Machine Translated by Google

Anais da Academia Brasileira de Ciências (2019) 91(2): e20180945

(Annals of the Brazil Academy of Sciences)
Versi cetak ISSN 0001-3765 / Versi online ISSN 1678-2690
http://dx.doi.org/10.1590/0001-3765201920180945
www.scielo.br/aabc | www.fb.com/aabcjournal

Korelasi tergantung posisi antara metilasi TBX22 exon 5 dan

fusi rak palatal dalam perkembangan celah langit-langit

KE LI1 , XUAN SHU1 , HUI GONG2 , LIUHANGHANG CHENG1 , ZEJUN DONG1 dan SHENYOU SHU1

1
Pusat Perawatan Bibir Sumbing dan Langit-langit, Rumah Sakit Afiliasi Kedua Universitas Shantou
Medical College, 69, Dongxia North Road, Distrik Jinping, Shantou, 515041, Cina
2
Departemen Ginekologi, Rumah Sakit Afiliasi Kedua Medis Universitas Shantou
Perguruan Tinggi, 69, Dongxia North Road, Distrik Jinping, Shantou, 515041, Cina

Naskah diterima pada 10 September 2018; diterima untuk diterbitkan pada tanggal 30 November 2018

Bagaimana mengutip: LI K, SHU X, GONG H, CHENG L, DONG Z DAN SHU S. 2019. Korelasi tergantung posisi
antara metilasi TBX22 ekson 5 dan fusi rak palatal dalam perkembangan celah langit-langit. Sebuah Acad Bras Cienc
91: e20180945. DOI 10.1590/0001-3765201920180945.

Abstrak: Metilasi DNA sangat penting untuk ekspresi gen yang diatur secara spatiotemporal dalam perkembangan
embrionik. TBX22 (Chr X: 107667964-107688978) berfungsi sebagai penekan transkripsional mempengaruhi
pengikatan DNA, sumoylasi, dan represi transkripsi yang terkait dengan langit-langit mulut sumbing terkait-X.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan dan mekanisme potensial antara metilasi TBX22 exon 5 dan
palatal shelf fusion yang diinduksi oleh all-trans retinoic acid (ATRA). Kami melakukan profil metilasi DNA,
menggunakan MethylRAD-seq, setelah sekuensing throughput tinggi embrio tikus dari kontrol (n=9) dan perlakuan
ATRA (untuk menginduksi langit-langit mulut sumbing, n=9) tikus C57BL/6J pada hari-hari kehamilan embrionik (E) 13,5 , 14.5 dan 16
TBX22 ekson 5 mengalami hipermetilasi di situs CpG pada E13.5 (P=0,025, log2FC=1,5) dan E14.5 (P=0,011,
log2FC:1.5) pada perlakuan ATRA, sedangkan metilasi TBX22 ekson 5 pada CpG lokasi tidak berbeda nyata pada
E16.5 (P=0.808, log2FC=-0,2) antara kontrol dan perlakuan ATRA. Hasil MSP menunjukkan tren serupa yang
konsisten dengan hasil MethylRAD-seq. qPCR menunjukkan perubahan tingkat ekspresi TBX22 ekson 5 berkorelasi
negatif dengan tingkat metilasi TBX22 ekson 5-nya. Hasil ini menunjukkan bahwa perubahan dalam metilasi TBX22
ekson 5 mungkin memainkan peran pengaturan penting selama fusi rak palatal, dan dapat mencerahkan
pengembangan biomarker epigenetik baru dalam pengobatan CP di masa depan.
Kata kunci: metilasi DNA, celah langit-langit, TBX22, situs CpG.

PENGANTAR dan biasanya terjadi pada posisi C5 sitosin dalam pulau

Metilasi DNA adalah peristiwa epigenetik yang memainkan
peran penting dalam regulasi ekspresi gen temporal dan
spasial selama perkembangan embrio (Shiota 2004). Ini
adalah proses di mana gugus metil ditambahkan ke
molekul DNA
Korespondensi dengan: Shenyou Shu
Email: syshu@stu.edu.cn
ORCid: https://orcid.org/0000-0001-9283-4114
CpG DNA genom (Barrès et al.
2009, Law dan Jacobsen 2010), di mana wilayah gen-
ekson (badan gen) menggunakan metilasi untuk menekan
ekspresi ekson atau mempengaruhi transkripsi gen antara
ekson pengkode pertama dan ekson terakhir (Chuang et al.
2012, Gelfman dkk. 2013). Metilasi promotor dikaitkan
dengan pembungkaman gen (Zaidi et al. 2010), dan
metilasi intergenik dapat memengaruhi ekspresi gen
melalui regulasi penambah

ILMU BIOMEDIK An Acad Bras Cienc (2019) 91(2)

Machine Translated by Google

KE LI dkk. TBX22 EXON 5 METILASI TERLIBAT DALAM CLEFT PALATE

(Stadler dkk. 2011). Selama embriogenesis, metilasi DNA menyebabkan substitusi asam amino nonkonservatif

dari sekuens genom tertentu atau bahkan seluruh dari treonin menjadi metionin (Braybrook et al. 2001b).
kromosom secara definitif menonaktifkan transkripsi gen Metilasi DNA dapat secara signifikan meningkatkan laju
untuk kompensasi dosis, seperti kromosom X (Li et al. mutasi CÿT spontan pada dinukleotida CpG (Ehrlich dan
1993, Beard et al. 1995), atau dalam sel yang Wang 1981, Hwang dan Green 2004, Mugal dan Ellengren
berdiferensiasi (Kafri et al. 1992). Kegagalan untuk 2011). Namun, tidak jelas apakah metilasi TBX22 ekson
membentuk pola metilasi normal dapat mengakibatkan 5 terlibat fusi palatal embrionik yang diinduksi oleh
pembentukan celah langit-langit (Bliek et al. 2008, pajanan ibu terhadap all-trans retinoic acid (ATRA).
Kuriyama et al. 2008, Loenarz et al. 2010).
Celah langit-langit (CP) adalah malformasi kongenital
di mana faktor genetik dan lingkungan terlibat, dan
Untuk mengeksplorasi mekanisme metilasi TBX22
disebabkan oleh kegagalan rak langit-langit untuk
ekson 5 selama fusi rak palatal embrionik, kami
menyesuaikan diri di garis tengah dan menyatu (Vieira
mengintegrasikan data metilasi untuk TBX22 ekson 5 dari
2008, Stuppia et al. 2011, Rahimov et al. 2012 ). Fusi
data MethyRAD-seq sebelumnya, menggunakan MSP
palatal melibatkan tidak hanya gangguan temporal dan
dan qPCR untuk memvalidasi metilasi TBX22 di situs
spasial yang diatur dari epitel tepi medial palatal embrionik
CpG di ekson 5, dan metilasi DNA yang berkorelasi
(MEE), tetapi juga proses seluler dan molekuler dinamis
dengan tingkat ekspresi TBX22 exon 5 mRNA untuk
yang menghasilkan adhesi dan interkalasi MEE embrionik
menjelaskan keterlibatan metilasi DNA selama fusi rak
untuk membentuk lapisan epitel antar-rak, dan selanjutnya
palatal embrionik.
remodeling dan fusi untuk membentuk atap rongga mulut
yang utuh (Rice 2005, Thiery dan Sleeman 2006, Nawshad BAHAN DAN METODE
2008, Bush dan Jiang 2012, Lan et al. 2015). Pada tikus,
HEWAN DAN PERAWATAN
palatal shelf tumbuh pertama kali secara vertikal di rongga
mulut, kemudian naik ke posisi horizontal di atas lidah
Tikus C57BL/6J, berat badan 20–28 g dan usia 8 hingga
pada E13.5. Rak palatal yang berlawanan menempel di
10 minggu, dibeli dari Beijing Vital River Laboratory
sepanjang MEE untuk membentuk lapisan epitel garis
Animal Technology Co.
tengah (MES) di E14.5, kemudian menyelesaikan fusi rak
Ltd. (Beijing, Cina). Dalam penelitian ini, tikus betina
palatal di E16.5 (Gritli Linde 2007). Semakin banyak bukti
dikawinkan dengan tikus jantan dengan berat dan usia
menunjukkan bahwa TBX22 adalah gen yang rentan
yang sama dalam semalam (n=18, 3 kelompok, 3 sampel
untuk CP (Braybrook et al. 2001, Bush et al. 2002, Jiang
yang diberi perlakuan ATRA vs. 3 sampel kontrol). Untuk
et al. 2012).
penelitian ini, ATRA (Sigma-Aldrich, St. Louis., MO, USA)-

TBX22 (Chr X: 107667964-107688978) berfungsi sebagai model celah langit-langit tikus yang diinduksi digunakan,

penekan transkripsi yang mempengaruhi pengikatan dan jaringan rak palatal embrionik direseksi pada E13.5,

DNA, sumoylasi, dan represi transkripsi yang terkait E14.5, dan E16.5, seperti yang dilaporkan sebelumnya

dengan langit-langit sumbing terkait-X (Braybrook et al. (Qin et al. 2014, Shu et al. 2018). Protokol penelitian

2001b). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa mutasi hewan ini telah disetujui oleh Komite Etika Hewan
pada TBX22 ekson 5 memberikan kontribusi yang Laboratorium dari Fakultas Kedokteran Universitas
Shantou
signifikan terhadap prevalensi langit-langit mulut sumbing (Braybrook et (SUMC2015-106;
al. Shantou, Cina), dan
2002, Marçano dkk. 2004, Suphapeetiporn dkk. eksperimen dilakukan sesuai dengan pedoman perawatan
2007). Analisis urutan menunjukkan transisi CÿT pada hewan dari Institut Kesehatan Nasional AS.
TBX22 ekson 5 pada nukleotida 785CÿT yang

An Acad Bras Cienc (2019) 91(2) e20180945 2 | 9

Machine Translated by Google
KE LI dkk.
PENENTUAN TINGKAT METILASI PADA
SITUS CpG TBX22 EXON 5
Untuk menentukan tingkat metilasi DNA penambah di
situs CpG, DNA genom pada E13.5, E14.5, dan E16.5
diekstraksi dari rak palatal tikus embrionik,
menggunakan metode cetyltrimethylammonium
bromide konvensional, dan perpustakaan genom
disiapkan menggunakan MethylRAD ( Cohen-Karni
dkk. 2011, Wang dkk. 2015). Pembacaan bersih
kemudian dilakukan pengurutan ujung berpasangan
pada pengurutan HiSeq X Ten (Illumina Inc, San
Diego, CA, AS), menurut protokol pabrikan, oleh
Shanghai Oebiotech Co. Ltd (Shanghai, Cina).
Menurut urutan referensi, pembacaan enzim individu
dipetakan ke urutan referensi situs CmCGG
menggunakan program SOAP (versi 2.21) (Li et al.
2009).
Perbedaan dalam metilasi DNA di lokasi metilasi yang
berbeda dinilai antara perlakuan ATRA dan kontrol
dalam tiga ulangan biologis.
VALASI METILASI-KHUSUS PCR (MSP)
Tingkat metilasi TBX22 ekson 5 divalidasi
menggunakan MSP. Singkatnya, DNA genom
diekstraksi dari jaringan rak palatal tikus menggunakan
kit ekstraksi DNA cepat (Sino Gene Scientific, China).
Setelah kuantifikasi, 1 g dari setiap sampel DNA
menjadi sasaran modifikasi bisulfit menggunakan kit
modifikasi metilasi DNA (Zymo Laboratories, Inc.,
South San Francisco, CA, USA) dan amplifikasi PCR
sesuai dengan protokol pabrikan. Primer MSP
dirancang untuk memperkuat TBX22 exon 5
menggunakan perangkat lunak online MethPrimer
(http://www.urogene.
org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi), dan disintesis
oleh Sino Gene Biotech (Beijing, China)
(Tabel I). Produk PCR kemudian dipisahkan dalam
gel agarosa 2% dengan elektroforesis, diwarnai
dengan etidium bromida, dan divisualisasikan di
bawah iluminator ultraviolet (JY04S-3C, Beijing).
Pita amplikon yang terlihat jelas dengan
An Acad Bras Cienc (2019) 91(2)
TBX22 EXON 5 METILASI TERLIBAT DALAM CLEFT PALATE
primer spesifik metilasi dianggap sebagai pita metilasi
DNA, dan kerapatan setiap pita dianalisis menggunakan
perangkat lunak analisis citra (Gel-Pro 4.5) untuk
kuantisasi.
VALIDASI qPCR
Untuk memvalidasi data MethylRAD-seq, dilakukan
qPCR pada 18 sampel individu (triplikat).
Primer qPCR yang digunakan dalam penelitian ini
tercantum pada Tabel . Tingkat ekspresi mRNA
dianalisis seperti yang dijelaskan dalam penelitian
sebelumnya, dan metode 2-ÿÿCt digunakan untuk
menghitung tingkat ekspresi gen relatif terhadap
ekspresi -aktin, sebagai kontrol internal (Livak dan Schmittgen 20
ANALISIS STATISTIK
Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan
perangkat lunak statistik SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).
Perbedaan tingkat metilasi, antara kontrol dan
perlakuan ATRA, dinilai menggunakan tepi paket R
R, seperti yang dijelaskan dalam penelitian sebelumnya
(Robinson et al. 2010). Data PCR dianalisis
menggunakan uji-t Student untuk membandingkan
rata-rata antara sampel yang diberi perlakuan ATRA dan sampel
Nilai p <0,05 dan log2 FC >1 dianggap signifikan
secara statistik.
HASIL
MORFOLOGI DAN HISTOLOGI EMBRIONIK
JARINGAN RAK PALATE
Pada bagian histologis palatal shelf dari embrio
kontrol, dapat diamati bahwa palatal shelf terpisah
pada E13.5, berkontak dengan garis tengah pada
E14.5, dan menyatu sempurna pada E16.5, sedangkan
pada bagian histologis palatal dari embrio yang diberi
perlakuan ATRA , rak palatal tetap terpisah tanpa fusi
pada E13.5, E14.5, dan E16.5 (Gbr. 1).
e20180945 3 | 9
Machine Translated by Google

KE LI dkk. TBX22 EXON 5 METILASI TERLIBAT DALAM CLEFT PALATE

Gambar 1 - Morfologi dan histologi jaringan rak langit-langit pada E13.5 (a, A), E14.5(b, B), dan E16.5(c, C) antara kontrol vs.
tikus yang diberi perlakuan ATRA. Tikus hamil diberikan ATRA (70 mg/kg) dengan gavage pada E10.5 untuk membuat model celah langit-langit (CP) pada
tikus C57BL/6J (diperlakukan ATRA). Kelompok kontrol diberi volume minyak jagung yang setara. Tikus hamil dibedah pada E13.5, E14.5, E16.5 (n=24, 3
kelompok, 4 sampel yang diberi perlakuan ATRA vs. 4 sampel kontrol) untuk mendapatkan langit-langit embrionik, dan kemudian bagian koronal dari rak palatal
parafin dan pewarnaan hematoxylin dan eosin dilakukan untuk mempelajari perubahan morfologi dan histologi (n=6, 3 kelompok, 1 sampel yang diberi
perlakuan ATRA vs. 1 sampel kontrol). (A–C) Rak palatal yang tidak menyatu dan terpisah dari embrio tikus yang diberi perlakuan ATRA. sebuah. Rak palatal
dipisahkan. b. Rak palatal menyentuh garis tengah. c. Rak palatal benar-benar menyatu. PS, rak palatal; T, lidah; NS, septum hidung.

TABEL I

Primer TBX22 digunakan untuk MSP dan qPCR.

primer Urutan primer Ukuran (bp)

MF 5ÿ- TTTTTAGATTTTATGTTTATTCGG-3ÿ 100

UF 5ÿ- tAATTTTTAGATTTTATGTTTATTt-3ÿ

UR 5ÿ-TACATAACCCTTATCATCCATCTCATT-3ÿ

Nalar 5ÿ-CTTCTCACACTTTTGCGCCTT-3ÿ 90

Antisens 5ÿ-GTCACTGGGAGAGCCACT-3ÿ

MF: meneruskan urutan primer untuk reaksi metilasi; UF: meneruskan urutan primer untuk reaksi un-metilasi; UR : urutan primer terbalik untuk reaksi un-
metilasi.

An Acad Bras Cienc (2019) 91(2) e20180945 4 | 9

Machine Translated by Google
KE LI dkk.
ANALISIS KOMPREHESIF MethylRAD-seq
DATA UNTUK PENENTUAN TBX22 EXON 5
metilasi
Menurut data MethylRAD-seq, analisis cluster hierarkis
menunjukkan bahwa tingkat metilasi situs yang dimetilasi
secara berbeda di antara langit-langit yang diberi
perlakuan ATRA lebih tinggi daripada kontrol pada E13.5,
E14.5, dan E16.5 (Gbr. 2). TBX22 ekson 5 adalah salah
satu sekuens DNA termetilasi berbeda, berdasarkan
anotasi dan penyelarasan sekuens di MethylRAD. TBX22
(Chr X: 107667964-107688978) ekson 5 (http://asia.
ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=
inti;g=ENSMUSG00000031241;r=X:107667964-
107688978;t=ENSMUST00000118986) (Gbr. 3). Urutan
pembacaan enzim adalah GATTCTATGTCCACCm
CGGACTCCCCTTGCTCT, dengan jelas menunjukkan
bahwa metilasi TBX22 ekson 5 terjadi pada posisi C5
sitosin dalam situs CpG dalam genom.
Menurut MethylRAD-seq, pengobatan ATRA
mengakibatkan hipermetilasi DNA dalam TBX22 ekson 5
di situs CpG pada E13.5 (P=0.025, log2 FC=1.5), dan
E14.5 (P=0.011, log2 FC:1.5) , tetapi tidak ada perbedaan
yang signifikan dalam metilasi, antara perlakuan ATRA
dan kontrol, pada E16.5 (P=0.808, log2 FC=-0,2) (File 1,
2 dan 3). File 1, 2 dan 3 dapat ditemukan di link berikut:
https://
pan.baidu.com/s/1R2M252-jHj6BemXYSduHCw.
Kata sandi: 7qzl.
KONFIRMASI METHILASI TBX22 EXON 5
DI SITUS CpG OLEH MSP
Metilasi TBX22 ekson 5 di situs CpG diperiksa oleh MSP.
Hasil MSP menunjukkan tren serupa yang konsisten
dengan hasil seq MethylRAD. Kepadatan relatif MSP
termetilasi dengan MSP yang tidak termetilasi dalam
perlakuan ATRA meningkat pada E13.5 dan E14.5,
sedangkan metilasi TBX22 ekson 5 di situs CpG tidak
berbeda secara signifikan, dari kontrol, pada E16.5,
menunjukkan bahwa DNA pada TBX22 ekson 5
mengalami hipermetilasi pada E13.5 dan E14.5 pada CP
An Acad Bras Cienc (2019) 91(2)
TBX22 EXON 5 METILASI TERLIBAT DALAM CLEFT PALATE
embrio, tetapi tidak berbeda secara signifikan pada E16.5
pada tikus selama fusi palatal yang diinduksi oleh paparan
ibu terhadap ATRA (Gbr. 4a).
PENURUNAN EKSPRESI TBX22 EXON 5
KORELASI DENGAN METHILASI YANG DITINGKATKAN
Pada E13.5, level ekspresi relatif TBX22 exon 5 dalam
perlakuan ATRA turun
diatur dibandingkan dengan kontrol (P=0,018), serta pada
E14.5 (P=0,008). TBX22 ekson 5 tidak berbeda secara
signifikan antara perlakuan ATRA dan kontrol pada E16.5
(P=0.286) (Gbr. 4b). Ketika membandingkan ekspresi
mRNA dan metilasi, hubungan timbal balik ditemukan
pada TBX22 ekson 5 pada embrio yang diberi perlakuan
ATRA, yang mengindikasikan hipermetilasi pada situs
CpG dalam TBX22 ekson 5, bersamaan dengan
penurunan ekspresi ekson 5 bila dibandingkan dengan
kontrol pada E13.5 dan E14.5.
DISKUSI
Ekspresi gen yang berubah dapat disebabkan oleh mutasi
dan/atau regulasi epigenetik, seperti metilasi DNA, dari
gen. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa
beberapa gen metilasi DNA yang menyimpang terlibat
dalam pembentukan celah bibir dan langit-langit, seperti
CDH1 dan TGF-ÿ3 (Liu et al. 2016, Alvizi et al.
2017). Ada tiga aspek utama dari kontrol molekuler fusi
palatal, yaitu perubahan global, perubahan lokal tingkat
situs (misalnya ekson), dan dampak dari perubahan ini
pada ekspresi gen (Kuriyama et al. 2008, Lan et al. 2015).
Dalam penelitian ini, kami membandingkan profil metilasi
DNA genom-lebar jaringan palatal tikus embrionik antara
ATRA yang diobati dan kontrol pada E13.5, E14.5, dan
E16.5, dan kemudian menilai metilasi dan implikasi TBX22
ekson 5 yang termetilasi secara menyimpang. dalam
pembentukan celah langit-langit. Kami kemudian
mengkonfirmasi data kami menggunakan MSP dan qPCR
dan selanjutnya ditunjukkan, dengan qPCR.
TBX22, mengkodekan faktor transkripsi T-box terkait-
X, dan merupakan penentu genetik utama untuk langit-
langit sumbing familial (Kantaputra
e20180945 5 | 9
Machine Translated by Google

KE LI dkk. TBX22 EXON 5 METILASI TERLIBAT DALAM CLEFT PALATE

Gambar 2 - Peta panas analisis klaster hierarkis dari situs metilasi CmCGG diferensial antara perlakuan ATRA dan kontrol dalam
tahap pengembangan diferensial. Menggunakan teknologi MethylRAD yang dikombinasikan dengan pengurutan Paired-End
pada platform HiSeq X Ten, label yang berisi situs CmCGG diusulkan sebagai urutan referensi. Pembacaan enzim individu
dipetakan ke urutan referensi situs CmCGG menggunakan program SOAP (versi 2.21, parameter: -M4-v2-r0). Untuk menilai
tingkat metilasi situs metilasi diferensial antara perlakuan ATRA dan kontrol untuk tiga ulangan biologis, analisis klaster dilakukan
untuk mengungkapkan lebih lanjut perubahan tingkat metilasi situs CmCGG (n = 18, 3 kelompok, 3 sampel yang diobati dengan
ATRA vs. 3 sampel kontrol). Warna coklat menunjukkan situs hipermetilasi, dan biru menunjukkan situs hipometilasi masing-
masing (P<0,05, log2 FC >1). (a):di E 13.5, (b): E14.5, (c): di E16.5.

dkk. 2011). Beberapa penelitian telah menunjukkan
bahwa ekspresi TBX22 menghilang sebelum palatal
shelf fusion dan dianggap diperlukan untuk
proliferasi mesenchymal dan elevasi palatal shelf
(Marçano et al. 2004, Suphapeetiporn et al. 2007).
Metilasi DNA dapat secara signifikan meningkatkan
laju mutasi CÿT spontan pada dinukleotida CpG
(Ehrlich dan Wang 1981, Hwang dan Green 2004,
Mugal dan Ellegren 2011). Oleh karena itu, metilasi
DNA berkorelasi lebih kuat dengan mutasi CÿT
pada dinukleotida CpG di TBX22 ekson 5. Namun,
mekanisme yang mendasari TBX22 yang terlibat
dalam CP masih belum diketahui.
Dalam penelitian ini, kami mencapai empat
tujuan penelitian untuk menjelaskan peran epigenetik
TBX22 ekson 5 dalam palatogenesis setelah
pembentukan celah langit-langit yang diinduksi
ATRA: 1) identifikasi histologi yang terkait dengan
celah langit-langit (Gbr. 1); 2) identifikasi TBX22
ekson 5 di situs CpG yang terlibat dalam celah
langit-langit; 3) identifikasi perubahan ekspresi
TBX22 ekson 5 terkait dengan celah langit-langit
vs. tingkat metilasi DNA; dan 4) karakterisasi pola
metilasi DNA pada TBX22 ekson 5 di situs CpG.
Namun, penelitian kami saat ini adalah awal dan
lebih banyak penelitian diperlukan untuk mengungkapkan hubungan TB

An Acad Bras Cienc (2019) 91(2) e20180945 6 | 9

Machine Translated by Google

KE LI dkk. TBX22 EXON 5 METILASI TERLIBAT DALAM CLEFT PALATE

Gambar 3 - Situs metilasi TBX22 exon 5 berada di situs CpG (http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g

=ENSMUSG00000031241;r=X:107667964-107688978;t=ENSMUST000000118986).

Gambar 4 - MSP dan qPCR dilakukan pada E13.5, E14.5, dan E16.5 pada ATRA-treaded (kasus) vs. kontrol. MSP: DNA genom diekstraksi dari
jaringan rak palatal tikus menggunakan kit ekstraksi DNA cepat. Setelah kuantifikasi, setiap sampel DNA menjadi sasaran modifikasi bisulfit
menggunakan kit modifikasi metilasi DNA dan amplifikasi PCR. Produk PCR kemudian dipisahkan dalam gel agarosa 2% dengan elektroforesis,
diwarnai dengan etidium bromida, dan divisualisasikan di bawah iluminator ultraviolet.
Pita amplikon yang terlihat berbeda dengan primer spesifik metilasi dianggap sebagai pita metilasi DNA, dan densitas setiap pita dianalisis
menggunakan perangkat lunak analisis gambar (Gel-Pro 4.5) untuk kuantisasi. qPCR: Sampel RNA yang sama digunakan untuk transkripsi terbalik.
cDNA disintesis menggunakan Kit Sintesis cDNA Thermo First. Data qPCR ditampilkan sebagai mean ± SEM, dan metode 2-ÿÿCt digunakan untuk
menghitung tingkat ekspresi gen relatif terhadap ekspresi -aktin, sebagai kontrol internal. Semua reaksi dilakukan dalam rangkap tiga untuk
pengulangan teknis dan biologis (n=18, 3 kelompok, 3 sampel yang diberi perlakuan ATRA vs. 3 sampel kontrol). (a): TBX22 exon 5 validasi tingkat
metilasi oleh MSP. Panjang marker dari atas ke bawah adalah 2000, 1000, 750, 500, 250, dan 100 bp. "U" dan "M" masing-masing menunjukkan
situs yang tidak termetilasi dan termetilasi. Jalur ac: kontrol; Lane AC: ATRA-treated. (b): validasi ekspresi TBX22 exon 5 oleh qPCR. TBX22 ekson
5 pada perlakuan ATRA jelas mengalami penurunan regulasi dibandingkan dengan kontrol pada E 13.5 (P=0.018) dan pada E 13.5 (P=0,008),
TBX22 ekson 5 tidak ada perbedaan tingkat ekspresi yang signifikan pada E16.5 (P= 0,286). MSP, reaksi berantai polimerase spesifik metilasi;
qPCR, kuantitatif nyata-
waktu PCR.

perubahan dan pembentukan celah langit-langit. KESIMPULAN

Ukuran sampel kami relatif kecil, dan rak palatal

diperoleh langsung dari jaringan embrionik tikus yang
dapat dicampur dengan jaringan lain. Kami juga tidak bisa
mengecualikan efek ATRA dan metabolit molekul kecil
endogennya pada methyltransferases, yang
selanjutnya mempengaruhi bias hasil eksperimen
kami. Data kami mengungkapkan situs baru (situs
TBX22 exon 5 CpG) dari metilasi DNA yang terkait
dengan pembentukan celah langit-langit.
Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa
hipermetilasi TBX22 ekson 5 di situs CpG dapat
menghambat ekspresi TBX22 ekson 5 yang diinduksi
oleh ATRA. Perubahan metilasi TBX22 di situs ekson
5 CpG dapat dikaitkan dengan manifestasi
CP. Metilasi DNA di situs TBX22 exon 5 CpG dapat
memberikan dasar untuk penelitian di masa depan
dan dapat berfungsi sebagai target epigenetik masa
depan untuk pengembangan terapi baru untuk CP.

An Acad Bras Cienc (2019) 91(2) e20180945 7 | 9

Machine Translated by Google
KE LI dkk.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pekerjaan ini didukung oleh hibah Proyek National
Science Foundation of China (nomor 81001284)
dan hibah Proyek Natural Science Foundation
dari Provinsi Guangdong (nomor 2015A030313431).
KONTRIBUSI PENULIS
KL: Konsepsi dan desain penelitian, melakukan
eksperimen, menganalisis data, menginterpretasikan
hasil eksperimen, mengedit dan merevisi naskah,
versi final naskah yang disetujui. XS: Eksperimen
yang dilakukan, data yang dianalisis, hasil
eksperimen yang ditafsirkan, versi akhir naskah
yang disetujui. ZJD: Data yang dianalisis. SYS:
Naskah yang telah diedit dan direvisi. HG:
Konsepsi dan desain penelitian, interpretasi hasil
eksperimen, naskah yang diedit dan direvisi, versi
akhir naskah yang disetujui. LHHC: Naskah yang
diedit dan direvisi, hasil eksperimen yang
ditafsirkan, versi naskah akhir yang disetujui.
REFERENSI
ALVIZI L, KE X, BRITO L, SESELGYTE R, MOORE G,
STANIER P DAN PASSOS-BUENO M. 2017. Diferensial
metilasi dikaitkan dengan celah bibir dan langit-langit non-
sindrom dan berkontribusi terhadap efek penetrasi. Sci Rep
7(1): 2441.
BARRÈS R, OSLER M, YAN J, RUNE A, FRITZ T, CAIDAHL K,
KROOK A DAN ZIERATH J. 2009. Metilasi non CpG dari
promotor PGC-1alpha melalui DNMT3B mengontrol kepadatan
mitokondria. Metab Sel 10(3): 189-198.
BEARD C, LI E DAN JAENISCH R. 1995. Hilangnya metilasi
mengaktifkan Xist dalam sel somatik tetapi tidak dalam sel
embrio. Gen Dev 9(19): 2325-2334.
BLIEK B, STEEGERS-THEUNISSEN R, BLOK L, SANTEGOETS
L, LINDEMANS J, OOSTRA B, STEEGERS E DAN DE KLEIN
A. 2008. Analisis jalur genom-lebar gen yang responsif terhadap
folat untuk mengungkap patogenesis celah orofasial pada
manusia. Cacat Lahir Res. Bagian A Clin Mol Teratol 82(9):
627-635.
BRAYBROOK C ET AL. 2002. Ekspresi kraniofasial TBX22 manusia
dan murine berkorelasi dengan langit-langit mulut sumbing
An Acad Bras Cienc (2019) 91(2)
TBX22 EXON 5 METILASI TERLIBAT DALAM CLEFT PALATE
dan fenotipe ankyloglossia diamati pada pasien CPX.
Hum Mol Genet 11: 2793-2804.
BRAYBROOK C, DOUDNEY K, MARÇANO A, ARNASON A,
BJORNSSON A, PATTON M, GOODFELLOW P, MOORE G
DAN STANIER P. 2001. Gen faktor transkripsi T-box TBX22
bermutasi pada celah langit-langit terkait-X dan ankyloglossia.
Nat Genet 29(2): 179-183.
BRAYBROOK C, WARRY G, HOWELL G, MANDRYKO V,
ARNASON A, BJORNSSON A, ROSS MT, MOORE GE DAN
STANIER P. 2001b. Pemetaan fisik dan transkripsi dari celah
langit-langit terkait-X dan wilayah kritis ankyloglossia (CPX).
Hum Genet 108(6): 537-545.
BUSH J DAN JIANG R. 2012. Palatogenesis: mekanisme
morfogenetik dan molekuler perkembangan palatum sekunder.
Pengembangan 139(2): 231-243.
BUSH J, LAN Y, MALTBY K DAN JIANG R. 2002. Isolasi dan
analisis ekspresi perkembangan Tbx22, homolog tikus dari gen
langit-langit sumbing terkait-X manusia.
Dev Dyn 225(3): 322-326.
CHUANG T, CHEN F DAN CHEN Y. 2012. Posisi korelasi
tergantung antara metilasi DNA dan tingkat evolusi ekson
pengkode mamalia. Proc Natl Acad Sci USA 109(39):
15841-15846.
COHEN-KARNI D ET AL. 2011. Keluarga MspJI dari endonuklease
restriksi yang bergantung pada modifikasi untuk studi epigenetik.
Proc Natl Acad Sci USA 108(27): 11040-11045.
EHRLICH M DAN WANG R. 1981. 5-Metilsitosin dalam DNA
eukariotik. Sains 212(4501): 1350-1357.
GELFMAN S, COHEN N, TAHUN A DAN AST G. 2013.
Efek metilasi DNA pada penyambungan kotranskripsi
bergantung pada arsitektur GC dari struktur ekson-intron.
Res genom 23(5): 789-799.
GRITLI-LINDE A. 2007. Kontrol molekuler perkembangan palatum
sekunder. Dev Biol 301(2): 309-326.
HWANG D DAN GREEN P. 2004. Rantai Bayesian Markov Analisis
urutan Monte Carlo mengungkapkan berbagai pola substitusi
netral dalam evolusi mamalia. Proc Natl Acad Sci USA 101(39):
13994-14001.
JIANG R, ZHAO X DAN LIU R. 2012. Celah langit-langit non-
sindrom: analisis mutasi gen TBX22 ekson 5. Arch Med Sci 8
(3): 406-410.
KAFRI T, ARIEL M, BRANDEIS M, SHEMER R, URVEN L,
MCCARREY J, CEDAR H DAN RAZIN A.1992.
Pola perkembangan metilasi DNA spesifik gen pada embrio
tikus dan garis kuman. Gen Dev 6(5): 705-
714.
KANTAPUTRA P, PARAMEE M, KAEWKHAMPA A, HOSHINO A,
LEES M, MCENTAGART M, MASROUR N, MOORE G, PAUWS
E DAN STANIER P. 2011. Bibir sumbing dengan langit-langit
mulut sumbing, ankyloglossia, dan hipodonsia berhubungan
dengan mutasi TBX22. J Dent Res 90(4): 450-
455.
e20180945 8 | 9
Machine Translated by Google
KE LI dkk.
KURIYAMA M, UDAGAWA A, YOSHIMOTO S, ICHINOSE M, SATO K,
YAMAZAKI K, MATSUNO Y, SHIOTA K DAN MORI C. 2008.
Perubahan metilasi DNA selama pembentukan celah langit-langit yang
diinduksi oleh asam retinoat pada mencit.
Celah Langit-langit Craniofac J 45(5): 545-551.
LAN Y, XU J DAN JIANG R. 2015. Mekanisme Seluler dan Molekul
Palatogenesis. Curr Top Dev Biol 115: 59-
84.
HUKUM J DAN JACOBSEN S. 2010. Menetapkan, memelihara dan
memodifikasi pola metilasi DNA pada tumbuhan dan hewan. Nat Rev
Genet 11(3): 204-220.
LI E, BEARD C DAN JAENISCH R. 1993. Peran metilasi DNA dalam
pencetakan genom. Alam 366(6453): 362-365.
LI R, YU C, LI Y, LAM T, YIU S, KRISTIANSEN K AND WANG J. 2009.
SOAP2: alat ultracepat yang ditingkatkan untuk penyelarasan baca
pendek. Bioinformatika 25(15): 1966-1967.
LIU X, QI J, TAO Y, ZHANG H, YIN J, JI M, GAO Z, LI Z, LI N DAN YU Z.
2016. Korelasi proliferasi, metilasi promotor TGF-ÿ3, dan pensinyalan
Smad dalam sel MEPM selama perkembangan celah langit-langit yang
diinduksi ATRA.
Reprod Toxicol 61: 1-9.
LIVAK K DAN SCHMITTGEN T. 2001. Analisis data ekspresi gen relatif
menggunakan PCR kuantitatif real-time dan Metode 2(-Delta Delta
C(T)). Metode 25(4): 402-408.
LOENARZ C, GE W, COLEMAN M, ROSE N, COOPER C, KLOSE R,
RATCLIFFE P DAN SCHOFIELD C. 2010.
PHF8, sebuah gen yang terkait dengan celah bibir/langit-langit dan
keterbelakangan mental, mengkodekan sebuah Nepsilon-dimethyl
lysine demethylase. Hum Mol Genet 19(2): 217-222.
MARÇANO ACB ET AL. 2004. Mutasi TBX22 sering menjadi penyebab
langit-langit mulut sumbing. J Med Genet 41(1): 68-74.
MUGAL C DAN ELLEGREN H. 2011. Variasi tingkat substitusi di situs CpG
manusia berkorelasi dengan divergensi non-CpG, tingkat metilasi dan
konten GC. Genom Biol 12(6): R58.
NAWSHAD A. 2008. Disintegrasi jahitan palatal: mati atau tidak? Itu bukan
lagi pertanyaannya. Dev Dyn 237(10): 2643-2656.
QIN F, SHEN Z, PENG L, WU R, HU X, ZHANG G DAN TANG S. 2014.
Karakterisasi metabolik perkembangan kraniofasial yang diinduksi all-
trans retinoic acid (ATRA) embrio murine menggunakan spektroskopi
resonansi magnetik proton in vivo . PLoS ONE 9(5): e96010.
An Acad Bras Cienc (2019) 91(2)
TBX22 EXON 5 METILASI TERLIBAT DALAM CLEFT PALATE
RAHIMOV F, JUGESSUR A DAN MURRAY J. 2012.
Genetika celah orofasial nonsindromik. Celah Langit-langit Craniofac
J 49(1): 73-91.
RICE D. 2005. Anomali kraniofasial: dari perkembangan hingga patogenesis
molekuler. Curr Mol Med 5(7): 699-722.
ROBINSON M, MCCARTHY D DAN SMYTH G. 2010. edgeR: paket
Biokonduktor untuk analisis ekspresi diferensial dari data ekspresi gen
digital. Bioinformatika 26(1): 139-140.
SHIOTA K. 2004. Profil metilasi DNA pulau CpG untuk diferensiasi dan
perkembangan seluler pada mamalia.
Genom Sitogene Res 105(2-4): 325-334.
SHU X ET AL. 2018. Analisis Metilasi DNA Genom-Wide Selama Fusi
Palatal Mengungkapkan Mekanisme Potensi Metilasi Enhancer yang
Mengatur Transformasi Mesenkim Epitel. DNA Sel Biol 37(6): 560-
573.
STADLER M ET AL. 2011. Faktor pengikat DNA membentuk metilome
tikus di daerah regulasi distal. Alam 480 (7378): 490-495.
STUPPIA L, CAPOGRECO M, MARZO G, LA ROVERE D, ANTONUCCI I,
GATTA V, PALKA G, MORTELLARO C DAN TETÈ S. 2011. Genetika
bibir dan langit-langit sumbing sindrom dan nonsindromik. J Craniofac
Surg 22(5): 1722-1726.
SUPHAPEETIPORN K, TONGKOBPETCH S, SIRIWAN P DAN
SHOTELERSUK V. 2007. Mutasi TBX22 merupakan
sering menjadi penyebab langit-langit mulut sumbing non-sindrom
pada populasi Thailand. Clin Genet 72(5): 478-483.
THIERY J DAN SLEEMAN J. 2006. Jaringan kompleks mengatur transisi
epitel-mesenkim. Nat Rev Mol Sel Biol 7(2): 131-142.
VIEIRA A. 2008. Mengungkap penelitian celah bibir dan langit-langit
manusia. J Dent Res 87(2): 119-125.
WANG S ET AL. 2015. MethylRAD: metode sederhana dan terukur untuk
pembuatan profil metilasi DNA genom-lebar menggunakan enzim
restriksi yang bergantung pada metilasi. Buka Biol 5(11): 150130.
ZAIDI S, YOUNG D, MONTECINO M, LIAN J, VAN WIJNEN A, STEIN J
DAN STEIN G. 2010. Penandaan mitosis gen: dimensi baru untuk
kontrol epigenetik. Nat Rev Genet 11(8): 583-589.
e20180945 9 | 9