim restriksi endonuklease lainnya dapat dilihat pada

tabel di bawah ini.

Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam yaitu

unjung blunt atau flush dan ujung sticky atau cohesive (gambar 2).

Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi

endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky
berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi
endonuklease berbeda. Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang
double-stranded, sedangkan ujung sticky atau cohesive menunjukkan enzim
restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang
komplementer.
Beberapa pemotong ujung sticky menghasilkan ujung 5 atau ujung 3
yang menggantung. Fragmen DNA yang dipotong dengan enzim restriksi
endonuklease

dapat

ditentukan

berapa

besar

ukurannya

dengan

menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa. Teknik ini tergantung oleh

konsentrasi agarosa dalam gel. Fragmen yang berukuran kurang dari 150
pasang basa dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis yang konsentrasi
agarosanya 4% atau 5%.

Apabila ukuran dari sekuens DNA tidak diketahui maka fragmen yang
mengandung gen atau segmen DNA tersebut dapat diidentifikasi dengan
Southern hybridization. Adapun tahapannya yaitu:
1. Mentransfer fragmen restriksi dari gel agarosa ke nitroselulosa atau
membran nilon.
2. Menyediakan hybrization
komplementer

dengan

probe.

Sekuens

DNA target

dilabeli.

molekul
Pelabelan

DNA

yang

ini

dapat

menggunakan oligonukleotida sintetik. Pelabelan kemudian dideteksi

dengan menggunakan Autor adiography.

2.11

Manfaat Pemotongan DNA dalam teknik rekombinasi DNA (Old,

R.W., dan Primrose, S.B. 2003).

Teknik rekombinasi DNA sangat bermanfaat terutama untuk bidang
kesehatan. Beberapa produk DNA rekombinan yang digunakan dalam terapi
manusia, diantaranya: insulin untuk penderita diabetes, faktor VIII untuk lakilaki menderita hemofilia a, faktor IX untuk hemofilia b, hormon pertumbuhan
manusia

(hgh),

Erythropoietin

(epo)

untuk

mengobati

anemia,

dan

Granulocytemacrophage colonystimulating factor (gmcsf) untuk menstimulasi

sumsum tulang setelah transplantasi sumsum tulang.

BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Teknik rekombinasi DNA mengombinasikan materi genetik yang baru
dengan cara memotong kemudian menyisipkan molekul DNA ke dalam suatu
vektor sehingga memungkinkan terjadinya integrasi dan perbanyakan sel
vektor pembawa DNA rekombinan ini di dalam sel inang. Pemotongan DNA
dalam teknik rekombinasi DNA ini menggunakan suatu enzim yaitu enzim
restriksi endonuklease. Enzim restriksi endonuklease memunyai kemampuan

memotong urutan nukleotida pada basa-basa secara spesifik sehingga

pemotongannya bersifat terarah.

DAFTAR PUSTAKA
Allison, L. A. 2007. Fundamental Molecular Biology. USA: Blackwell
Publishing.
Ausubel, F. M. et al. 2003. Current Protocols in Molecular Biology. USA: John
Wiley & Sons, Inc.
Becker , 1996. Dalam : Notoatmodjo S., 2003. Ilmu Kesehatan Masyarakat.
Bab V, Pendidikan dan Prilaku. Halaman 124-125
Campbell, N., A., Reece., J.B dan Nitchel, L.G. 2004. Biologi Edisi Kelima
Jilid 3. Jakarta. Erlangga
Campbell, N., A., Reece., J.B dan Nitchel, L.G. 2010. Biologi Edisi 8 Jilid 1.
Jakarta. Erlangga

Fahri C, Sutarno, & Listyawati S. 2002. Kadar Glukosa dan Kolesterol Total
Darah Tikus Putih (Rattus norvegicus L.) Hiperglikemik setelah
Pemberian Ekstrak Metanol Akar Meniran (Phyllanthus niruriL.).
Biofarmasi 3(1) : 1-6
Fatchiyah., Arumingtyas. E.L., Widyarti. S., Rahayu. S.Dkk. 2011. Biologi
Molekular Prinsip Dasar Analisis. Erlangga, Jakarta.
Gholizadeh, Ashraf, B Baghdam Kohnehrouz. 2009. Carborundum-dependent
entrance of EcoRI restriction enzyme into plant cell and specific of
genomic DNA. Indian Journal of Experimental Biology, Vol. 47, August
2009.
Howe, C., 2007, Gene Cloning and Manipulation, Second Edition, Cambridge
University Press, New York.
Liu, P.T., Stenger, S., Tang, D.H., Modilin, R.L. (2007) Cutting: edge vitamin
Dmediated human antimicrobial activity against Mycobacterium
tuberculosis is dependent on the induction of cathelicidin. J Immunol.
179 (4), Pp 2060-2063
Murtidjo B.A. (2001), Beberapa Metode PembenihanIkan Air Tawar, Penerbit
Kanisius, Yogyakarta
NEB, 2010. Isoschizomers. New England Biolabs Inc.
Old, R.W., dan Primrose, S.B. (2003). Prinsip-prinsip Manipulasi Gen;
Pengantar Rekayasa Genetika. UI Press: Jakarta.
Raven P, Atlas Anatomi, Terj, A Ramali dan Hendra T Laksman, Jakarta:
Djambatan, 2002.
Reinhart, C.A. 2005. Molecular Genetics Biology 495: Hybridization
Experiment. Tersedia pada http://bioweb.wku.edu/. Diakses tanggal 2
Juni 2012.
Sudjadi. (2008). Bioteknologi Kesehatan. Kanisius: Yogyakarta.
Tarwinangsih, A. Farajallah. Dkk. 2011. Analisis Keragaman genetik Kerbau
Lokal berdasarkan haplotipe DNA Mitokondria. SNT