TINJAUAN PUSTAKA

A. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ( RT-PCR )

Reaksi berantai polimerase transkripsi-balik (lebih dikenal dengan

nama bahasa Inggris: reverse transcription polymerase chain reaction atau RT-PCR)

adalah teknik amplifikasi DNA komplemen dengan RNA virus melalui reaksi berantai

polimerase yang menggunakan enzim transkriptase balik. Proses amplifikasi

menggunakan sepasang primer oligonukleotida pada sekuen gen spesifik. Reaksi

berantai polimerase transkripsi-balik umumnya digunakan pada berbagai macam agen

penyakit.

Salah satu deteksinya yang umum ialah pada virus flu burung. Selain itu,

reaksi berantai polimerase transkripsi-balik dijadikan sebagai penanda

molekuler untuk analisis asam nukleat pada uji koronavirus. Hasil pengujian dari

reaksi berantai polimerase balik bersifat cepat dan dapat diandalkan. Keuntungan lain

dalam penggunaannya adalah proses penargetan dan identifikasi patogen yang

spesifik. Reaksi berantai polimerase transkripsi-balik mulai dikembangkan setelah

diketahui mampu melakukan identifikasi genomik dan proteomik dari SARS-CoV-2.

Metode reaksi berantai polimerase transkripsi-balik menghasilkan analisis secara

kualitatif.

Deteksi ekspresi gen pada reaksi berantai polimerase transkripsi-balik terdiri

dari tiga tahap. Tahap pertama isolasi RNA total, kemudian dilanjutkan

dengan sintesis DNA komplemen, dan diakhiri dengan amplifikasi daerah transkip

gen target. Tahpan-tahapannya secara rinci sebagai berikut:

 Tahap pertama adalah isolasi RNA. Sampel klinis pada tahap ini berasal dari

jaringan tubuh, seperti darah, spesimen biopsi jaringan, dan kultur

sel atau kultur jaringan. Tujuan isolasi RNA adalah untuk

 mendapatkan mRNA yang terkandung dalam sel. Isolasi RNA dimulai dengan

melisiskan sel dan inti sel, lalu dilanjutkan dengan pemisahan DNA/RNA

dan protein dengan metoda presipitasi protein, pemisahan RNA dan DNA

dengan enzim DNase dan terakhir melakukan penyimpanan RNA dalam

ddH2O bebas enzim nukleasi. Larutan RNA yang diperoleh langsung

dianalisis dan dapat pula disimpan dalam jangka waktu lama pada suhu -80°C.

 Tahap kedua adalah sintesis DNA komplemen, yaitu mengubah RNA

khususnya mRNA gen target menjadi DNA komplemen. Enzim yang

digunakan ialah enzim transkriptase balik dan Oligo (dT) 15 primer. Larutan

DNA komplemen yang akan digunakan secepatnya harus disimpan pada suhu

2-8°C bila selama 1-2 jam. Sedangkan suhu -15 °C hingga -25°C diterapkan

pada penyimpanan dalam jangka waktu lama.

 Tahap ketiga adalah amplifikasi daerah transkrip gen target. Proses amplifikasi

menggunakan primer oligonukleotida yang spesifik. Amplikon DNA

komplemen akan dihasilkan jika reaksi berantai polimerase dilakukan dengan

metode dua langkah. Kegunaan amplikon ini sebagai ekspresi transkrip gen

target yang dapat divisualisasi secara biokimia dengan elektroforesis pada

gel agarose. Penerapan klinis dari reaksi berantai polimerase transkripsi-balik

ialah visualisasi ekspresi mRNA BRLF1 EBV pada penderita kanker

nasofaring.

Dalam prosedur reaksi berantai polimerase transkripsi-balik, perlu diperhatikan hal-

hal berikut:

1. Alat-alat yang bebas dari RNAseRNA sangat rentan terhadap RNAse yang

menyebar di lingkungan, sehingga sangat dianjurkan menggunakan alat-alat yang

bebas dari RNAse, seperti tabung Eppendorf dan tip mikropipet.

2. Aluminium dianjurkan sebagai pelapisan pada

peralatan laboratorium berbahan gelas. Degradasi RNAse melalui sterilisasi pada

suhu >180°C selama 2 jam.

3. Reagen dan larutan yang digunakan sebaiknya bebas RNAse. Dapat pula diberi

perlakuan dengan dietil pirokarbonat (DEPC) 0,1 % v/v yang telah disterilisasi.

4. Tris Hidroklorida tidak boleh diperlakukan dengan Dietil pirokarbonat, karena

bersifat sangat reaktif.

5. Menggunakan sarung tangan berbahan karet pada saat melakukan isolasi RNA.

Tutup tabung eppendorf hanya dilakukan dalam waktu yang singkat.

6. Meja laboratorium dibersihkan sebelum bekerja, Bahan pembersihnya berupa

larutan natrium hipoklorit, etanol dengan kandungan 70 %, atau 0,1 % Sodium

Dodesil Sulfat;

7. Penyimpanan RNA dalam waktu yang lama dianjurkan pada suhu -80 °C.

8. Isolasi RNA diperlakukan di atas es (suhu 4 °C) selama bekerja.

9. Penyimpanan stok isopropanol dalam waktu yang lama dilakukan pada suhu -80

°C.

10. Reagen transkriptase balik disimpan pada suhu -20 °C. Pengerjaan di atas es suhu

4 °C diterapkan pada saat melakukan sintesis DNA komplemen

11. Penyimpanan DNA dan reagen dalam waktu yang lama dianjurkan pada suhu -80

°C.

12. Preparasi untuk membuat campuran reaksi dilakukan di atas es dengan suhu 4 °C.

13. Penyimpanan amplikon selama 1-2 hari menerapkan suhu 4 °C. Anjuran yang

umum untuk produk reaksi adalah pada suhu -20 °C untuk penyimpanan waktu

lama. Tujuannya adalah menghindari degradasi oleh aktivitas 5’-eksonuklease

dari enzim Taq polimerase.

 Reaksi berantai polimerase transkripsi-balik multiprima (RT-PCR multiprima)

RT-PCR multiprima mendeteksi ekspresi mRNA gen laten pada biopsi

jaringan tumor, kultur sel dan darah secara sensitif . Secara simultan, teknik ini

mendeteksi ekspresi mRNA EBV yaitu EBNA1, EBNA2, LMP1, LMP2A, LMP2B,

BZLF1, BARTs, dan U1A snRNP. Dalam deteksi, gen-gen tersebut dianggap sebagai

gen rumah tangga untuk kontrol internal kuantitas RNA. Selanjutnya,

dilakukan hibridisasi amplikon fragmen DNA komplemen dengan pelacak

oligoneukleotida spesifik. Sebelum hibridisasi, masing-masing pelacak dilabeli

dengan radioaktif agar meningkatkan spesifitas.[9] Autoradiografi pada film sinar-

X menjadi visualisasi amplikon fragmen DNA komplemen yang menunjukkan

ekspresi transkrip gen laten. RT-PCR multiprima sensitif dalam mendeteksi mRNA

yang mengalami proses pembuangan intron dalam jumlah kecil. Selain itu, teknik ini

sesuai pada deteksi yang memerlukan lebih sedikit jumlah sampel klinis. Kualitas

kontrolnya juga dapat diandalkan pada biopsi jaringan limfoma dengan jumlah

sedikit. Kuantitas RNA perlu diukur terlebih dahulu sebelum sampel dianalisis

dengan teknik gel elektroforesis RNA untuk mendeteksi 18S RNA atau 28S RNA.

Profil ekspresi transkrip gen laten EBV khususnya pada ekspresi gen laten I, II, dan

III pada biopsi jaringan, kultur sel, dan darah sesuai diperiksa dengan teknik ini.

B. Escherichia Coli (Bl21) Star

E. coli BL21(DE3) merupakan salah satu jenis strain bakteri yang dapat

digunakan sebagai sel inang untuk transformasi karena efisiensinya yang cukup

tinggi, yaitu 1,9x105 CFU/ng/mL untuk pBR322 dan 2 x 105 CFU/µg untuk 1 µg

pUC19 (Liu dkk., 2014). Bakteri ini digunakan sebagai sel inang berbagai jenis

plasmid, contohnya pRSETB (Saraniya dkk., 2012), pET-32b(+)-IFN α2a

(Kusumawati dkk., 2013), dan pGEM-T (Retnoningrum dkk., 2010).

 E. coli merupakan prokariota, yang tidak memiliki kemampuan untuk

melakukan pelipatan protein asing dan modifikasi pasca-translasi lain, sehingga tipe

protein yang dapat diekspresikan E. coli juga terbatas. Ketidakmampuan prokariota

untuk memproduksi versi autentik dari protein eukariota, pada umumnya disebabkan

oleh pelipatan protein (folding) yang tidak tepat dan tidak adanya mekanisme

modifikasi pascatranslasi. Protein yang diekspresikan E. coli pada umumnya

diperoleh sebagai protein intraselular yang sering menghasilkan badan inklusi yang

tidak larut (dalam kasus ekspresi tinggi) dan tidak mengalami pelipatan dengan benar,

sehingga harus dilarutkan dan dilakukan pelipatan ulang (Makrides, 1996).

Pertumbuhan E.coli BL21 rekombinan juga dapat berpengaruh terhadap

produksi protein rekombinan. Pertumbuhan E.coli BL21 rekombinan berhubungan

dengan waktu inkubasi dan kepadatan sel. Semakin lama waktu inkubasi, semakin

padat sel yang dihasilkan. Banyaknya sel yang dihasilkan sebanding dengan

banyaknya protein rekombinan yang dihasilkan. Protein rekombinan yang dihasilkan

oleh E.coli merupakan protein intraseluler, sehingga perlu dilakukan proses lisis sel

untuk mengekstraksi protein rekombinan. Berbagai metode telah diketahui dapat

melisiskan sel antara lain metode enzimatik, metode mekanik, dan metode kimiawi.

Metode lisis sel yang saat ini digunakan oleh divisi Riset vaksin TB yaitu metode lisis

enzimatik dengan menggunakan enzim lysozyme.

Penggunaan E. coli sebagai sistem ekspresi dipilih karena sistem ini

mempunyai tingkat ekspresi yang tinggi, media pertumbuhannya murah, serta mudah

dilakukan peningkatan skala produksi untuk industri. Bagaimanapun, penggunaan

sistem ini untuk produksi protein yang berasal dari genom eukariota yang

membutuhkan modifikasi pasca-translasi menimbulkan masalah karena

mikroorganisme yang sederhana ini tidak memiliki mesin intraselular untuk

 melakukan modifikasi pasca-translasi. Sehingga ekspresi protein rekombinan dalam

E. coli sangat tergantung pada struktur primer, sekunder, tersier dan fungsi

karakteristik dari protein tersebut (Daly & Hearn, 2004).

C. Protein Rekombinan

Protein Rekombinan merupakan protein yang diperoleh dari hasil teknologi

DNA rekombinan. Kemajuan teknologi DNA rekombinan telah mendorong

berkembangnya berbagai metode produksi protein rekombinan menggunakan inang

yang aman dan relatif mudah dikultur sehingga protein dapat diproduksi pada skala

industri. Sebagian besar enzim yang digunakan untuk proses industri merupakan hasil

rekayasa, baik rekayasa pada tingkat genetik maupun protein. Melalui teknologi DNA

rekombinan dapat dilakukan pemindahan gen pengode enzim/protein dari satu

organisme ke organisme lain. Sehingga bila enzim/protein tersebut diidentifikasi

sebagai kandidat enzim untuk digunakan dalam industri, gen pengode enzim/protein

tersebut dapat dikloning dalam suatu mikroorganisme inang yang cocok, dan

diproduksi dalam skala industri. Dengan cara ini produksi enzim industri dengan

kualitas dan kemurnian yang tinggi dapat dilakukan.

D. Transformasi Plasmid

Plasmid merupakan molekul DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi

(memperbanyak diri) secara mandiri dan ditemukan dalam sel prokariot dan eukariot.

Secara alami plasmid terdapat pada bakteri dan beberapa organisme eukariot seperti

Saccharomyces ceriviseae. Ukuran plasmid bervariasi antara 1 kb sampai 200 kb.

Dalam penelitian rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai kendaraan molekuler

untuk memasukkan gen dari luar ke dalam sel inang (Palomares et al. 2004; Yadav et

al. 2011).
 Transformasi merupakan salah satu kemampuan bakteri untuk mengambil

DNA asing ke dalam sel. Kemampuan ini dimanfaatkan oleh peneliti untuk

memperbanyak suatu gen. Gen yang telah diinsersikan ke dalam plasmid dimasukkan

ke dalam bakteri dengan metode transformasi (Brown, 2010). Transformasi yang

terjadi pada DNA rekombinan dalam plasmid ini tidak terjadi secara alami, melainkan

harus diinduksi oleh zat-zat tertentu. Sel bakteri yang telah mengalami suatu

perlakuan fisik sehingga dapat memperoleh kemampuan untuk mengambil DNA

asing adalah sel kompeten (Brown, 2010). Selain itu, sel kompeten ini juga dapat

mengambil DNA plasmid sirkuler. Sel biasa hanya dapat melakukan transformasi

DNA linier (Sword, 2003). Transformasi yang terjadi pada DNA rekombinan dalam

plasmid ini tidak terjadi secara alami, melainkan harus diinduksi oleh zat-zat tertentu.

Sel bakteri yang telah mengalami suatu perlakuan fisik sehingga dapat memperoleh

kemampuan untuk mengambil DNA asing adalah sel kompeten (Brown, 2010). Selain

itu, sel kompeten ini juga dapat mengambil DNA plasmid sirkuler. Sel biasa hanya

dapat melakukan transformasi DNA linier (Sword, 2003).

Transformasi dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu heatshock atau

kejutan panas, elektroporasi (Casali dan Preston, 2003), dan coldshock atau kejutan

dingin (Ng, 2009). Metode kejutan panas merupakan metode transformasi yang paling

mudah dilakukan dibandingkan metode lainnya. Metode ini menggunakan prinsip

kejutan suhu, yaitu 42oC, selama 90 detik (Hanahan dkk., 1983) atau 120 detik

sehingga dinding sel bakteri terbuka dan plasmid dapat masuk dalam sel (Sambrook

dan Russel, 2001). Tranformasi kejutan panas memerlukan persiapan sel yang siap

ditransformasi atau sel kompeten. Sel kompeten dibuat dalam kondisi dingin 4 oC,

sehingga terjadi kejutan suhu pada sel kompeten ketika ditempatkan pada suhu 42oC.

Sel kompeten dibuat dengan cara merendam sel dalam larutan garam klorida, seperti
 CaCl2, MnCl2, dan MgCl2, untuk meningkatkan permeabilitas membran sel sehingga

plasmid dapat masuk ke dalam sel (Brown, 2010).

E. Purifikasi Enzim ( Ion Metal Affinity Chromatography Dan Ion Exchange

Chromatography)

Purifikasi atau pemurnian enzim merupakan salah satu cara untuk

meningkatkan aktivitas spesifik enzim CCA. Beberapa metode purifikasi yang dapat

dilakukan diantaranya adalah presipitasi dengan amonium sulfat dan dialisis. Pada

penelitian ini, presipitasi amonium sulfat dilakukan untuk mengendapkan pengotor

dan menjaga enzim CCA tetap dalam keadaan terlarut, dengan menambahkan sedikit

garam amonium sulfat. Proses ini disebut salting in. Proses presipitasi dengan

amonium sulfat sebaiknya diikuti dengan proses dialisis yang dapat menghilangkan

sisa garam amonium sulfat dalam sampel (Duong-Ly dan Gabelli 2014).

Purifikasi enzim adalah proses yang bertujuan untuk meningkatkan kemurnian

enzim yang dinyatakan sebagai aktivitas spesifik enzim. Kemurnian enzim ini penting

karena adanya beberapa senyawa kontaminan yang dapat mempengaruhi kerja enzim,

misalnya menghambat aktivitas enzim (inhibitor) atau memiliki kemampuan yang

mirip dengan enzim target namun menghasilkan produk yang berbeda atau tidak

diinginkan

F. Enzim Pfu Polimerase

Pfu DNA polimerase merupakan salah satu jenis enzim yang digunakan dalam

reaksi PCR (polymerase chain reaction).[1] PCR ini banyak digunakan dalam berbagai

penelitian dibidang molekuler untuk memperbanyak sekuen DNA. Enzim Pfu DNA

polimerase mampu memperpanjang rantai DNA dalam suatu siklus. Sumber utama

enzim ini adalah Pyrococcus furiosus.[2] Keunggulan utamanya dibandingkan dengan

enzim DNA polimerase lainnya ialah waktu paruhnya yang sangat lama dan adanya

mekanisme perbaikan rantai DNA yang salah (proofreading).[1] Selain itu, enzim ini

bersifat termostabil atau bersifat tahan suhu tinggi.

Mekanisme proofreading-nya adalah 3'-5' eksonuklease. Melalui

mekanisme proofreading, suatu kesalahan penambahan basa DNA saat amplifikasi

dapat diperbaiki. Aktivitas proofreading ini memiliki keakuratan yang sangat tinggi

sehingga enzim ini sering kali digunakan dalam reaksi pemanjangan primer, kloning,

dan amplifikasi rantai DNA ujung tumpul (blunt end). Enzim DNA polimerase asal

Pyrococcus furiosus (PolPfu) merupakan salah satu enzim yang digunakan secara luas

di laboratorium bioteknologi untuk melakukan amplifikasi DNA pada teknik PCR. 

Enzim ini bersifat high fidelity karena mempunyai aktivitas proof reading dan

mempunya nilai error rate sekitar 1.3 x 10-6 (jumlah terjadinya frekuensi mutase per

base pair setiap terjadinya duplikasi).  DNA polimerase famili-B dari P. furiosus

bersifat termostabil dan mempunyai fidelitas yang tinggi (high-fidelity) sehingga

enzim ini sangat berguna jika diaplikasikan pada teknik PCR.  Sifat fidelitas enzim

PolPfu ini diperkirakan sekitar 10 kali lebih besar dibandingkan dengan enzim DNA

polimerase asal Thermus aquaticus (Taq DNA Polimerase) yang sangat umum dipakai

pada teknik PCR. Tingginya akurasi sintesis DNA sebagai karakter dari PolPfu

disebabkan adanya aktivitas 3'-5' proof reading pada domain eksonuklease.  

Enzim DNA Polimerase PolPfu Inventpro merupakan enzim DNA polimerase

rekombinan yang dikembangkan dalam sistem ekspresi E.coli berbasis gen sintetik. 

Enzim ini bersifat high fidelity polymerase sehingga mempunyai kemampuan untuk

meminimalkan terjadi kesalahan (erroneous) penggabungan nukleotida terhadap

cetakannya pada saat terjadi proses ekstensi utas DNA (growing DNA strand) dan

dapat meningkatkan akurasi sintetesis DNA.  Enzim DNA polimerase PolPfu

Inventpro sangat baik untuk digunakan dalam teknik PCR terutama untuk tujuan
 cloning gen, ekspresi gen, studi mutagenesis, sekuensing nukleotida, dan teknik

lainnya yang memerlukan enzim DNA polimerase dengan aktivitas proof-reading.

REFERENSI

https://id.wikipedia.org/wiki/Pfu_DNA_polimerase#:~:text=Pfu%20DNA%20polimerase

%20merupakan%20salah,rantai%20DNA%20dalam%20suatu%20siklus.

https://dev.ipb.ac.id/page/inventpro

https://id.wikipedia.org/wiki/Pfu_DNA_polimerase#:~:text=Pfu%20DNA%20polimerase

%20merupakan%20salah,rantai%20DNA%20dalam%20suatu%20siklus.

http://e-journal.uajy.ac.id/12544/3/BL013212.pdf

https://media.neliti.com/media/publications/129617-ID-transformasi-plasmid-ptrli-dengan-

teknik.pdf

https://www.researchgate.net/publication/

282121300_Produksi_protein_rekombinan_dalam_sistem_ekspresi_Pichia_pastoris/

link/560375d108ae460e2704e16f/download

https://e-journal.unair.ac.id/BIKK/article/view/1523

https://id.wikipedia.org/wiki/Reaksi_berantai_polimerase_transkripsi-balik

http://e-journal.uajy.ac.id/12544/2/BL013211.pdf