KULTUR KALUS dan SUSPENSI

SEL
By :
Bintang Manurung
Elmida Hasibuan
Elfredo Napitu
Kholijah Hasibuan
Putri Ayu Aprilia
Yolanda
Biologi 2014 A
Fakultas matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Negeri Medan
 OUT LINE

Defenisi Kalus
Sel- sel penyusun Kalus
Zat Pengatur Tumbuh Induksi Kalus
Inisiasi Pembentukan Kalus
Tehnik Dasar Induksi Kalus
Faktor Penyebab Pertumbuhan Kalus
Eksplan yang Baik untuk Induksi Kalus
Pentingnya Subkutur pada Kalus
Proses Differensiasi Pada Tanaman Bersifat Refersiblle
Defenisi Suspensi Sel
Pembuatan Kultur Suspensi Sel dan Sel Plating
Keuntungan Medium Cair
Pertumbuhan Sel pada Kultur Sel
Tipe Pertumbuhan Sel pada setiap Fase Penghambatan Siklus
Manfaat Kultur Sel
 Pengertian
Menurut harahap (2017) kalus merupakan kumpulan massa
sel yang amorphus yang terdiri dari sel atau jaringan yang
membelah diri terus menerus.kalus tersusun oleh sel-sel
parenkim yang mana ikatannya dengan sel lainnya yang
sangat renggang.Jaringan ini belum mengalami diferensiasi
lanjut.Kalus adalah sekumpulan sel yang aktif membelah
secara terus menerus ( Nulfitriani, 2017 ).

Kalus merupakan massa sel yang tidak terorganisir, pada

mulanya sebagai respon terhadap pelukaan
(wounding).Pembelahan selnya menjadi tidak terkendali,
sel-selnya mengalami proliferasi yaitu membelah terus
menerus dengan sangat cepat, hal ini dimungkinkan karena
sel-sel tumbuhan yang secara alamiahnya bersifat autotrof
dikondisikan menjadi heterotrof oleh adanya nutrisi yang
cukup komplek dan zat pengatur tumbuh didalam medium
kultur (Anonim,2017).
 Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang
diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus
diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus
menerus ( zulkarnain,2014).

Kalus dapat diperoleh dari bagian tanaman berupa akar, batang dan
daun.
Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan
yang renggang dengan sel-sel lain.

Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga

kalus tersebut mempunyai tekstur yang keras dan kompak. Namun ada
kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmen-fragmen yang kecil,
kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable).

Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber

eksplan itu diambil, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, atau
kuning kejingga-jingaan

Dalam kultur in-vitro, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ steril
di dalam medium yang mengandung ZPT auxin dan juga sitokinin.
 Zat Pengatur Tumbuh
Penggunaan zat pengatur tumbuh dalam kultur jaringan
tanaman sangat penting, yaitu untuk mengontrol
organogenesis dan morfogenesis dalam pembentukan dan
perkem- bangan tunas dan akar serta pembentukan kalus.

Ada dua golongan zat pengatur tumbuh tanaman yang sering

digunakan dalam kultur jaringan, yaitu sitokinin dan auksin.
Yang termasuk golongan sitokinin antara lain BA (benzil
adenin), kinetin (furfuril amino purin), 2-Ip (dimethyl allyl
amino purin), dan zeatin.

Yang termasuk dalam golongan auksin antara lain IAA (indole

acetic acid), NAA (naphtalene acetic acid), IBA (indole butiric
acid), 2.4-D (2.4-dichlorophenoxy acetic acid), dicamba (3,6-
dicloro-o-anisic acid), dan picloram (4-amino-3,5,6-
tricloropicolinic acid)
 Zat Pengatur Tumbuh (zpt) untuk
Kalus
Untuk produksi kalus embriogenik digunakan auksin
kuat seperti 2.4-D, dicamba atau. 2,4-D merupakan
auksin kuat yang sering digunakan secara tunggal
untuk menginduksi terbentuknya kalus dari berbagai
jaringan tanaman (Endang,2011).

Penggunaan kombinasi antara auksin (2,4-D) dengan

sitokinin (Benzyl Adenin ataupun kinetin) akan
meningkatkan proses induksi kalus. Efektifitas zat
pengatur tumbuh auksin maupun sitokinin eksogen
bergantung pada konsentrasi hormon endogen
dalam jaringan tanaman.selain itu kadang-kadang
juga digunakan bahan organik kompleks seperti sari
pisang,air kelapa,dan yeast ekstrak (Harahap,2017).
 Pembentukan kalus dari jaringan
tanaman tergantung dari :
Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi
Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi
Jenis tanaman :
contohnya Kalus mulai muncul minggu ke-2 masa kultur pada
tanaman Sonchus arvensis, L. (Wahyuni et al. 2010), minggu ke-
3 masa kultur pada Ananas comosus L. (Merr.), Cucumis melo L.
, minggu ke 2-4 masa kultur pada Artemisia annua L. (Ganesan
2011), minggu ke 7-8 pada Anthurium digitatum dengan eksplan
daun, namun lama waktu ini relatif cepat dibandingkan dengan
Aglaonema sp cv. yang membutuhkan waktu 14 minggu. eksplan
kotiledon muda tanaman kedelai mulai berkalus pada umur 7-14
hari setelah kultur
Bagian tanaman yang dipakai untuk eksplan
Jenis tanaman yang menghasilkan kalus : dikotil berdaun lebar,
monokotil gymnospermae, pakis, dan moss
 Contoh kalus dari
tanaman....
Gambar 2 : Kalus Bawang

Kalus bawang merah lokal palu

pada media 14 hari setelah
kultur.

Gambar 1 : kalus Aglaonema sp cv , pada

umur 28 hari dengan beberapa
perlakuan.

Kalus
Gambar 3: Kalus pada eksplan
jagung jarak pagar
 INDUKSI KALUS
Kalus dapat diinduksi dengan pemberiat ZPT auksin dan sitokinin, namun
kebutuhannya berbeda-beda tergantung jaringan tanaman

Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan

garam-garam mineral untuk dapat membentuk kalus seperti umbi
artichoke.
Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-
garam mineral.
Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam-
garam mineral seperti jaringan kambium.
Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam mineral
seperti parenkim dan xylem akar turnip.

Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi dari organ
yang berbeda kecepatan pembelahan selnya berbeda pula

Bagian tanaman yang mudah dediferensiasi dan menghasilkan kalus :

embrio muda, hipokotil, kotiledon, dan batang muda
 Contoh
Proses Kultur Kalus
 EKSPLAN YANG BAIK UNTUK INDUKSI
KALUS

Eksplan terbaik untuk induksi kalus adalah

jaringan dari bagian-bagian semai (seedling)
yang dikecambahkan secara in vitro.
Jaringan yang mengandung parenkim tidak
hijau, seperti parenkim empulur, mempunyai
respon yang lebih baik dibandingkan dengan sel-
sel daun yang mengandung kloroplas.
Ukuran eksplan idealnya adalah yang kecil tetapi
tetap mempunyai kemampuan yang tinggi untuk
membelah, hal ini dimaksudkan agar diperoleh
sel-sel yang relatip homogen.
Teknik Dasar Induksi Kalus
 Tunas
Muda
Daun

Pengambilan
Bunga Eksplan
Ujung Akar

Buah
 1. Kuncup bunga dipanen pada pagi
hari yaitu kuncup bunga yang
mempunyai rasio panjang
braktea{pelindung bunga} terhadap
panjang kuncup 2/2.5 - 2/3 yang
mengandung mikrospora
Bunga 2. Kemudian kuncup bunga diinkubasi
pada suhu 4-9 C selama 5 hari
sebagai pra perlakuan sebelum
isolasi antera
3. Selanjutnya antera{bagian dari
benang sari yng berisi kantung sari }
dari setiap kuncup bunga secara
acak dimasukkan dalam petri sesuai
perlakuan hingga tiap
4. Ditumbuhkan pada media media MS
(Murashige dan Skoog 1962)
 Selanjutnya proses penginduksian
explan menggunakan hormon
dengan cara

Tunggal yaitu Gabungan

Dengan
menambahkan
Hanya dengan
hormon auksin +
menambahkan
hormon sitokinin
hormon Auksin
dengan taraf
konsentrasi yg
dibutuhkan
 sterilisasi terang gelapnya
saat inkubasi.

kandungan
unsur kimia substansi
dalam media Faktor Penyebab organik yang
Pertumbuhan Kalus ditambahkan

hormon yang
digunakan Media
PENTINGNYA SUB KULTUR PADA KALUS
Tujuan dilakukannya subkultur adalah
untuk menjaga kehidupan dengan
mempertahankan laju pertumbuhan sel tetap
konstan sehingga dapat diperoleh kalus dengan
sel-sel yang homogen,
untuk memperbanyak kalus dan untuk
diferensiasi kalus.
Tujuan diferensiasi biasanya digunakan medium
yang mengandung kombinasi zat pengatur
tumbuh dari auksin dan sitokinin yang berbeda.
Pembentukan organ umumnya membutuhkan
zat pengatur tumbuh yang lebih tinggi dari pada
yang dibutuhkan untuk pertumbuhan kalus.
 Hal yang perlu diperhatikan pada subkultur
adalah
massa sel yang dipindah harus cukup banyak.
Hal ini dapat dilakukan dengan membiarkan
kalus tumbuh hingga mencapai diameter 2-3 cm
sebelum dipisahkan dari eksplan dan
membaginya menjadi 4-8 inokula untuk
disubkulturkan pada medium baru.
Bila kalus menunjukkan rupa yang hetcrogen,
yang harus dipilih sebagai inokulum adalah
kalus yang menunjukan pertumbuhan tercepat,
biasanya yang berwarna agak pucat dan lunak.
 PROSES DIFERENSIASI PADA TANAMAN
BERSIFAT REVERSIBLE

Sel-sel akan terjadi lebih baik jika eksplan yang

digunakan berasal dari jaringan yang masih muda.
Sel-sel kalus secara fisiologis dan biokimia sangat
berbeda dengan sel-sel eksplannya yang sudah
terdiferensiasi.
Sel-sel pada kalus bersifat meristematik dan merupakan
salah satu wujud dari dediferensiasi.Dediferensiasi
merupakan reversi dari sel-sel hidup yang telah
terdiferensiasi menjadi tidak terdiferensiasi, atau dengan
kata lain menjadi meristematik kembali.
Dediferensiasi merupakan langkah awal bagi
perbanyakan vegetatip dengan teknik kultur in vitro
karena merupakan dasar terjadinya primordia tunas dan
akar.
 Eksplan yang berupa sel, jaringan dan organ tanaman
pada hakekatnya telah mengalami proses diferensiasi.
Dengan menanam bagianbagian tanaman tersebut
diatas medium kultur secara aseptis, terjadilah proses
dediferensiasi, yaitu terbentuknya sel-sel
parenkimatis yang tidak terdiferensiasi (kalus).
Sel-sel tanaman menunjukkan kemampuan yang luar
biasa untuk meregenerasikan dirinya menjadi
tanaman utuh dari sel-sel yang tidak terdiferensiasi
tersebut, prosesnya disebut rediferensiasi,
rediferensiasi yaitu keadaan menjadi berdiferensiasi
kembali untuk membentuk akar, tunas dan embrioid
yang kemudian membentuk plantlet(Sadimantara,
G.R.2006).
 Manfaat Kultur Kalus
Kultur kalus dapat dilakukan pada media padat maupun
cair. Pada media cair embrio berkembang sebagai
individu terpisah, sehingga penanganan kultur relatif
mudah, jadi keuntungannya dapat untuk produksi
massal.

Potensi terbesar penggunaan kultur kalus adalah dimana

sel-sel kalus dapat dipisahkan dan diinduksi untuk
berdiferensiasi menjadi embrio somatik.

1 milimeter kalus berisi ribuan sel, masing-masing

memiliki kemampuan untuk membentuk embrio,
sehingga kecepatan multiplikasi sangat tinggi.
 Media
Pada pembuatan kultur suspensi sel, yang digunakan
merupakan medium cair. Dimana medium cair yang
digunakan komposisinya sama dengan medium untuk
induksi kalus, hanya pada kultur suspensi sel tidak
menggunakan agar.
Keuntungan dari medium cair yang diinkubasikan
dengan penggojogan pada kultur suspensi sel adalah:
a) tidak terjadi gradien terhadap nutrisi dan gas
b) semua permukaan sel dapat kontak dengan medium
c) aerasi yang lebih baik
d) tidak terjadi akumulasi senyawa-senyawa toksik
 Pembuatan Kultur Suspensi Sel Dan Sel
Plating
1. Kalus wortel yang dibuat seperti yang dijelaskan pada kultur
kalus.
2. Siapkan medium cair MS dengan zat pengatur tumbuh 2,4-D
1 mg.L-l di dalam Erlenmeyer 100 ml. Tiap Erlenmeyer
berisi 50 ml medium cair.
3. Siapkan medium MS padat dengan zat pengatur tumbuh 2,4-
D mg.L-l di dalam petridish .
4. Pilihlah kalus yang lunak dan berwarna putih cerah, timbang
secara aseptis sebanyak (1-1,5) gram, masukkan kalus ke
dalam Erlenmeyer yang berisi medium MS cair, tutup yang
rapat dan beri label.
5. Letakkan Erlenmeyer yang sudah berisi kalus pada
penggojok (shaker), atur kecepatan 120 rpm, inkubasi
dilakukan pada suhu 25oC pada kondisi gelap.
6. Setelah 2-3 minggu akan terbentuk suspensi sel, lakukan
subkultur di dalam Laminar Air Flow Cabinet, dengan
menyaring suspensi sel menggunakan nilon filter porositas
80 m, bagilah filtratnya menjadi dua bagian, biarkan
selama 30- 50 menit, supaya sel-sel meng-endap, buanglah
medium lama dengan cara menuang, tambahkan medium
baru sebanyak 100 ml, kembalikan salah satu Erlenmeyer
yang berisi sel-sel dengan medium baru di atas shaker.
7. Pindahkan sisa filtrat ke dalam tabung sentrifugasi,
endapkan dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit,
buanglah supernatant.
8. Resuspensikan pellet dengan 1 ml medium cair baru,
taburkan di atas petridish yang telah berisi medium MS
padat, ratakan dengan menggoyang petridish pelan-pelan,
tutuplah petridish dan segel dengan parafilm, beri label
dan tempatkan kultur di dalam inkubator 25oC pada
kondisi gelap
Prosedur kultur suspensi
sel
 Hal Yang Perlu Diperhatikan Pada Proses Pemeliharaan Kultur
Suspensi Sel

menyeleksi tipe-tipe sel yang tumbuh dan membelah pada medium

cair.
Laju pertumbuhan sel yang sangat cepat dapat diseleksi dengan
sering melakukan subkultur dengan hanya menggunakan sel-sel
tunggal atau agregat-agregat kecil sebagai inokulum.
Untuk memisahkan sel-sel dari agregatagregat besar dan kecil dapat
dilakukan dengan menyaring suspensi sel menggunakan nilon filter
atau stainless steel filter sebelum disubkultur.
Penyaringan ini biasanya hanya dilakukan pada subkultur yang
pertama, subkultur yang ke dua dan seterusnya tidak perlu
dilakukan penyaringan, teknik penyaringan ini merupakan salah
satu usaha sinkroninasi kultur suspensi sel
 Keuntungan Penggunaan Media Cair

Keuntungan dari digunakannya medium cair yang di

inkubasi dengan penggojokan pada kultur suspensi sel.
Kalus yang friabel dan lunak jika ditransfer kedalam
medium cair dan diinkubasi dengan penggojokan,
setelah dua atau tiga minggu, sel-sel akan terpisah dari
kalus dan inulai membelah, terdispersi didalam medium
cair membentuk suspensi sel yang aktip tumbuh.
Populasi sel-sel didalam kultur suspensi sel terdiri dari
sel-sel tunggal yang bentuknya bermacam-macam,
agregat-agregat (kumpulan) sel yang beragam
ukurannya, bagian eksplan (inokulum) yang tersisa dan
sel-sel mati, yang kesemuanya terdispersi didalam
medium cair:
 Pertumbuhan Sel

Jenis suspensi sel yang paling sering digunakan adalah

tertutup (atau batch) mana sel-sel ditumbuhkan dalam
medium cair dengan volume tetap yang secara rutin
dipelihara dengan mentransfer sebagian (sekitar 10%) kultur
suspensi yang pertumbuhannya sedang dalam akhir fase
logaritme ke medium segar pada interval waktu tertentu.
Kurva pertumbuhan kultur suspense (Gambar 3) memiliki
karakter bentuk yang terdiri dari empat fase esensial, yaitu 1)
fase lag, 2) eksponensial, 3) stasioner dan 4) kematian.
Durasi masing-masing fase tergantung pada spesies atau
genotype yang diseleksi, jenis eksplan yang digunakan,
medium kultur dan subkultur.
Fase lag cukup singkat bila digunakan inokulum relatif besar
walaupun secara paradox pertumbuhan akan berakhir lebih
awal dan produksi biomassa secara menyeluruh akan
berkurang atau lebih sedikit.
 Gambar 3. Kurva pertumbuhan kultur suspense sel yang
ditumbuhkan pada system tertutup. Empat fase pertumbuhan yang
berbeda adalah : (1) fase lag, (2) fase exponential phase, (3) fase
linear, dan (4) fase stasioner
6. Tipe Pertumbuhan Sel Pada Setiap Fase Penghambat
Siklus Sel

Siklus sel merupakan proses vital dalam kehidupan

setiap organisme. Secara normal, siklus sel menghasilkan
pembelahan sel. Pembelahan sel terdiri dari 2 proses utama,
yaitu replikasi DNA dan pembelahan kromosom yang telah
digandakan ke 2 sel anak. Secara umum, pembelahan sel terbagi
menjadi 2 tahap, yaitu mitosis (M) (pembelahan 1 sel menjadi 2
sel) dan interfase (proses di antara 2 mitosis). Interfase terdiri
dari fase gap 1 (G1), sintesis DNA (S), gap 2 (G2).
Gambar 1. Siklus sel
 Siklus sel dimulai dari masuknya sel dari fase G0
(quiescent) ke fase G1 karena adanya stimulus oleh growth
factor. Pada awal fase G1, Cdk 4 dan atau diaktifkan oleh cyclin
D (cycD). Kompleks Cdk4/6 dengan cycD akan menginisiasi
fosforilasi dari keluarga protein retinoblastoma (pRb) selama
awal G1. Efek dari fosforilasi ini, fungsi histon deasetilasi
(HDAC) yang seharusnya menjaga kekompakan struktur
kromatin menjadi terganggu. Akibatnya struktur DNA menjadi
longgar dan faktor transkripsi yang semula diikat pRb menjadi
lepas dan transkripsi dari E2F responsive genes yang dibutuhkan
dalam progresi siklus sel ke fase Smenjadi aktif.
Gen tersebut antara lain cycE, cycA, Cdc25, DNA
polimerase, timidilat kinase, timidilat sintetase, DHFR,
7. Manfaat Kultur Sel

Istilah kultur sel digunakan untuk berbagai kultur yang

berasal dari sel-sel yang terdispersi yang diambil dari jaringan
asalnya, dari kultur primer, atau dari cell line atau cell strain
secara enzymatik, mekanik, atau disagregasi kimiawi.

Kultur sel bermanfaat untuk :

Produksi metabolit sekunder, obat-obatan, senyawa
flavor/pewangi, pewarna.
Mempelajari metabolisme sel
Menguji pengaruh berbagai senyawa terhadap sel
Mendapatkan biomasa sel untuk kultur protoplas
TERIMA
KASIH