Nama : Zauharotul Azizah Febriyani

Nim : 201851328

Pemilihan metode Kloning :

1. Metode berbasis pencernaan restriksi tidak efisien dan mengharuskan gen yang Anda
minati tidak memiliki situs restriksi internal yang sama seperti yang ada di MCS
2. Metode berbasis gateway sangat kuat
3. Kloning ligasi-independen jauh lebih efektif daripada reaksi ligasi
Cara kerja sel BL21(DE3) (penekan T7RNAPol dan lacI yang dikodekan dengan host)
Gagasan umum tentang garis sel bakteri yang berbeda untuk mengoptimalkan ekspresi:
a) promotor yang berbeda
b) meningkatkan stabilitas mRNA
c) Defisiensi protease Lon/OmpT
d) Sel Rosetta2 dan optimasi kodon
Ide dasar pemilihan plasmid dan antibiotik.
Metode kloning yang berbeda (ligasi, LIC, Gateway)
Cara kerja PCR – penggunaan DNAPol proses untuk menghemat waktu
Transformasi bakteri
Meningkatkan kelarutan protein dengan ekspresi sebagai protein fusi, dan pasangan mana yang
bekerja paling baik.
Pembelahan in-vivo protein dari pasangan fusi
Ekspresi bersama dengan pendamping molekuler
Ide dasar pemurnian protein
a) afinitas nikel (Histrap)
b) Pengecualian ukuran
c) pertukaran ion
d) noda barat
e) hidrofobik
Pertanyaan
1. Bagaimana proses host protein ekspression?
Host untuk ekspresi protein
a. DE3
1. Represor lac yang dikodekan oleh inang menekan transkripsi RNA Pol inang dari
T7 RNA Pol dari promotor lac.
2. Induksi IPTG mematikan lac Repressor dan memungkinkan host RNA Pol untuk
mentranskripsi T7 NAPol.
3. T7 RNA Pol mentranskripsi gen dari promotor T7 pada plasmid.
4. Kekurangan protease Lon/OmpT
b. DE3_pLysS
1. Strain DE3 memiliki ekspresi yang bocor, yang menyebabkan masalah protein yang
diekspresikan bersifat toksik
2. Lisozim T7 yang dikodekan oleh plasmid menghambat T7 RNA Pol dan
mengurangi ekspresi bocor.
c. Host untuk cloning
Host ini tidak memiliki T7 RNA Pol , sehingga cocok untuk amplifikasi plasmid dan
bukan ekspresi protein.
2. Yang di maksud yang LIC? Ligation-independent cloning
3. Cara kerja LIC?
Day 1 (~6.5 hr)
1. Gen PCR dari vektor SUMBER (50l) (80’)
2. Verifikasi pada gel agarosa bahwa gen tersebut diamplifikasi (10l) (40’)
3. Mencerna sampel yang tersisa dengan DpnI dan melakukan pembersihan PCR (75’)
4. Digest vektor DESTINATION dan fragmen PCR dengan T4 DNA Pol untuk
menghasilkan overhang untai tunggal (60’)
5. Tambahkan fragmen PCR 100ng ke vektor tujuan 15ng dan biarkan anil di atas es
(30')
6. Berubah menjadi sel superkompeten XL10Gold (100') dan piring semalaman.
Day 2 ((~2.5 hr)
Lakukan PCR koloni pada 2-4 koloni untuk memverifikasi gen yang dimasukkan ke
dalam vektor:
- pilih koloni dengan ujung pipet
- resuspend dalam 50 l air steril dan vortex untuk mencampur
- ambil 1l untuk PCR untuk memverifikasi sisipan (120')
- menyuntik sampel yang tersisa di TB untuk pertumbuhan semalam
- jika gen dimasukkan, lakukan miniprep (30’)
- Verifikasi konstruksi dengan sekuensing DNA
4. Jelaskan Vektor LIC untuk pembelahan in-vivo dari protein fusi? Pembelahan in-vivo
membantu menghilangkan ekspresi positif palsu.Co-ekspresikan protease TVMV
dengan protein fusi, dengan TVMV di bawah kendali promotor yang berbeda dari yang
digunakan untuk protein fusi.
5. Fungsi dari DNA J/K? mengikat polipeptida yang baru lahir, tameng tambalan
hidrofobik yang terbuka dari melipat dengan tidak baik
6. Fungsu dari GrpE ?
mengikat polipeptida yang dilepaskan dari DnaK/J melepaskan polipeptida menjadi
bentuk terlipat atau antar-jemput ke GroEL/ES
7. Berapa kali volume kolom untuk pemecahan kolom? 20x
8. Pada hari ke-2 proses LIC setelah proses resuspend dalam 50 l air steril dan vortex
untuk mencampur apa yang dilakukan ? ambil 1l untuk PCR untuk memverifikasi
sisipan (120')
9. Kenapa melakukan furifikasi ? agar bias di manfaatkan isi dalam bakteri tersebut yang
sudah terkandung didalmnya untuk antibody, dan identifikasi.
10. Jelaskan Cara kerja sel BL21 ? penekan T7RNAPol dan lacI yang dikodekan dengan
host
11. Ide dasar pemurnian protein ?
a) afinitas nikel (Histrap)
b) Pengecualian ukuran
c) pertukaran ion
d) noda barat
e) hidrofobik
12. Elemen dasar plasmid/vector
pET dikembangkan oleh WF Studier & BA Moffatt pada tahun 1986
Ap = ampicillin resistance
ori = ColE1/pBR322 asal replikasi
lacI = penekan lac; mengikat lacO sampai induksi IPTG
T7P = T7 Promotor polymerase
lacO = operator lac tempat represor lac mengikat
13. Jelaskan Ekspresi protease TVMV dihari 1 dan ke 2?
Transformasikan sel Rosetta 2 dengan plasmid yang mengandung gen tvmv dan pelat
semalaman, Transformasikan sel Rosetta 2 dengan plasmid yang mengandung gen
tvmv dan pelat semalaman
14. Transformasi bakteri ?
Penambahan DNA plasmid ke sel, diikuti dengan kejutan dingin dan kejutan panas
memungkinkan plasmid masuk melalui lubang kecil di dinding sel. (Bisa juga
menggunakan elektroporasi untuk membuat pori-pori di dinding sel).
Perkuat jumlah sel di media SOC.
Plate pada agar LB (+ antibiotik) untuk memilih sel yang ditransformasi saja (resistensi
antibiotik diberikan oleh gen yang dikodekan oleh pada plasmid).
15. Jelaskan proses PCR and processive DNApol ?
mengurangi fragmen berat molekul rendah
mengurangi waktu perpanjangan dari 1’/kb menjadi 10-20”/kb, jadi amplifikasi tipikal
membutuhkan waktu ~1 jam, bukan 3-4 jam.
NEB Phusion (dbd) & Takara Speedstar (berbasis antibodi)