INTRODUCTION

Sintesis protein bebas sel , juga dikenal sebagai sintesis protein in vitro atau CFPS , adalah
produksi protein menggunakan mesin biologis dalam sistem bebas sel , yaitu tanpa menggunakan
sel hidup. Lingkungan sintesis protein in vitro tidak dibatasi oleh dinding sel atau kondisi
homeostasis yang diperlukan untuk mempertahankan kelangsungan hidup sel.
KEGUNAAN (+)
Untuk Pembentukan ATP {ADRENALINE TRYFOSFAT} yaitu,senyawa yang digunakan oleh
sel organisme M.H. sebagai Energi untuk melakukan aktivitas.Selain itu sintetis protein juga
berguna sebagai bahan penyusun DNA dan RNA yang sintetis protein itu sendiri berlangsung di
Ribosom. Dan Peneliti di San Diego State University mengemukakan bahwa saat ini,sintetis
protein juga bisa digunakan untuk mengetasi flu.
DNA YANG DAPAT DIGUNAKAN
Terdapat dua jenis, yaitu DNA plasmid dan templat ekspresi linier (LETs). Plasmid berbentuk
lingkaran, dan hanya dibuat di dalam sel. LET dapat dibuat lebih efektif melalui PCR, yang
mereplikasi DNA jauh lebih cepat dibandingkan membesarkan sel dalam inkubator. Meskipun
LET lebih mudah dan cepat dibuat, hasil plasmid biasanya jauh lebih tinggi pada CFPS. Peneliti
saat ini berusaha untuk mengoptimalkan hasil CFPS LET agar mendekati hasil CFPS plasmid.
PROSES SINTETIS PROTEIN
Tahap 1-Transkripsi
Dalam proses transkripsi juga terbagi menjadi 3 tahapan sebagai berikut:
1. Inisiasi
RNA polimerase memecah sebagai molekul DNA yang berisi segmen-segmen berupa gen.
Dalam gen, terdapat bagian ujung yang disebut promoter dan terminator. RNA polimerase akan
bergerak dari bagian terminator ke promoter untuk memecah DNA. Jika RNA polimerase telah
berhasil di bagian promoter maka proses inisiasi ini selesai.
2. Elongasi
Proses ini yaitu saat RNA polimerase kembali ke terminator setelah mencapai promoter,
sehingga terbentuklah mRNA yang akan menyalin kode genetik pada DNA.
3. Terminasi
Proses terakhir transkripsi yaitu ketika untaian mRNA telah selesai terbentuk dan lepas dari DNA
untuk pergi ke ribosom.

Tahap 2 - Translasi
Ketika mRNA yang membawa salinan DNA berhasil membawanya ke ribosom, terjadilah proses
translasi yaitu proses penerjemahan atau penguraian kode-kode genetik hasil salinan DNA yang
sudah dibawa mRNA sebelumnya. Kode genetik ini yang akan menghasilkan polipeptida sebagai
penyusun protein.
Translasi juga terbagi ke dalam 3 tahap, berikut diantaranya:
1. Inisiasi
Pada tahap ini mRNA datang membawa kodon-kodon DNA sampai ke ribosom. Kodon pertama
yang bertemu ribosom disebut kodon start atau AUG.
2. Elongasi
Kodon yang dibawa mRNA akan diuraikan atau diterjemahkan menjadi asam amino kemudian
masing-masing digabung dengan tRNA yang membawa asam amino untuk menyusun protein.
Sehingga gabungan tersebut akan membentuk rantai polipeptida.
3. Terminasi
Proses translasi terakhir yaitu saat salah satu kodon stop antara UAA, UAG, atau UGA bertemu
dengan ribosom yang kemudian menjadi kodon stop atau AUU.

KEUNGGULAN
CFPS memiliki banyak keunggulan dibandingkan sintesis protein in vivo tradisional . Yang
paling penting, reaksi bebas sel, termasuk persiapan ekstrak, biasanya memakan waktu 1 –2 hari,
sedangkan ekspresi protein in vivo mungkin memerlukan waktu 1–2 minggu.
CFPS adalah reaksi terbuka. Kurangnya dinding sel memungkinkan manipulasi langsung
terhadap lingkungan kimia. Sampel mudah diambil, konsentrasinya dioptimalkan, dan reaksinya
dapat dipantau. Sebaliknya, begitu DNA dimasukkan ke dalam sel hidup, reaksi tidak dapat
diakses sampai proses tersebut selesai dan sel tersebut dilisis.
Keuntungan lain CFPS adalah kurangnya kepedulian terhadap toksisitas. Beberapa protein yang
diinginkan dan protein berlabel bersifat racun bagi sel ketika disintesis. Karena sel hidup tidak
digunakan, toksisitas protein produk tidak menjadi masalah yang signifikan.
KETERBATASAN
Salah satu tantangan yang terkait dengan CFPS adalah degradasi DNA oleh
nuklease endogen dalam ekstrak sel. Hal ini khususnya menjadi masalah pada LET. Sel
memiliki endonuklease yang menyerang lokasi acak pada untaian DNA; namun, yang lebih
umum adalah eksonuklease yang menyerang DNA dari ujungnya. Karena plasmid berbentuk
lingkaran dan tidak memiliki ujung tempat menempelnya eksonuklease, mereka tidak
terpengaruh oleh eksonuklease. LET, bagaimanapun, rentan terhadap keduanya. Karena
kerentanan LET, banyak penelitian saat ini difokuskan pada optimalisasi hasil CFPS LET agar
mendekati hasil CFPS menggunakan plasmid.
Salah satu contoh peningkatan perlindungan dengan plasmid adalah penggunaan
protein bakteriofag lambda gam. Gam adalah penghambat RecBCD , eksonuklease yang
ditemukan di Escherichia coli ( E. coli ). Dengan penggunaan gam, hasil CFPS dengan LETs
meningkat pesat, dan sebanding dengan hasil CFPS dengan plasmid. [15] Ekstrak MURNI juga
dapat dibuat, menghilangkan kekhawatiran eksonuklease. Ekstrak ini mahal untuk dibuat dan
saat ini bukan merupakan solusi ekonomis terhadap masalah degradasi DNA eksogen.

Jumlah asam amino yang terlibat di dalam sintesis protein adalah 20. Namun, urutan asam amino
tersebut dikode sepenuhnya oleh DNA. Adapun hasil akhir dari sintesis protein ini adalah
terbentuknya protein fungsional, seperti enzim, hormon, keratin, dan haemoglobin.
Pelaku sintetis protein RNA nongenetik adalah RNA yang berperan dalam sintesis protein. Nah,
RNA terbagi menjadi tiga macam, yaitu mRNA, tRNA, dan rRNA.

Kebanyakan sistem sintesis protein bebas sel didasarkan pada ekstrak sel, yang seringkali
mengandung aktivitas yang tidak diinginkan. Sebaliknya, sistem yang dibentuk kembali terdiri
dari sejumlah komponen yang dimurnikan dan rekombinan dengan aktivitas nuklease dan
protease yang minimal. Unit ini menjelaskan penggunaan sistem rekonstitusi komersial tertentu,
"PURExpress®" Sistem ini memungkinkan sintesis protein in vitro dari mRNA dan cetakan
DNA sirkular dan linier, serta pelabelan protein ko-translasi. Uniknya pada sistem ini, semua
komponen protein rekombinan dalam sistem diberi tag-Nya, sehingga memungkinkan pemurnian
protein tak bertanda yang disintesis dengan menghilangkan komponen sistem lainnya. Protein
yang baru disintesis seringkali dapat dilihat pada gel SDS-PAGE dan langsung diuji fungsinya
tanpa pelabelan dan pemurnian. Komponen tertentu dari sistem, seperti ribosom atau faktor
pelepasan, dapat dihilangkan untuk aplikasi tertentu. Versi "delta" dari sistem ini sangat cocok
untuk studi translasi bakteri, pengujian fungsi ribosom, penggabungan asam amino yang tidak
alami, dan tampilan perpustakaan protein ribosom.

Dalam sistem ini, dan berbeda dari sistem bebas sel berbasis ekstrak, semua komponen
makromolekul penting yang diperlukan untuk transkripsi dan translasi in vitro dimurnikan dari
E. coli dan disuplai sebagai dua campuran larutan (A dan B). Larutan A mengandung tRNA dan
molekul kecil termasuk asam amino dan rNTP, sedangkan Larutan B mengandung ribosom dan
komponen protein seperti T7 RNA polimerase, faktor translasi, sintetase aminoasil-tRNA, dan
enzim regenerasi energi. Kedua campuran larutan diuji dengan protokol kendali mutu standar,
menunjukkan kontaminasi protease dan nuklease yang minimal. RNA polimerase T7 dalam
sistem memungkinkan transkripsi gen di bawah promotor T7 menjadi mRNA, yang kemudian
diterjemahkan menjadi protein dalam reaksi yang sama. Oleh karena itu, sistem memiliki
fleksibilitas dalam menggunakan DNA plasmid, DNA linier (misalnya dari PCR), atau mRNA
sebagai cetakan untuk sintesis protein in vitro. Hasil sintesis protein akhir rata-rata dari sistem ini
adalah sekitar 100 ng/µl. Semua komponen protein dalam sistem diberi tanda His, kecuali
ribosom. Fitur ini memungkinkan protein yang disintesis dimurnikan dengan cepat hanya dengan
menghilangkan ribosom dari campuran sintesis melalui ultrafiltrasi dan menghilangkan protein
yang diberi tag-Nya melalui perawatan menggunakan resin nikel, sehingga hanya menyisakan
protein murni yang baru disintesis. Dengan menggunakan sistem ini, protein yang diinginkan
dapat disintesis dan dimurnikan dalam waktu sekitar 5 jam.

Kebanyakan sistem sintesis protein bebas sel didasarkan pada ekstrak sel, yang seringkali
mengandung aktivitas yang tidak diinginkan.