Lumut Physcomitrella patens: metode dan alat dari budidaya yang

ditargetkan analisis fungsi gen

ABSTRAK > Untuk secara komprehensif memahami proses utama dalam
biologi tanaman, perlu untuk mempelajari satu set beragam spesies yang
mewakili kompleksitas tanaman. Penelitian ini akan membantu untuk
memahami mekanisme dilestarikan umum dan prinsip-prinsip, serta untuk
menjelaskan mereka mekanisme yang spesifik untuk clade tanaman
tertentu. Dengan demikian, kita akan mendapatkan pengetahuan tentang
penemuan dan hilangnya mekanisme dan dampak biologis mereka
menyebabkan spesifikasi yang berbeda di seluruh kerajaan tanaman.
Sejak berdirinya tanaman transgenik, studi ini berkonsentrasi pada
penjelasan fungsi gen menerapkan repertoar peningkatan molekul teknik.
Dalam dua dekade terakhir, lumut Physcomitrella patens bergabung set
mapan model tanaman berdasarkan posisi evolusionernya menjembatani
uniseluler ganggang dan pembuluh darah tanaman dan sejumlah fitur
tertentu mengurangi analisis fungsi gen. Di sini, kami ingin memberikan
gambaran tentang fitur spesifik P. patens menjadikannya sebagai model
yang menarik untuk berbagai bidang penelitian di biologi tanaman, untuk
menyajikan prestasi besar di P. patens rekayasa genetika, dan untuk
memperkenalkan teknik umum untuk ilmuwan yang berniat untuk
menggunakan P. patens sebagai model dalam kegiatan penelitian mereka.

Hal. 7-10
Mikroinjeksi DNA
Teknik lain untuk transformasi sel tumbuhan awalnya dikembangkan untuk sel embrio
stem murine (Brinster et al., 1982) melibatkan injeksi DNA asing dengan jarum injeksi
langsung ke dalam sel atau bahkan langsung ke inti. Untuk injeksi DNA, filamen lumut telah
dibudidayakan secara lengkap kegelapan untuk memungkinkan penetrasi dinding sel. Bahkan
paparan gelap-tumbuh filamen menjadi cahaya selama 10 menit mencegah injeksi yang tepat.
Jarum injeksi juga harus diperkenalkan ke dalam sel-sel di daerah basal yang tepat dengan
inti, karena semua upaya untuk menyuntikkan sel di daerah ujung mengakibatkan di
pecahnya sel. Injeksi dari neon hijau protein (GFP) ekspresi membangun ke P. patens
protonema sel tip menghasilkan tingkat transformasi sekitar 50% (BRUCKER et al., 2000).
Karena hanya ekspresi GFP transient memiliki dianalisis, apakah teknik ini dapat digunakan
untuk menghasilkan garis transgenik stabil dan ditargetkan mutan KO belum telah dinilai.
Pengiriman Biolistic DNA
Teknik pertama terutama dikembangkan untuk transformasi sel tumbuhan dan yang
juga berlaku untuk transformasi P. patens, adalah partikel atau gen teknologi gun yang

memberikan DNA biolistically langsung ke jaringan tanaman beragam (Klein et al., 1988).
Metode transformasi Biolistic tidak terbatas pada spesifik tanaman atau jenis jaringan dan
fungsi dengan efisiensi yang sama di monokotil dan tanaman dikotil (Sawahel et al., 1992).
InP.patens, transformasi sementara dicapai dengan menembak emas atau tungsten partikel
DNA-dilapisi protonemal hidup jaringan (Cho et al., 1999, Cove et al., 2009c). Namun,
sejauh ini, generasi transforman stabil dan P.patensknockout ditargetkan mutan menggunakan
pengiriman Biolistic DNA belum dilaporkan.
Transformasi PEG-dimediasi protoplas
Penyerapan DNA langsung PEG-dimediasi dalam protoplas adalah Teknik yang
paling umum untuk mengubah P. patens dan untuk menghasilkan baris knockout ditargetkan
(Schaeferet al., 1991). Untuk tujuan ini, isolasi protoplas (Cove et al., 2009b) dari P. patens
jaringan diperlukan dengan driselase, campuran enzim multikomponen yang mengandung
selulase, pektinase, laminarinase, xilanase, dan amilase. Selama prosedur transformasi, PEG
menstabilkan protoplas dan membungkus DNA untuk memungkinkan molekul bermuatan
negatif untuk lulus membran sel. Setelah proses transformasi, protoplas dapat beregenerasi
menjadi sel dengan dinding sel utuh dalam osmotik disesuaikan media yang mengandung
glukosa cair sebelum mereka dipindahkan ke medium padat selektif ditambah dengan
antibiotik masing. tanaman berubah dipilih untuk dua kali 14 hari pada medium selektif,
terganggu oleh jangka waktu 14 hari pada medium non-selektif (Egener et al, 2002;.. Cove et
al, 2009b; Liu dan Vidali, 2011). Keuntungan utama dari metode ini adalah transformasi
tinggi Efisiensi sambil mempertahankan tingkat yang relatif rendah beberapa integrasi (Cove,
2000). Transformasi KO konstruk tunggal telah dilaporkan untuk memimpin rata-rata untuk
11 nomor copy, mulai dari integrasi independen di beberapa lokus genom untuk integrasi
concatemers pada lokus genomik tunggal (Cove, 2000, Kamisugi et al., 2006) (Gambar. 4D).
Teknik ini tidak memerlukan perangkat canggih dan dapat dengan mudah diterapkan di
laboratorium standar (Liu dan Vidali, 2011). Selain itu, adalah mungkin untuk mengubah
konstruksi besar hingga 45 kb ukuran fragmen (Cove et al, 2009d.; Liu dan Vidali, 2011).
Target KO dan strategi knockin
Sebuah KO gen yang ditargetkan adalah teknik genetik untuk menonaktifkan gen
yang menarik di suatu organisme dengan sepenuhnya mengganti atau menghancurkan urutan
gen melalui HR. knockout yang dihasilkan mutan digunakan untuk menyimpulkan fungsi
yang diketahui, tetapi masih uncharacterised, gen. Independen dari organisme, generasi
mutan KO selalu mengikuti strategi yang sama (Gambar. 5A). Untuk menghasilkan garis KO
ditargetkan, P. patens protoplas yang transfected dengan konstruk gangguan gen yang
melabuhkan dipilih penanda kaset dalam hamparan urutan gen bunga. Setelah laporan
pertama pada tingkat HR tinggi di P. Patens (Kammerer dan Cove, 1996; Schaefer dan Zrd,
1997), bukti konsep yang berbasis HR KO ditargetkan gen nuklir adalah layak dilakukan oleh
gangguan gen PpFtsZ pengkodean homolog protein plastidic ke protein FtsZ dari Escherichia
coli yang sangat penting untuk pembelahan sel bakteri. Mengingat asal prokariotik plastida,
penghapusan gen PpFtsZ Berikut gen strategi knockout ditargetkan dihapuskan kloroplas
divisi dan menyebabkan pembentukan macrochloroplasts (Strepp et al., 1998). Pada

prinsipnya, konstruksi gangguan ini dapat dihasilkan dari daerah genom, termasuk intron atau
masing-masing daerah diperkuat dari cDNA. Untuk mengganggu beberapa lokus genomik
independen dan untuk menghasilkan mutan dengan beberapa penghapusan gen, beberapa
pilihan kaset penanda telah ditetapkan untuk P. patens: G418 / neomycin perlawanan kaset
nptII, hygromycin resistensi kaset hpt / aph4, zeomycin perlawanan kaset zeo, sulfadiazin
perlawanan kaset sul. Selain generasi garis KO ditargetkan P. patens memungkinkan untuk
generasi ditargetkan garis knockin, di mana daerah genom dapat digantikan oleh homolog
dari spesies lain untuk komplementasi gen Studi atau urutan sekering pengkodean protein
reporter, seperti b-glucuronidase (GUS) dan GFP versi (kuning / cyan / red) (YFP / CFP /
RFP), dengan urutan coding gen dari bunga untuk mengaktifkan lokalisasi dan interaksi studi
(Nakaoka et al., 2012) (Gambar. 5B).
Berlebih dan transgen ekspresi
Overekspresi ektopik dan konstitutif gen adalah Pendekatan berlawanan dengan
sistem gugur yang ditargetkan dalam analisis gen fungsi. Dengan demikian promotor
heterolog atau endogen adalah digunakan untuk mengontrol ekspresi gen yang diinginkan
dan untuk meningkatkan jumlah produk gen. Untuk berlebih promotor heterolog ektopik,
seperti virus mosaik kembang kol (CaMV) 35Spromoter, bacterialnospromoter, atau beras
(Oryza sativa) aktin 1 (Act1) promotor, secara rutin digunakan dalam P. patens. analisis
kuantitatif beragam promotor di P. patens mengungkapkan bahwa CaMV 35S, yang secara
luas digunakan untuk transgen ekspresi dalam biji tanaman, tidak memberi tarif ekspresi
tinggi di patens P. kontras dengan sekitar 10 kali padi kuat Act1 promotor (Horstmann et al.,
2004). Atau, endogen P.patenspromoters gen housekeeping, seperti encoding mereka
ubiquitin dan actin5, yang menampilkan relatif luas dan konstitutif Ekspresi yang terbukti
menyebabkan tingkat berlebih tinggi transgen. Baru-baru ini, sebuah sistem ekspresi gen
diinduksi memiliki telah didirikan di P. patens memungkinkan temporal dikontrol ekspresi
transgen. Sistem ini bergantung pada ekspresi faktor transkripsi yang diaktifkan pada bestradiol mengikat dan kemudian mengikat urutan aktivasi terletak hulu transgen, sehingga
berunding ekspresi transgen diinduksi pada aplikasi b-estradiol (Nakaoka et al., 2012).
Interferensi RNA (RNAi)
Dalam dua kasus, analisis gen melalui strategi knockout yang ditargetkan adalah
padat karya atau bahkan tidak berlaku. Dalam kasus pertama, beberapa gen mungkin
memiliki fungsi berlebihan dan, oleh karena itu, satu KO salah satu gen ini tidak akan
menyebabkan fenotipe menyimpang. Di sini, KO mutan beberapa perlu dihasilkan untuk
menutup bawah redundansi, sebuah proses yang memakan waktu, khususnya ketika gen
tunggal terganggu secara berurutan. Dalam kasus kedua, gen protein encoding dengan fungsi
penting tidak dapat dianalisis oleh strategi sistem gugur karena gangguan gen akan
mematikan. Pada tahun 2003, mekanisme interferensi RNA (RNAi) menunjukkan
sepenuhnya fungsional dalam patens P. yang memungkinkan knockdown tertentu gen, selain
generasi mutan knockout ditargetkan (Bezanilla et al., 2003). Oleh karena itu, cDNA daerah
yang dimaksudkan Target transkrip kloning ke dalam kaset ekspresi sebagai repeat terbalik
yang dipisahkan oleh daerah lingkaran. Setelah transkripsi, efektor membangun ini

menghasilkan transkrip yang lipatan kembali ke struktur batang lingkaran dengan wilayah
RNA sebagian untai ganda sempurna cocok dengan urutan transkrip sasaran. ini ganda RNA
beruntai diakui oleh mesin RNAi endogen dan diolah menjadi RNA campur kecil (Sirnas)
yang mengikat dan memediasi degradasi transkrip sasaran serumpun dihasilkan di
membungkam gen posttranscriptional (Gbr. 6). Dengan pemilihan a dilestarikan wilayah
cDNA bersama oleh anggota yang berbeda dari gen keluarga, pendekatan ini memungkinkan
pembungkaman simultan dari seluruh keluarga gen. Selain itu, adalah mungkin untuk
melakukan pembungkaman gen dua target independen oleh dua mengulangi terbalik
bersarang, masing-masing homolog dengan satu gen sasaran. The diinduksi berlebih dari
seperti efektor membangun RNAi digunakan untuk membungkam bersamaan gen PpFtsZ2-1
dan RFP konstitutif menyatakan, dengan pembentukan macrochloroplast dan mengurangi
sinyal RFP (Nakaoka et al., 2012) sebagai hasilnya.
Gen knockdown oleh microRNAs buatan (miRNAs)
Salah satu kelemahan dari pendekatan RNAi untuk mempelajari fungsi gen oleh
posttranscriptional membungkam gen adalah pengolahan beragam set dari Sirnas dari
wilayah RNA untai ganda yang mungkin membungkam off-target dan menyebabkan efek
samping yang tidak diinginkan. Untuk menghindari ini efek negatif, pembungkaman gen
yang sangat spesifik endogen Mekanisme melalui microRNAs (miRNAs) telah dieksploitasi.
miRNAs dikodekan oleh gen Mirna (gen MIR) yang ditranskripsi menjadi RNA yang
sebagian lipat kembali menjadi karakteristik jepit rambut-seperti struktur. Berbeda dengan
transkrip beruntai ganda yang dihasilkan oleh konstruksi efektor RNAi konvensional, hanya
satu spesifik RNA kecil - Mirna matang - diproses dan dibebaskan dari wilayah didefinisikan
dari transkrip prekursor Mirna. Matang Mirna kemudian memediasi pembelahan transkrip
target (Gambar. 7). Teknik ini didirikan pada P. patens dengan kloning kaset ekspresi yang
terdiri dari MIR319a dilestarikan gen dari A. thaliana di mana Mirna menghasilkan wilayah
itu digantikan oleh urutan dirancang untuk menargetkan gen PpFtsZ2-1, sambil
mempertahankan struktur hairpin seperti sekunder keseluruhan ath-miR319a alami prekursor
transkrip (Khraiwesh et al., 2008). Tanaman transgenik berubah dengan ini buatan Mirna
(amiRNA) Ekspresi membangun benar diproses PpFtsZ2-1 amiRNA dari prekursor. Lebih
lanjut, amiRNA mampu menargetkan PpFtsZ2-1 transkrip dan menyebabkan belahan dada
dan posttranscriptional pembungkaman transkrip PpFtsZ2-1. The PpFtsZ2-1 amiRNA
terbukti downregulate tingkat transkrip PpFtsZ2-1 efisien menyebabkan pembentukan
macrochloroplasts yang phenocopied fenotip dilaporkan untuk PpFtsZ2-1 mutan knockout
(Strepp et al., 1998).
Maju atau mundur genetika untuk menjawab pertanyaan biologi di P. Patens
Saat reverse genetic adalah metode pilihan untuk fungsional Studi gen di P.
patens karena merupakan tanaman model tunggal di yang gangguan gen oleh
penargetan gen adalah efisien praktis. Dengan demikian, pemilihan gen dari
bunga yang akan terganggu adalah berdasarkan prediksi bioinformatika atau
indikasi eksperimental. Namun demikian, sebagai sekitar 1/3 dari P. patens
transkrip tidak menunjukkan homologi signifikan dengan gen dari spesies lain
(Nishiyama et al, 2003;.. Lang et al, 2005), ada tertentu permintaan berisi maju

genetika layar untuk menentukan Novel fungsi gen. genetika maju adalah
pendekatan klasik untuk menghubungkan gen ke fenotipe tertentu dan, dengan
demikian, untuk memperoleh informasi tentang gen fungsi. Mutan dengan
fenotipe diubah terisolasi dari koleksi mutan jenuh yang telah dihasilkan oleh
aplikasi agen mutagenik dan mutasi yang mendasari diidentifikasi dan diisolasi
oleh, misalnya, berbasis peta kloning (Peters et al., 2003). Kimia atau UV
mutagenesis layak untuk P. patens (Cove et al., 2009a) dan mutan yang
dihasilkan oleh methylnitronitrosoguanidine mutagenesis spora menunjukkan
perubahan dalam gravitropisme yang terisolasi (Ksatria et al., 1991), namun,
untuk pengetahuan kita, yang mendasari mutasi menyebabkan penyimpangan
fenotipik tidak dapat diidentifikasi sejauh ini. Salah satu alasan adalah kurangnya
penanda molekuler yang cukup tersedia dari berbagai P. patens ekotipe yang
memungkinkan peta berbasis kloning dari lokus genomik yang terkena di mutan
tersebut. Namun demikian, satu set pertama dari 110 urutan sederhana
mengulangi (SSR) spidol menampilkan polimorfisme ukuran antara ekotipe
Gransden dan yang Villersexel-K3 ekotipe dapat diidentifikasi (von Stackelberg et
al., 2006). Selanjutnya, 42 marka SSR yang dikombinasikan dengan tambahan
1.378 diperkuat panjang fragmen polymorphism (AFLP) spidol diidentifikasi dari
populasi pemetaan yang dihasilkan oleh persimpangan dari Gransden dan
ekotipe Villersexel-K3 untuk 31 kelompok linkage (Kamisugi et al., 2008). Selain
itu, setelah rilis dari urutan genom lengkap dari P. patens Gransden ekotipe
(Rensing et al., 2008), ini dikombinasikan SSR dan AFLP peta bisa berlabuh ke
urutan genom dari 94 dari 2106 urutan perancah (genom versi 1.1). Namun, ini
gabungan dan genom-berlabuh peta genetik perlu disempurnakan untuk layak
kloning berbasis peta dalam pendekatan genetik depan. Selain bahan kimia atau
UV mutagenesis, koleksi mutan P. patens telah dihasilkan oleh transformasi
konstruksi penyisipan tag berasal dari gDNA atau cDNA perpustakaan yang
cocok untuk integrasi dengan HR. Dalam pendekatan pertama, perpustakaan
DNA genom yang dihasilkan dan tag dengan mutagenesis shuttle dan
transposon Mini mengandung gen penanda dipilih atau promoterless tambahan
uidA (GUS) reporter konstruk gen (gen trap) (Nishiyama et al., 2000). Atas
transformasi menjadi patens P. dan seleksi, total 5.264 stabil tanaman transgenik
berubah itu ditemukan dari mana 203 mutan menunjukkan penyimpangan
perkembangan dan morfologi. Pada tumbuhan stabil berubah dengan konstruksi
gen perangkap, GUS Kegiatan terdeteksi histokimia pada jaringan yang berbeda,
termasuk daun muda, sel-sel apikal tunas muda, dan chloronema dan sel
caulonema. Terkait hal itu, garis penambah perangkap telah dihasilkan di mana
CaMV 35S minimal promotor menyatu dengan gen reporter uidA untuk
menyaring elemen penambah berdekatan (Hiwatashi et al., 2001). Pendekatan
lain mengikuti strategi yang sama untuk menghasilkan tag mutan penyisipan,
tetapi gen penanda dipilih diperkenalkan ke perpustakaan cDNA oleh transposondimediasi mutagenesis shuttle (Egener et al., 2002). konstruksi penyisipan tag
berasal dari perpustakaan cDNA diasumsikan untuk mengintegrasikan disukai
oleh HR dalam ditranskrip gen dan yang berasal dari gDNA akan
mengintegrasikan seluruh seluruh genom. transformasi-throughput tinggi dari
random dan didefinisikan kolam konstruksi penyisipan tag cDNA yang diturunkan
mengakibatkan koleksi mutan dari 65.198 tanaman stabil berubah yang telah

dikelompokkan ke dalam 16 kategori sesuai dengan penyimpangan dalam

pembangunan, parameter morfologi, fisiologi, dan pertumbuhan (Schween et al.,
2005). mutan fenotip katalog yang disimpan ke dalam database dicari (mossDB)
dan cryopreserved untuk penyimpanan jangka panjang. Meskipun generasi
koleksi mutan menggunakan konstruksi penyisipan tag berasal dari gDNA dan
cDNA perpustakaan menghasilkan tingkat tinggi berbagai fenotipe menyimpang
di P. patens laporan tentang identifikasi gen yang terkena dampak masih hilang
dan mungkin karena beberapa penyebab. (I) Analisis molekuler dari tag mutan
penyisipan mengungkapkan beberapa integrasi independen lokus dalam genom
baik karena peristiwa integrasi tidak sah atau integrasi dari beberapa konstruksi
independen oleh HR, menghambat identifikasi mutasi menyebabkan fenotip. (Ii)
Integrasi konstruksi bersambung menjadi lokus genomik adalah diamati
(Gambar. 4D) dan, akibatnya, polymerase chain reaction (PCR) berbasis teknik
untuk mengisolasi mengapit daerah, seperti TAIL-PCR, adaptor-ligasi-dimediasi
PCR, atau terbalik PCR, yang tak dapat diterapkan. (Iii) Daerah 5'dan 3'-mengapit
dari ditransformasikan konstruksi yang homolog dengan daerah endogen dan,
oleh karena itu, perlu dibedakan dari urutan kromosom mengapit situs
penyisipan di hasil sequencing penyelamatan plasmid atau PCR berbasis metode
yang disebutkan di atas. (Iv) Co-transformasi tulang punggung vektor dapat
mengintegrasikan ke dalam DNA genom dengan IR dan mungkin mendasari
fenotipe berubah.
Sebuah metode alternatif yang menjanjikan untuk mengidentifikasi gen baru ke
depan pendekatan genetika menggunakan teknologi sequencing generasi untuk
sequencing lengkap DNA nuklir dari tipe liar dan mutan dan selanjutnya analisis
bioinformatika canggih (Nordstrm et al., 2013). Metode ini memungkinkan
simultan deteksi mutasi dan urutan pemulihan yang sesuai lokus. Dengan
penurunan biaya sekuensing, generasi sekuensing dapat berubah menjadi
teknologi tinggi-throughput untuk menganalisis ada atau baru P. patens mutan
yang dihasilkan oleh beragam genetika maju pendekatan.
Prospek masa depan
Kemajuan lebih lanjut dalam identifikasi penanda molekuler akan
memperbaiki peta genetik dari P. patens mengaktifkan kloning berbasis peta
mutasi yang mendasari fenotip berubah mutan yang dihasilkan oleh pendekatan
genetika depan. Selain itu, generasi koleksi mutan berisi dengan transformasi
DNA konstruksi yang berfungsi jangkar sebagai molekuler untuk analisis mutan
sangat diinginkan. Protokol untuk salib genetik di P. Patens telah ditetapkan dan
digunakan lebih sering untuk mengeksploitasi kekuatan eksperimental genetika
tanaman. Sudah didirikan Stock Pusat Internasional Moss (IMSC; www.mosssaham-pusat. org) membuka jalan untuk memberikan P. patens luas koleksi
mutan untuk maju atau mundur genetika dengan cara yang sebanding dengan
sumber daya A. thaliana yang tersedia. The IMSC saat ini terdiri 39 ekotipe
berbeda P. patens, Physcomitrium, dan Funaria dan 64 tambahan transgenik P.
patens garis, terutama yang mewakili diterbitkan garis KO ditargetkan disimpan
dalam kriopreservasi. Di masa depan, semua dilaporkan transgenik P. patens
garis harus disimpan di IMSC untuk memperpanjang ke sumber daya serbaguna
menyediakan mutan untuk P. patens genetika.