Machine Translated by Google

Artikel

Analisis Spatiotemporal Integrasi DNA selama

Transformasi Alami Mengungkapkan Mode
Warisan Nongenetik pada Bakteri
Abstrak Grafis Penulis
Ankur B. Dalia, Triana N. Dalia

Korespondensi
ankdalia@indiana.edu

Secara singkat

Mekanisme dinamis integrasi DNA asing ke dalam

genom bakteri sebagai bagian dari transformasi alami
mengungkapkan bagaimana sifat-sifat baru yang
diperoleh seperti gen resistensi antibiotik
digabungkan dan diekspresikan, sehingga
menjelaskan peran potensial pewarisan produk protein
nongenetik.

Sorotan d
ComM adalah penanda spatiotemporal untuk integrasi DNA selama
transformasi alami

d Replikasi kromosom menyelesaikan heterodupleks yang dibentuk oleh integrasi

ssDNA

d DNA yang baru terintegrasi dengan cepat diekspresikan setelah replikasi

kromosom

d Transformasi alami dapat mendorong nongenetik

pewarisan sifat

Dalia & Dalia, 2019, Sel 179, 1499–1511

12 Desember 2019 ª 2019 Elsevier Inc.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.11.021
Machine Translated by Google

Artikel

Analisis Spatiotemporal Integrasi DNA

selama Transformasi Alami Mengungkapkan
Mode Warisan Nongenetik pada Bakteri
Ankur B. Dalia1,2,* dan Triana N. Dalia1
1Departemen Biologi, Universitas Indiana, Bloomington, IN 47405, AS
2Kontak Utama
*Korespondensi: ankdalia@indiana.edu
https://doi.org/10.1016/j.cell. 2019.11.021

RINGKASAN 1966; Kekurangan, 1962; Piechowska dan Fox, 1971). Setelah diserap
ke dalam sitoplasma, DNA beruntai tunggal (ssDNA) ini dengan cepat
Transformasi alami (NT) adalah mekanisme utama diikat oleh protein termasuk DprA dan protein rekombinasi RecA (Kidane
transfer gen horizontal pada spesies mikroba yang dan Graumann, 2005; Mortier-Barrie`re et al., 2007). Penelitian
mendorong penyebaran faktor penentu resistensi sebelumnya memberikan bukti molekuler yang menunjukkan bahwa
antibiotik dan faktor virulensi. Di sini, kami ssDNA ini dapat langsung diintegrasikan ke dalam genom (Dubnau dan
mengembangkan pendekatan biologis sel untuk Davidoff-Abelson, 1971; Fox dan Allen, 1964; Me´ jean dan Claverys,
mengkarakterisasi dinamika spatio-temporal dari 1984). Dengan demikian, kompleks ssDNA-RecA kemungkinan besar
tidak melakukan pencarian homologi dengan genom, dan RecA
rekombinasi homolog selama NT di Vibrio cholerae.
kemudian mendorong invasi untai untuk menghasilkan perantara D-loop
Hasil kami secara langsung menunjukkan (1) bahwa
beruntai tiga. Setelah invasi untai, cabang-cabang D-loop kemudian
transformasi DNA secara efisien berintegrasi ke dalam diperluas melalui proses yang dikenal sebagai migrasi cabang. Memang
genom sebagai DNA beruntai tunggal, (2) bahwa benar, penelitian terbaru telah mengidentifikasi faktor migrasi cabang
heterodupleks yang dihasilkan diselesaikan dengan spesifik NT (Marie et al., 2017; Nero et al., 2018).
replikasi dan segregasi kromosom, dan (3) bahwa DNA Setelah migrasi cabang, dihipotesiskan bahwa kompleks beruntai tiga
terintegrasi diekspresikan dengan cepat sebelum ini kemudian diproses dengan mekanisme yang belum terselesaikan
pembelahan sel. Kami menunjukkan bahwa kombinasi untuk menghasilkan heteroduplex yang stabil antara DNA transformasi
dari sifat-sifat ini menghasilkan transfer produk gen terintegrasi (tDNA) dan genom. Heteroduplex ini kemudian dapat
nongenetik dalam populasi yang ditransformasikan, diperbaiki (misalnya melalui sistem perbaikan ketidakcocokan) atau
yang dapat mendukung pewarisan fenotipik resistensi diselesaikan dengan replikasi dan segregasi kromosom. Namun, bukti
langsung mengenai langkah-langkah dalam model rekombinasi ini masih
antibiotik pada V. cholerae dan Streptococcus
kurang.
pneumoniae. Jadi, di luar perolehan genetik rangkaian
Di sini, kami mengembangkan dan menggunakan penanda biologis
DNA baru, NT juga dapat mendorong pewarisan sifat sel untuk menguji model ini dan memperluas pemahaman mekanistik
nongenetik selama mekanisme transfer gen horizontal yang kamidilestarikan ini. spatiotemporal integrasi DNA selama NT dalam
tentang dinamika
sel tunggal. Lebih jauh lagi, analisis ini telah mengungkapkan bahwa, di
PERKENALAN luar transfer DNA horizontal yang sebenarnya, NT mempromosikan
mekanisme pewarisan nongenetik yang kurang dihargai yang memiliki
Mikroba dapat memperoleh materi genetik baru dari organisme tetangga implikasi luas terhadap penyebaran sifat-sifat melalui mode HGT ini.
melalui proses yang disebut transfer gen horizontal (HGT).
Salah satu mekanisme HGT adalah transformasi alami (NT), yaitu HASIL
proses dimana beberapa spesies mikroba dapat mengambil DNA bebas
dari lingkungan dan selanjutnya mengintegrasikannya ke dalam Fusi Fluoresen ComM Berfungsi sebagai Penanda untuk
genomnya melalui rekombinasi homolog. NT secara luas dilestarikan Rekombinasi Homolog selama NT Saat ini tidak
pada beragam spesies bakteri (Lorenz dan Wackerna-gel, 1994), ada alat yang tersedia untuk menentukan kapan sel secara aktif
termasuk pada banyak bakteri patogen yang dapat mendorong perolehan menjalani rekombinasi homolog selama NT, sehingga membatasi
dan penyebaran faktor penentu resistensi antibiotik dan faktor virulensi pemahaman kita tentang proses ini. Fusi fluoresen ke RecA tidak
(Blokesch, 2016). Meskipun penelitian telah dilakukan selama 90 tahun memenuhi kebutuhan ini karena RecA berinteraksi
sejak penemuan NT (Griffith, 1928), banyak aspek integrasi DNA selama dengan ssDNA segera setelah penyerapan (Kidane dan Graumann,
proses ini masih belum jelas. 2005; Seitz dan Blokesch, 2014), sehingga menyulitkan untuk
membedakan antara penyerapan ssDNA ke dalam sitoplasma dan
Selama NT, sel umumnya berinteraksi dengan DNA beruntai ganda (dsDNA) di lingkungan, integrasi aktif ke dalam kromosom. Selain itu, penelitian terbaru
tetapi hanya satu untai saja yang berinteraksi dengan DNA beruntai ganda (dsDNA) di lingkungan. menyoroti penggunaan DNA berlabel fluoresensi untuk melacak
DNA ditranslokasi ke sitoplasma (Gabor dan Hotchkiss, kemajuan penyerapan dan integrasi DNA selama NT (Boonstra et al., 2018;

Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019 ª 2019 Elsevier Inc.1499

Machine Translated by Google
A Gambar 1. Penyajian Fusi Fluoresen ComM
SM D DAN
proksimal ke titik asal dan situs parS1 di proksimal ke terminal, dan dinyatakan mCherry-ComM. Sel diinkubasi dengan tDNA yang harus berintegrasi proksimal
situs parS2 .
(E) Gambar statis sel predivisional yang menunjukkan bahwa fokus mCherry-ComM berkolokasi dengan situs parS2 yang terletak di proksimal . Bilah skala, 2 mm.
(F) Mengukur kolokalisasi fokus mCherry-ComM dengan situs parS yang ditunjukkan (yaitu, fokus ParB) ketika diinkubasi dengan tDNA yang mengintegrasikan proksimal ke parS2
lokasi. Data berasal dari dua percobaan independen; n = 217 fokus ComM dianalisis.
Lihat juga Gambar S1 dan Tabel S1 dan S2.
Corbinais dkk., 2016); Namun, pendekatan ini memiliki kelemahan
kekurangan yang sama. Pekerjaan terbaru dari kelompok kami telah menunjukkan hal ini
bahwa ComM adalah helicase heksamerik yang mendorong migrasi cabang
selama NT di Vibrio cholerae (Nero et al., 2018). Kami menemukan itu
ComM yang dimurnikan hanya membentuk heksamer in vitro dengan adanya
ATP dan ssDNA (Nero et al., 2018). Jadi, kami berhipotesis demikian
ComM dapat membentuk kompleks multimerik aktif khususnya di
situs integrasi tDNA in vivo. Untuk mengujinya, kami menilai
lokalisasi fusi fluoresen fungsional ComM
(Nero et al., 2018) pada strain yang kompeten secara konstitutif
V. cholerae yang menunjukkan tingkat NT yang tinggi (frekuensi transformasi
hingga 50%) (Ellison et al., 2018), yang diperlukan
untuk jenis analisis biologis sel ini. Jika tidak ada
tDNA, GFP-ComM tetap terlokalisasi secara difus di sitoplasma.
Namun, dengan adanya tDNA, GFP-ComM terbentuk sementara
fokus (Gambar 1A – 1C). Kami berhipotesis bahwa fokus ini mewakili lokasi
rekombinasi homolog—khususnya, lokasi
migrasi cabang ke hilir invasi untai yang dimediasi RecA. Sejalan dengan ini,
kami tidak mengamati adanya GFP-ComM
fokus pada latar belakang mutan DrecA atau DdprA ketika sel berada
diinkubasi dengan tDNA.
Selanjutnya, kami ingin menguji lebih lanjut apakah fokus ComM mewakili
situs rekombinasi homolog selama NT. Ke
untuk itu, kami menggunakan dua sistem ParB/parS ortologis (Nielsen
et al., 2006) untuk menandai lokasi V. cholerae yang berbeda
genom. Sel dalam pengujian ini secara konstitutif menyatakan dua
protein fusi ParB fluoresen yang berbeda (yGFP-ParB1 dan
CFP-ParB2), yang secara spesifik dapat berikatan dengan pasangannya
situs parS (masing-masing parS1 dan parS2 ). Mengikat ParB ke
parS membentuk fokus fluoresen yang membatasi lokasi
1500 Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019
sebagai Penanda Rekombinasi Homolog
selama PB
(A) Montase pencitraan time-lapse dari strain kompeten
konstitutif yang mengekspresikan GFP-ComM
diinkubasi dengan tDNA. Semua tDNA digunakan dalam penelitian ini
adalah produk yang diamplifikasi PCR yang mengandung 3
kb sisi homolog; untuk detailnya lihat Tabel S1.
Panah putih menunjukkan munculnya fokus GFP-ComM,
sedangkan panah abu-abu menunjukkan fokusnya
hilangnya. Bilah skala, 2 mm.
F (B) Persentase sel yang membentuk ComM
fokus ketika sel dicitrakan di hadapan
atau tidak adanya tDNA. Eksperimen dicitrakan
setiap 1 menit selama 45 menit. Data berasal dari tiga
percobaan independen, dan rata-ratanya dilaporkan;
n = 1.315 sel untuk +tDNA dan n = 1.143 untuk tDNA
sampel.
(C) Durasi fokus GFP-ComM dari sel
diinkubasi dengan tDNA. n = 110 fokus dianalisis.
(D) Skema pengaturan eksperimental yang akan diuji
apakah fokus ComM menandai situs homolog
rekombinasi. Sel diekspresikan secara konstitutif
yGFP-ParB1/CFP-ParB2, berisi situs parS2
lokus parS kromosom di dalam sel. Situs parS1 _
terintegrasi proksimal ke terminal, sementara situs parS2
terintegrasi secara proksimal ke titik asal. V. cholerae mengadopsi konfigurasi
ori-ter lon-gitudinal selama pembelahan sel (David et al.,
2014; Fogel dan Waldor, 2006); dengan demikian, skema pelabelan ini
memberikan pemisahan spasial maksimal antara dua fokus parS .
Selanjutnya, kami menginkubasi sel dengan tDNA yang akan berintegrasi
dekat dengan (10 kb dari) situs parS2 (Gambar 1D). Jika fokus ComM terbentuk
di lokasi rekombinasi homolog, kita berharap fokus ComM yang berpendar akan
berkolokasi
dengan fokus parS2 . Memang benar, 91% dari keseluruhan kasus, fokus ComM
dilokalisasikan dengan situs parS2 (Gambar 1E dan 1F). Beberapa
peristiwa di mana fokus ComM terbentuk distal ke situs parS2 (Gambar S1A)
mungkin mewakili upaya rekombinasi yang tidak sah,
pembentukan fokus ComM pada tDNA yang tidak bergantung pada rekombinasi,
dan/atau hilangnya pemadatan DNA lokal yang mengakibatkan
pemisahan spasial fokus ComM dan parS2 . Dalam beberapa kasus, fokus
ComM memperlihatkan gerakan kolokalisasi dengan
situs parS2 (Gambar S1B), yang selanjutnya mendukung hipotesis
bahwa fokus ComM terbentuk di tempat integrasi DNA. Juga, kami
melakukan percobaan timbal balik dengan menginkubasi sel dengan
tDNA yang akan berintegrasi dalam jarak dekat (10 kb jauhnya
dari) ke situs parS1 . Seperti yang diharapkan, fokus ComM berkolokasi
dengan situs parS1 90% dari waktu (Gambar S1C – S1E).
Secara kumulatif, hasil ini menunjukkan bahwa ComM fluoresen
fokus membatasi situs rekombinasi homolog selama
tidak. Lebih lanjut, data ini menetapkan bahwa sel itu biologis
pelacakan sistem ComM dan ParB/parS ortologis memberikan pembacaan
spatiotemporal yang kuat untuk rekombinasi homolog dalam sel tunggal.
Machine Translated by Google
Pelacakan ComM Memungkinkan Kuantifikasi Tingkat Keberhasilan
Rekombinasi Homolog selama NT Saat ini tidak jelas seberapa
efektif proses rekombinasi homolog selama NT (yaitu, seberapa sering
rekombinasi homolog berhasil setelah proses dimulai?). Faktanya, hal ini
relatif kurang dipahami di sebagian besar model rekombinasi. Di atas,
kami menunjukkan bahwa pembentukan setiap fokus ComM kemungkinan
besar merupakan hasil dari upaya independen dalam migrasi cabang
setelah invasi untai yang dimediasi RecA. Namun, fokus ComM ini tidak
menunjukkan apakah upaya ini pada akhirnya berhasil dalam
mengintegrasikan DNA atau tidak. Kami berhipotesis bahwa jika kami
dapat mengukur sel-sel di mana integrasi berhasil, kami akan memiliki
metrik yang kuat untuk menilai kemanjuran integrasi selama NT. Untuk
menilai keberhasilan integrasi tDNA, kami menggunakan strain yang
secara konstitutif menyatakan CyPET-ParB1 dan pada awalnya tidak
memiliki situs parS1 serumpun , yang menghasilkan lokalisasi CyPET-
ParB1 yang tersebar. Kami kemudian mengubah sel-sel ini dengan tDNA
yang akan mengintegrasikan situs parS1 ke dalam genom.
Setelah rekombinasi homolog tDNA dengan genom dan pembentukan
situs parS1 beruntai ganda (Pillet et al., 2011), fokus CyPET-ParB1 dapat
terbentuk untuk membatasi keberhasilan integrasi tDNA. Sel-sel ini juga
mengekspresikan fusi GFP-ComM.
Dengan demikian, dalam percobaan ini, kita dapat menilai upaya integrasi
tDNA dengan melacak pembentukan fokus GFP-ComM dan mengidentifikasi mencakup ComM- migrasi cabang dependen.
sel-sel di mana integrasi tDNA berhasil dengan melacak pembentukan
fokus CyPET-ParB1.
Pertama, kami menginkubasi sel dengan tDNA yang akan memasukkan
situs parS1 148 bp ke dalam genom (yaitu, D0kb::parS1). Kami menemukan
bahwa 80% sel menghasilkan setidaknya satu fokus ComM selama
durasi percobaan (Gambar 2A-2C); namun, hanya sebagian dari sel-sel
ini yang menghasilkan fokus ParB1 (Gambar 2A), yang menunjukkan
bahwa banyak upaya (seperti yang dinilai oleh fokus ComM) pada akhirnya
gagal untuk berhasil mengintegrasikan tDNA. Berdasarkan hal ini, kita
dapat menghitung tingkat keberhasilan integrasi tDNA. Tingkat
keberhasilan per sel, didefinisikan sebagai persentase sel yang berusaha
mengintegrasikan tDNA (yaitu, membentuk setidaknya satu fokus ComM)
dan pada akhirnya berhasil (yaitu, membentuk fokus ParB1), adalah 45%
( Gambar -ure 2D). Namun, banyak sel menghasilkan lebih dari satu fokus
ComM sepanjang durasi percobaan (Gambar 2A-2C). Jika kita berasumsi
bahwa hanya satu fokus ComM yang diperlukan untuk keberhasilan
integrasi tDNA, kita juga dapat menghitung tingkat keberhasilan
berdasarkan per upaya (yaitu, per fokus). Ini didefinisikan sebagai
persentase sel yang membentuk fokus ParB1 relatif terhadap jumlah total
fokus ComM yang diamati. Tingkat keberhasilan per upaya yang diamati
adalah 25% (Gambar 2D). Menariknya, tidak ada perbedaan dalam durasi
fokus GFP-ComM ketika kami membandingkan sel yang pada akhirnya
berhasil versus gagal mengintegrasikan tDNA (Gambar 2E). Hal ini
menunjukkan bahwa durasi kompleks migrasi cabang yang bergantung
pada ComM tidak memprediksi keberhasilan integrasi. Namun kami
mengamati sedikit peningkatan jumlah fokus ComM yang diproduksi
dalam sel yang pada akhirnya berhasil mengintegrasikan tDNA (Gambar
2F).
Frekuensi transformasi untuk memperkenalkan penyisipan dan
penghapusan besar oleh NT lebih rendah dibandingkan ketika
mengintegrasikan muatan mutasi yang lebih kecil (Dalia et al., 2014). Jika
fokus ComM benar-benar mewakili upaya integrasi DNA, kami berhipotesis
bahwa, ketika menggunakan tDNA yang akan menyebabkan penghapusan
besar, jumlah fokus ComM yang terbentuk (yaitu, jumlah upaya) akan tetap tidak berubah.
diubah sementara tingkat keberhasilan akan berkurang. Untuk mengujinya,
kami melakukan pengujian menggunakan sel di mana situs integrasi yang
ditargetkan sudah berisi kaset resistensi kloramfenikol (CmR) 1,5 kb.
Dengan demikian, integrasi situs parS1 akan memerlukan sel untuk
menghapus kaset CmR 1,5 kb dan menggantinya dengan situs parS1
(yaitu, D1.5kb::parS1), sedangkan sel yang digunakan dalam percobaan
sebelumnya harus memasukkan parS1 situs ke dalam genom tanpa
penghapusan yang sesuai (yaitu, D0kb::parS1). Untuk D1.5kb::parS1,
kami menemukan bahwa sel menghasilkan fokus ComM yang sama
banyaknya dengan D0kb::parS1, yang menunjukkan bahwa sel berusaha
mengintegrasikan tDNA pada kecepatan yang sama (Gambar 2B–2D).
Yang penting, kelompok homologi pada tDNA identik pada kedua
percobaan. Dengan demikian, hasil ini konsisten dengan invasi untai yang dimediasi RecA
satu kelompok homologi terjadi pada efisiensi yang sama terlepas dari
sifat mutasi yang diperkenalkan. Durasi fokus ComM dan jumlah fokus
yang dihasilkan per sel tidak jauh berbeda antara D1.5kb::parS1 dan
D0kb::parS1 (Gambar S2, 2E, dan 2F). Namun tingkat keberhasilannya
kira-kira setengahnya untuk D1.5kb::parS1 dibandingkan dengan
D0kb::parS1 (Gambar 2D). Dengan demikian, penghapusan 1,5 kb
menghasilkan pengurangan 2 kali lipat dalam tingkat keberhasilan
integrasi. Karena jumlah upaya integrasi DNA setara antara D1.5kb::parS1
dan D0kb::parS1, tingkat keberhasilan yang dihitung di sini menunjukkan
proses yang harus terjadi di hilir invasi untai yang dimediasi RecA, yang
Kami juga menggunakan pengaturan eksperimental ini untuk menguji
kemanjuran integrasi mutasi titik selama NT. Secara khusus, kami
menghasilkan strain yang menyimpan situs parS1 yang tidak aktif (melalui
dua mutasi titik transisi) yang tidak dapat berikatan dengan ParB (yaitu,
parS1*). Kami kemudian menginkubasi sel-sel ini dengan tDNA yang akan
memperbaiki dua mutasi titik ini untuk memulihkan situs parS1 . Kami
menemukan bahwa, meskipun sel-sel ini menunjukkan jumlah fokus ComM
yang serupa dibandingkan dengan D0kb::parS1 dan D1.5kb::parS1
(Gambar 2B, 2C, 2G, dan 2H), tingkat keberhasilan integrasi tDNA sangat
berkurang untuk parS1. * (Gambar 2D). Kami berhipotesis bahwa
penurunan tingkat keberhasilan ini mungkin disebabkan oleh sistem
perbaikan ketidaksesuaian seperti yang terjadi pada spesies lain yang
dapat bertransformasi secara alami (Lorenz dan Wackernagel, 1994).
Untuk mengujinya, kami menilai tingkat keberhasilan perbaikan mutasi titik
pada latar belakang mutan perbaikan ketidakcocokan DmutS (yaitu, parS1*
DmutS). Jumlah fokus ComM untuk parS1* DmutS serupa dengan parS1*,
sedangkan tingkat keberhasilan jauh lebih tinggi untuk parS1* DmutS
(Gambar 2B–2E dan S2). Hasil ini konsisten dengan perbaikan
ketidakcocokan yang membatasi integrasi mutasi titik ke dalam genom selama NT.
Hilangnya perbaikan ketidakcocokan tidak mempengaruhi integrasi situs
de novo parS1 ke dalam genom (yaitu, bandingkan D0kb::parS1 DmutS
dengan D0kb::parS1) (Gambar 2B–2E dan S2), yang konsisten dengan
penyisipan dan penghapusan yang besar. kurang dikenali oleh sistem
perbaikan ketidakcocokan (Modrich, 1991).
Dalam percobaan yang dijelaskan di atas, pembentukan fokus ParB1
(yaitu, indikator keberhasilan integrasi tDNA) untuk sementara tertunda
dari pembentukan fokus ComM. Integrasi ssDNA, seperti yang
dihipotesiskan untuk NT, mungkin menyebabkan penundaan ini karena
situs parS beruntai tunggal tidak cukup untuk berikatan dengan parB (Pillet
et al., 2011). Dengan demikian, kita berharap bahwa fokus ParB1 hanya
akan terbentuk setelah situs parS1 diubah menjadi dsDNA (misalnya,
melalui replikasi kromosom). Konsisten dengan ini
Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019 1501
Machine Translated by Google

DAN
F

BCD

G
H

Gambar 2. Mengukur Kemanjuran Rekombinasi Homolog selama NT Tingkat keberhasilan

rekombinasi homolog ditentukan dengan menggunakan pendekatan biologis sel di mana sel mengekspresikan GFP-ComM dan CyPet-ParB1 tetapi pada awalnya tidak memiliki
situs parS1 yang fungsional . Sel kemudian diinkubasi dengan tDNA yang akan mengintegrasikan situs parS1 de novo 148 bp atau memulihkan situs parS1 yang tidak aktif dengan
ada atau tidak adanya perbaikan ketidakcocokan (DmutS): D0kb::parS1, D0kb::parS1 DmutS, D1.5kb: :parS1, parS1*, atau parS1* DmutS. Batang skala, 2 mm.
(A) Montase pencitraan selang waktu dari salah satu contoh representatif integrasi tDNA yang berhasil untuk D0kb::parS1. Panah putih menunjukkan saat sel membentuk fokus
ComM, yang menunjukkan upaya integrasi tDNA, sedangkan panah merah menunjukkan saat sel membentuk fokus CyPet-ParB1, yang menunjukkan keberhasilan integrasi tDNA
ke dalam genom. Eksperimen dicitrakan setiap 3 menit selama 5 jam.
(B dan C) Persentase sel (B) yang membentuk setidaknya satu fokus ComM dan jumlah fokus ComM per sel (C). n = 320 untuk D0kb::parS1; n = 295 untuk D0kb::parS1 DmutS;
n = 296 untuk D1.5kb::parS1; n = 293 untuk parS1*; n = 289 untuk parS1* DmutS.
(D) Tingkat keberhasilan integrasi tDNA dihitung berdasarkan per sel (yaitu, persentase sel yang membentuk fokus ComM, yang pada akhirnya berhasil mengintegrasikan tDNA)
atau berdasarkan per upaya (yaitu, dengan asumsi bahwa hanya satu ComM fokus diperlukan untuk integrasi, tingkat keberhasilan per upaya adalah persentase fokus ComM
yang menghasilkan keberhasilan integrasi tDNA). n = 261 sel dengan fokus R1 ComM dianalisis untuk D0kb::parS1; n = 236 untuk D0kb::parS1 DmutS; n = 244 untuk
D1.5kb::parS1; n = 225 untuk parS1*; n = 226 untuk parS1* DmutS.
(E – H) Histogram menunjukkan durasi fokus ComM dalam sel yang pada akhirnya berhasil versus gagal mengintegrasikan tDNA untuk 0kb::parS1 (E) dan parS1* (G). Histogram
menunjukkan jumlah fokus ComM dalam sel yang berhasil versus gagal mengintegrasikan tDNA untuk 0kb::parS1 (F) dan parS1* (H).
Lihat juga Gambar S2 dan S4.

hipotesis, kami secara konsisten mengamati bahwa hanya satu dari dua sel
anak yang mewarisi fokus ParB1, dan pada putaran pembelahan berikutnya,
kedua sel anak mewarisi fokus ParB1 (Gambar 2A). Oleh karena itu kami
berhipotesis bahwa tDNA berintegrasi sebagai ssDNA dan bahwa heteroduplex
yang dihasilkan diselesaikan dengan replikasi kromosom, yang kami uji lebih
lanjut di bawah.
tDNA Terintegrasi sebagai ssDNA selama NT untuk Membentuk a
Heteroduplex yang Diselesaikan oleh Kromosom
Replikasi
Penelitian selama puluhan tahun telah memberikan bukti molekuler bahwa tDNA
kemungkinan berintegrasi ke dalam genom sebagai ssDNA selama NT (Dubnau
dan Davidoff-Abelson, 1971; Rubah dan Allen, 1964; Me´ jean dan Claverys,
1984). Untuk memberikan bukti yang lebih langsung dan kuantitatif mengenai
hal ini, kami memulai dengan sel yang secara konstitutif mengekspresikan yGFP-
ParB1/CFP-ParB2 dan berisi satu situs parS2 . Kami kemudian mengubah sel-
sel ini dengan tDNA yang akan menggantikan situs parS2 dengan situs parS1 .
Jika ssDNA berintegrasi selama NT, maka jika tidak ada perbaikan (yang
umumnya tidak dapat bekerja pada jenis penyisipan dan/atau penghapusan ini),
kita mengharapkan replikasi kromosom menghasilkan dua genom, yang satu
memiliki situs parS1 dan yang lainnya memiliki situs parS2 . lokasi. Ini akan
diamati secara eksperimental sebagai sel predivisional yang mengandung fokus
ParB1 hijau dan cyan ParB2 (Gambar 3A). Kalau tidak,

1502 Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019

Machine Translated by Google

A C

Gambar 3. Integrasi tDNA Untai Tunggal selama NT Membentuk Heterodupleks yang Diselesaikan dengan Replikasi dan Segregasi Kromosom (A) Skema pengaturan eksperimen
dan hasil yang
diharapkan jika tDNA diintegrasikan sebagai ssDNA selama NT. Sel secara konstitutif mengekspresikan yGFP-ParB1/CFP-ParB2 dan berisi situs parS2 (cyan ParB2) dalam genom.
Sel kemudian ditransformasikan dengan tDNA yang akan menggantikan situs parS2 83 bp dengan situs parS1 148 bp (ParB1 hijau). Eksperimen dicitrakan setiap 3 menit selama 5
jam.
(B) Montase pencitraan time-lapse untuk satu contoh representatif integrasi ssDNA. Panah menunjukkan sel predivisional dengan fokus yGFP-ParB1 dan CFP-ParB2, yang
menunjukkan bahwa DNA yang diintegrasikan selama NT adalah untai tunggal dan heterodupleks yang dihasilkan diselesaikan dengan replikasi dan segregasi kromosom. Konsisten
dengan fokus baru yang mewakili heteroduplex yang terselesaikan, setiap situs parS direplikasi dengan setia pada putaran replikasi kromosom berikutnya (panah pada 180 menit).
Batang skala, 2 mm.
(C) Kuantifikasi jumlah sel yang menunjukkan integrasi ssDNA (seperti yang ditunjukkan dalam B) versus integrasi dsDNA (seperti yang ditunjukkan pada Gambar S3). Data berasal
dari tiga percobaan independen; n = 155 sel dengan tDNA terintegrasi dianalisis.
Lihat juga Gambar S3.

jika tDNA diintegrasikan sebagai dsDNA ke dalam genom, kita hanya
boleh mengamati sel yang secara eksklusif memiliki fokus ParB1 atau
ParB2 (Gambar S3A). Ketika kami melakukan percobaan ini, kami
menemukan bahwa 93% sel menunjukkan fenotip yang konsisten
dengan integrasi ssDNA (Gambar 3B, 3C, dan S3B; Video S1). Untuk
sel yang menunjukkan integrasi ssDNA, kami menemukan bahwa sel
dengan setia mereplikasi kromosomnya pada putaran pembelahan
berikutnya (yaitu, sel anak yang mewarisi situs parS1 pada putaran
pertama pembelahan kemudian direplikasi untuk membentuk dua
fokus parS1 di putaran replikasi kromosom berikutnya) (Gambar 3B).
Pengamatan integrasi dsDNA pada 7% sel mungkin merupakan hasil
penyerapan dan integrasi beberapa molekul tDNA yang menggantikan
untaian genom endogen yang terdepan dan tertinggal. Hal ini belum
pernah terjadi sebelumnya karena telah diketahui bahwa spesies yang
dapat bertransformasi secara alami dapat mengambil dan
mengintegrasikan beberapa molekul tDNA independen dalam proses
yang disebut kongres atau ko-transformasi (Dalia et al., 2014; Nester
et al., 1963). Data ini menunjukkan bahwa selama NT, sel-sel secara
dominan mengintegrasikan ssDNA ke dalam genom dan bahwa
heteroduplex yang dihasilkan diselesaikan dengan replikasi dan segregasi ParB1
Migrasi Cabang ComM-Dependent Segera Mendahului
Integrasi DNA selama NT Sebelumnya, kami
menggunakan penyisipan situs parS1 untuk mengidentifikasi sel-sel
yang berhasil mengintegrasikan DNA (Gambar 2A). Namun, karena
sel mengintegrasikan ssDNA, mereka hanya menghasilkan fokus
ParB1 setelah replikasi kromosom, yang menunda pembacaan
keberhasilan integrasi sejak integrasi benar-benar terjadi. Untuk
menguji apakah kami dapat menghasilkan indikator temporal integrasi
tDNA yang lebih sensitif, kami menggunakan a
pendekatan eksperimental yang dimodifikasi dengan menilai gangguan
pada situs parS yang sudah ada (Gambar S4A). Kami mulai dengan
sel-sel yang secara konstitutif mengekspresikan yGFP-ParB1/CFP-
ParB2 dan menyimpan situs parS1 dan parS2 dalam jarak dekat
(terpisah 10 kb) pada kromosom, dengan situs parS1 mengganggu
gen gfp . Strain ini juga mengandung fusi mCherry-ComM yang
diekspresikan pada lokus aslinya. Kami kemudian mengubah sel-sel
ini dengan tDNA yang akan menghapus situs parS1 dan memulihkan
gen gfp . Dengan demikian, kita dapat menilai hubungan spatiotemporal
antara aktivitas ComM (yaitu fokus mCherry-ComM) dan integrasi
tDNA (yaitu hilangnya fokus ParB1). Kehadiran fokus ParB2 yang
konstan berfungsi sebagai kontrol untuk penataan ulang genom
secara lokal (yang seharusnya mengganggu fokus ParB1 dan ParB2),
sedangkan integrasi tDNA spesifik hanya akan mengakibatkan
hilangnya fokus ParB1. Sebagai indikator sekunder keberhasilan
integrasi tDNA (selain hilangnya fokus ParB1), sel yang ditransformasi
harus mengekspresikan GFP tingkat tinggi di atas fluoresensi dasar
konstruksi yGFP-ParB1 setelah gen gfp dipulihkan . Ketika kami
melakukan percobaan ini, kami menemukan bahwa hilangnya fokus
segera didahului oleh pembentukan fokus ComM yang
kromosom.
terkolokalisasi (Gambar S4B). ParB1 kemudian tetap terlokalisasi
secara difus sampai replikasi kromosom, sebagaimana dibuktikan
dengan pemisahan fokus ParB2, dimana kami melihat kemunculan
kembali satu fokus ParB1 (Gambar S4B). Hal ini konsisten dengan
integrasi ssDNA dari tDNA ke dalam genom karena replikasi kromosom
diharapkan dapat memulihkan situs parS1 dari untai DNA yang tidak
diganti (Gambar S4A). Setelah replikasi kromosom, ekspresi GFP
meningkat, yang selanjutnya menegaskan bahwa sel-sel
ditransformasikan (Gambar S4B). Hasil ini menunjukkan

Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019 1503

Machine Translated by Google
bahwa integrasi DNA terjadi dengan cepat setelah pembentukan
Fokus ComM dan pemantauan kerugian yang sudah mapan
situs parS (yaitu, fokus ParB) menyediakan layanan yang paling cepat
pembacaan untuk pembentukan heteroduplex selama NT.
Ekspresi tDNA Terintegrasi Terjadi dengan Cepat setelahnya
Replikasi Kromosom dan sebelum Pembelahan Sel
Eksperimen yang dijelaskan di atas menetapkan hubungan spatiotemporal
antara migrasi cabang yang bergantung pada ComM dan
integrasi tDNA. Menilai waktu yang tepat untuk terintegrasi
Namun, tDNA dalam percobaan ini diperumit oleh
fakta bahwa sel sudah menyatakan jumlah dasar yGFP-ParB1 (Gambar
S4B). Hal ini membuat sulit untuk menentukan secara pasti
waktu ekspresi untuk gen gfp yang diperbaiki setelah DNA
integrasi karena dinilai dalam neon yang sama
saluran sebagai yGFP-ParB1.
Untuk lebih menentukan kapan tDNA terintegrasi diekspresikan, kami
mengubah pengaturan eksperimental sehingga ekspresi tDNA terintegrasi
dinilai dalam saluran fluoresen yang berbeda
(Gambar 4A). Kami menghasilkan strain yang mengekspresikan mCherry-
ParB1/CFP-ParB2 dan menampung situs parS1 dan parS2 di dekatnya.
kedekatan pada genom tempat situs parS1 menggantikan
promotor dan ujung 50 gen gfp . Sel kemudian diubah
dengan tDNA untuk menghapus situs parS1 dan memulihkan gen gfp dan
promotor (Gambar 4A). Karena kurangnya ketersediaan lampu neon
saluran, ComM tidak dilacak dalam percobaan ini; namun, pelacakan aktivitas
ComM tidak penting untuk menilai
waktu ekspresi tDNA. Ketika kami melakukan percobaan ini, kami mendeteksi
integrasi tDNA dengan hilangnya ParB1
fokus dan pemulihan selanjutnya dari fokus ini pada konversi situs parS1
menjadi DNA beruntai ganda melalui replikasi kromosom (Gambar 4B; Video
S2), yang konsisten dengan
integrasi ssDNA seperti yang diamati sebelumnya (Gambar 3B). Ini
analisis juga mengungkapkan bahwa tDNA terintegrasi dengan cepat
diekspresikan setelah replikasi kromosom (Gambar 4B; Video
S2). Penundaan ekspresi gfp setelah replikasi kromosom adalah 15 menit
(Gambar 4C), sedangkan waktu penggandaan pada
pengujian ini adalah 3 jam. Waktu pematangan alel gfp
yang digunakan adalah 6,5 menit (Megerle et al., 2008). Dengan demikian,
hasil ini menunjukkan bahwa tDNA terintegrasi diekspresikan dengan segera
mengikuti replikasi kromosom, yang menyelesaikan heteroduplex terintegrasi.
Jika sel menggabungkan kembali tDNA untuk menggantikan untai pengkode di
genom, ini memungkinkan ekspresi tDNA sebelum replikasi kromosom.
Namun, dalam percobaan yang dijelaskan di atas,
Ekspresi tDNA mungkin memerlukan replikasi kromosom
karena promotor beruntai ganda mungkin diperlukan untuk transkripsi gen
gfp yang diperbaiki . Untuk menentukan apakah tDNA
dapat diekspresikan sebelum replikasi kromosom, kami mengubahnya
pengaturan eksperimental sehingga gen gfp yang tidak aktif (melalui
penghapusan 87 bp atau mutasi dua titik) memiliki promotor di
genom (Gambar S5A). Meskipun ada perubahan ini, dalam percobaan ini,
Ekspresi GFP sebagian besar masih terjadi setelah replikasi kromosom
(Gambar S5B dan S5C). Hal ini mungkin menunjukkan bahwa heteroduplex
resolusi melalui replikasi kromosom masih merupakan prasyarat
ekspresi tDNA bahkan untuk mutasi kecil ini atau yang ada
bias terhadap penggantian untai pengkodean dengan tDNA
selama Perjanjian Baru.
1504 Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019
NT Mempromosikan Warisan Nongenetik dari Antibiotik
Perlawanan selama NT
Karena tDNA terintegrasi dengan ssDNA, sel pra-transformasi memiliki dua
genom dengan genotipe berbeda berikut ini:
replikasi kromosom: dimana gen gfp masih bermutasi
(Gambar 4B, genom diwakili oleh ParB1/
fokus ParB2) dan satu tempat gen gfp diperbaiki (yaitu, Gambar 4B, genom
diwakili oleh parB2 independen
fokus). Ekspresi tDNA terintegrasi (dari yang dipulihkan
gen gfp ) pada sel predivisional ini terjadi sebelum pembelahan sel.
Oleh karena itu, meskipun salah satu sel anak secara genotipe merupakan
mutan gfp , sel tersebut masih mewarisi sejumlah besar sel anak secara non-genetik.
jumlah produk gen GFP yang berasal dari tDNA yang diintegrasikan ke dalam
genom saudara kandungnya.
Meskipun pewarisan GFP nongenetik mungkin tidak penting,
mungkin ada konteks penting di mana pewarisan nongenetik dari produk
turunan tDNA dapat memberikan manfaat. Satu
Contohnya bisa dalam konteks resistensi antibiotik dimana
pewarisan nongenetik dari produk gen yang resistan terhadap antibiotik
dapat melindungi saudara kandung dari sel yang ditransformasi untuk sementara. Kami mengatur
melakukan pendekatan eksperimental untuk menguji hipotesis ini secara
langsung (Gambar S6A dan S6B). Kami mulai dengan sel yang memiliki penanda CmR
diintegrasikan ke dalam genom mereka. Kami kemudian mengubah sel-sel ini
dengan tDNA yang akan menggantikan penanda CmR dengan kanamisin
penanda resistensi (KanR). Jadi, genotipe sel dalam percobaan ini secara
teoritis seharusnya hanya CmR atau KanR (Gambar S6A). Setelah integrasi
tDNA dan kromosom berikutnya
replikasi, kita berharap sel predivisional memiliki dua
genom yang berbeda: satu adalah CmR dan satu lagi adalah KanR (Gambar
S6A). Karena tDNA terintegrasi diekspresikan dengan cepat
setelah replikasi kromosom dan sebelum pembelahan sel, kita
berharap bahwa produk gen KanR harus diwarisi oleh keduanya
sel anak KanR dan sel anak CmR . Jadi, itu
saudara kandung CmR secara genetik dari sel yang ditransformasi mungkin
resisten secara fenotipik terhadap kanamisin (Gambar S6A). Untuk menilai hal ini, kami
menantang reaksi transformasi ini dengan dosis mematikan
kanamisin untuk membunuh sel yang rentan (Gambar S6B). Sel-sel itu
kemudian dicuci untuk menghilangkan kanamisin dan disepuh untuk kultur
kuantitatif pada pelat selektif untuk menentukan jumlah sel KanR dan CmR
secara genetik yang bertahan dari pengobatan kanamisin
(Gambar S6B). Kami juga menilai jumlah rekombinan yang tidak sah (yaitu,
transforman di mana penanda KanR diintegrasikan pada lokus selain lokasi
yang dimaksudkan), yaitu
secara genetik KanR+CmR.
Seperti yang diharapkan, ketika sel tidak diinkubasi dengan tDNA apa pun,
sangat sedikit (103 ) sel CmR atau KanR secara genetis yang selamat dari
pengobatan kana-misin (Gambar 5A–5C, batang putih 0 menit). Ketika sel
diinkubasi dengan tDNA KanR, ada 107 secara genetik
Sel KanR yang selamat dari pengobatan kanamisin (Gambar 5B
dan 0 menit bilah hitam), yang mewakili jumlah genetik
transforman yang dihasilkan (yaitu, jumlah sel yang sebenarnya
mengintegrasikan tDNA KanR ke dalam genomnya). Kami juga mengamati
bahwa jumlah sel CmR genetik yang sama selamat dari pengobatan kana-
mycin (Gambar 5A dan 0 menit batang hitam), dan yang penting, ini adalah 4
log lebih besar dari jumlah rekombinan tidak sah yang diamati (Gambar 5C
dan 0 menit hitam bar). Itu
secara genetik sel CmR yang selamat dari pengobatan kanamisin
mewakili sel-sel yang secara fenotip sementara KanR, kemungkinan besar
Machine Translated by Google

A C

Gambar 4. NT Mempromosikan Warisan Nongenetik Produk Gen Turunan tDNA (A) Skema pengaturan
eksperimental. Sel mengandung situs parS1 (ParB1 merah) dan parS2 (cyan ParB2) yang berdekatan dengan kromosom. Situs parS1 menginterupsi gen gfp yang terintegrasi secara
kromosom . Sel kemudian ditransformasikan dengan tDNA untuk menghapus situs parS1 dan mengembalikan gen gfp (ini menggantikan situs parS1 148 bp dengan 240 bp gen gfp
dan promotor). Eksperimen dicitrakan setiap 3 menit selama 5 jam.
(B) Montase pencitraan time-lapse dari satu sel representatif yang berhasil mengintegrasikan tDNA. Sel pertama-tama mengintegrasikan DNA (seperti yang ditunjukkan dengan
hilangnya fokus ParB1 pada 3 menit), kemudian terjadi replikasi dan segregasi kromosom untuk menyelesaikan heteroduplex (seperti yang ditunjukkan dengan pemisahan fokus ParB2
dan kemunculan kembali fokus ParB1 dalam satu genom pada 72 menit) , dan terakhir, GFP dengan cepat diekspresikan setelah replikasi kromosom (titik waktu 84 menit) dan diwarisi
oleh kedua sel anak, termasuk sel yang secara genotip masih merupakan mutan GFP (yaitu, sel yang mengandung fokus ParB1). Bilah skala, 2 mm.
(C) Histogram waktu tunda ekspresi GFP turunan tDNA setelah replikasi kromosom. Data berasal dari tiga percobaan independen, dan n = 97 sel positif GFP dianalisis.

Lihat juga Gambar S5 dan Video S2.

melalui pewarisan nongenetik produk gen KanR dari saudara
kandungnya yang telah berubah. Menariknya, dari semua sel yang
selamat dari pengobatan kanamisin, 25% adalah CmR (Gambar 5D
dan 0 menit). Maksimum teoritis jika setiap sel yang ditransformasi
melindungi saudaranya adalah 50%. Dengan demikian, hasil ini
menunjukkan bahwa 1 dari setiap 2 transforman menyampaikan
resistensi kana-mycin nongenetik terhadap saudaranya yang tidak ditransformasi.
Seperti disebutkan di atas, resistensi fenotipik kanamisin yang
diamati pada sel CmR secara genetis kemungkinan besar merupakan
hasil pewarisan nongenetik dari produk gen KanR. Karena sel-sel ini
tidak memiliki kapasitas untuk terus memproduksi produk gen KanR,
kita berharap bahwa produk gen dan resistensi fenotipik kanamisin
yang dihasilkan akan terdilusi dalam sel-sel ini melalui pertumbuhan.
Selanjutnya, kami ingin menentukan berapa banyak
resistensi fenotipik kanamisin dari generasi ke generasi dipertahankan
dalam sel CmR secara genetik. Untuk mengujinya, kami melakukan
percobaan yang sama seperti yang dijelaskan di atas; namun, kami
mengatasi reaksi dalam medium kaya selama 60, 120, 180, dan 240
menit sebelum memberikannya pada pengobatan kanamisin (Gambar
S6B). Yang mengejutkan, kami menemukan bahwa resistensi fenotipik
kanamisin dipertahankan di beberapa bagian sel CmR bahkan hingga
240 menit pertumbuhan, yang mewakili 11 generasi pertumbuhan
(Gambar 5A dan 5E). Namun, kami melihat bahwa persentase sel
CmR setelah pengobatan kanamisin berkurang secara nyata setelah
pertumbuhan selama 180 menit (Gambar 5D dan 5E). Namun rasio ini
dipertahankan secara konsisten selama 120 menit pertumbuhan, yang
mewakili pertumbuhan 5–6 generasi (Gambar 5D dan 5E). Jadi, data
ini menunjukkan bahwa pewarisan nongenetik

Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019 1505

Machine Translated by Google

A SM D DAN

F GH I J

Gambar 5. NT Memberikan Warisan Resistensi Antibiotik Nongenetik pada V. cholerae dan S. pneumoniae (A–J) Warisan resistensi
antibiotik nongenetik dinilai sesuai skema pada Gambar 6A dan S6B pada V. cholerae (A–E) dan S. pneumoniae (F–J). Dalam kedua kasus tersebut, sel ditransformasikan dengan
tDNA KanR dan kemudian tumbuh terlalu besar selama waktu yang ditentukan sebelum pengobatan singkat dengan kanamisin dosis tinggi untuk membunuh sel yang rentan. Setelah
pengobatan kanamisin, sel dicuci dan disepuh untuk kultur kuantitatif pada media yang diindikasikan untuk mengukur jumlah non-transforman (A dan F), transforman (B dan G), dan
rekombinan tidak sah (C dan H) yang bertahan dari kanamisin. perlakuan. LOD, batas deteksi.
(D dan I) Dari sel-sel yang selamat dari pengobatan kanamisin, persentase sel-sel yang non-transforman dihitung dari (A) dan (B) dan (F) dan (G) dan diplot. Garis putus-putus pada
50% mewakili nilai maksimum teoritis jika setiap transforman memberikan resistensi fenotipik kanamisin kepada saudaranya yang tidak bertransformasi.

(E dan J) Jumlah generasi pertumbuhan relatif terhadap 0 menit ditentukan untuk setiap titik waktu dengan melakukan reaksi pelapisan untuk kultur kuantitatif pada media nonselektif
sebelum penambahan kanamisin. Semua data ditampilkan sebagai rata-rata ± SD dan berasal dari setidaknya empat ulangan biologis independen.
Lihat juga Gambar S6.

resistensi fenotipik kanamisin dipertahankan selama beberapa generasi.
Untuk menentukan apakah integrasi tDNA diperlukan untuk
memberikan resistensi kanamisin nongenetik, kami melakukan pengujian
ini pada latar belakang mutan DrecA dan DcomM . Strain DrecA , seperti
yang diharapkan, tidak menghasilkan transforman KanR apa pun, dan
tidak ada resistensi fenotipik kanamisin yang diamati pada sel CmR
(Gambar S6C). Namun penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa
tDNA kurang stabil dalam sitoplasma mutan DrecA (Berge´ et al., 2003).
Strain DcomM di satu sisi memiliki frekuensi transformasi 100 kali lipat
lebih rendah dibandingkan dengan induknya, sementara serapan DNA
dan stabilitas tDNA dalam sitoplasma tetap tidak berubah (Nero et al.,
2018). Pada mutan DcomM , kami mengamati penurunan jumlah
transforman sebanyak 100 kali lipat
(yaitu, sel KanR) dan penurunan jumlah sel CmR yang selamat dari
pengobatan kanamisin (Gambar S6C), yang konsisten dengan integrasi
tDNA yang diperlukan untuk pewarisan nongenetik dari resistensi
kanamisin. Warisan fenotipik resistensi antibiotik yang berumur panjang
tidak hanya terjadi pada KanR karena hasil serupa diperoleh saat
menggunakan
tDNA yang mengandung kaset resistensi spektinomisin (SpecR) dan sel
yang menantang dengan spektinomisin dosis mematikan (Gambar S6D).
Kami juga menguji pewarisan resistensi antibiotik nongenetik pada
model Streptococcus pneumoniae spesies Gram-positif yang dapat
ditransformasikan secara alami. Transformasi S. pneumoniae dengan
tDNA KanR memberikan resistensi fenotipik kanamisin yang berumur
panjang terhadap sel yang tidak mengalami transformasi (Gambar 5F–
5J), yang kemungkinan terjadi melalui pewarisan nongenetik dari produk
gen KanR seperti yang diamati pada V. cholerae (Gambar 5A–5E) .
Eksperimen yang dijelaskan di atas menguji pewarisan nongenetik
selama NT dalam keadaan ideal di mana tDNA yang dimurnikan
diberikan kepada sel dan kompetensi diinduksi secara artifisial.
Untuk menentukan apakah fenomena pewarisan nongenetik terjadi
dalam konteks yang lebih alami, kami melakukan percobaan untuk
menilai NT antara dua strain V. cholerae dengan cara yang lebih alami.
pengaturan yang relevan secara fisiologis. Secara khusus, kami menilai
pertukaran genetik antara dua strain V. cholerae yang digabungkan
dengan kitin (Gambar 6A), yang menginduksi kompetensi dan
transformasi pada spesies ini (Meibom et al., 2005). Inkubasi pada kitin

1506 Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019

Machine Translated by Google
ABC Gambar 6. NT Memberikan Warisan Nongenetik dalam Resistensi Antibiotik dalam Kondisi yang Mendorong Kompetensi
Fisiologis
(C) Dari sel-sel yang selamat dari pengobatan kanamisin dalam reaksi donor +KanR, persentase sel yang non-transforman dihitung dari (B) dan
diplot. Garis putus-putus pada 50% mewakili nilai maksimum teoritis jika setiap transforman memberikan resistensi fenotipik kanamisin terhadap kanamisin yang tidak ditransformasikan.
saudara. Semua data ditampilkan sebagai rata-rata ± SD dan berasal dari empat ulangan biologis independen.
juga menginduksi sekresi V. cholerae tipe VI, yang dapat mendorong pertukaran
genetik dengan melisiskan sel-sel di sekitarnya untuk melepaskan kandungan
genetiknya (Borgeaud et al., 2015; Matthey et al., 2019).
Jadi, untuk memfasilitasi pertukaran genetik dalam pengujian ini, sel donor
menjadi rentan terhadap pembunuhan tipe VI melalui penghapusan semuanya
tiga modul toksin/antitoksin tipe VI (Unterweger
et al., 2014), sementara sel penerima mahir dalam pembunuhan tipe VI yang
diinduksi kitin. Di bawah kondisi fisiologis yang relevan untuk pertukaran genetik
oleh NT, kami juga mengamati pewarisan nongenetik, yang diwakili oleh non-
transforman.
yang secara fenotip resisten terhadap kanamisin (Gambar 6B
dan 6C).
Antibiotik lain dan/atau penentu resistensi tidak mungkin ada
diuji menggunakan pendekatan eksperimental yang dijelaskan di atas karena
persyaratan agar antibiotik menunjukkan aktivitas bakterisidal
setelah paparan dosis tinggi dan durasi pendek. Oleh karena itu, kami
berusaha untuk membuat pengujian berbasis mikroskop yang memungkinkan
kita dapat mengamati secara langsung pewarisan resistensi antibiotik nongenetik
dalam sel tunggal, yang dapat diuji dengan antibiotik non-bakterisida. Untuk itu,
kami menghasilkan strain itu
secara konstitutif menyatakan mCherry-ParB1/CFP-ParB2 dan memiliki
satu situs parS1 yang mengganggu gen gfp (yaitu, gfp::parS1). Ini
sel kemudian ditransformasikan dengan tDNA yang secara simultan akan
segera hapus situs parS1 , perbaiki gen gfp , dan integrasikan
situs parS2 yang terkait dengan penanda resistensi antibiotik (AbR) (Gambar
S7A). Jadi, setelah integrasi tDNA dan replikasi kromosom berikutnya, sel-sel
yang mengalami transformasi predivisional akan mengalami transformasi
satu genom yang mewakili genotipe induk (yaitu, saudara kandung yang belum
bertransformasi = gfp::parS1, AbS ), sedangkan genom lainnya
akan mewakili genotipe yang ditransformasikan (yaitu, genotipe yang ditransformasikan
saudara = parS2, gfp utuh, dan AbR). Berdasarkan hasil kami sebelumnya, kami
memperkirakan saudara kandung yang belum bertransformasi akan mewarisi
produk gen turunan tDNA secara nongenetik dari produk gen yang ditransformasikan. sel predivisional—memungkinkan transfer nongenetik produk gen turunan tDNA
saudara kandungnya, yang akan memungkinkannya tumbuh dengan antibiotik
(A) Skema pendekatan eksperimental.
Sel donor dan penerima dicampur dengan perbandingan
1:1. Penerima berisi penanda DlacZ::SpecR
dan penanda CmR dan memiliki tipe VI aktif
sekresi. Donor dianggap tidak bertransformasi
mampu (DdprA::TmR), sensitif terhadap pembunuhan tipe VI,
dan berisi penanda KanR yang akan menggantikannya
penanda CmR di sel penerima jika berhasil diintegrasikan
oleh NT (yaitu, donor +KanR).
Reaksi kontrol dilakukan dengan isogenik
strain donor yang tidak memiliki penanda KanR (yaitu,
donor +KanS ).
(B) Sel dikoinkubasi pada kitin selama 48 jam hingga
biarkan NT, tumbuh terlalu besar selama 60 menit, dan kemudian dirawat
dengan kanamisin dosis tinggi untuk membunuh rentan
sel. Reaksi kemudian diseleksi secara selektif
media kultur kuantitatif untuk membedakan antara non-
transforman (SpecR + CmR), trans-forman (SpecR + KanR),
dan re-kombinan tidak sah (CmR + KanR). LOD, batas
deteksi.
fakta bahwa itu tidak benar-benar mengkodekan penanda AbR. Memang,
inilah yang kami amati dengan menggunakan tDNA yang mengandung a
Penanda KanR (Gambar 7; Video S3), yang juga memvalidasi hasil yang
dijelaskan di atas (Gambar 5A–5E). Terlebih lagi, ketika kita
melakukan percobaan ini menggunakan tDNA yang memberikan resistensi
terhadap antibiotik lain (eritromisin dan kloramfenikol),
hasil serupa diperoleh (Gambar S7B dan S7C; Video S4
dan S5), menunjukkan bahwa pewarisan resistensi antibiotik nongenetik selama
NT tidak terbatas pada aminoglikosida bakterisida
seperti kanamisin dan spektinomisin.
DISKUSI
Hasil kami memberikan bukti langsung untuk memvalidasi model saat ini
integrasi tDNA selama NT. Selain itu, mereka juga telah menyediakannya
wawasan yang sangat berharga mengenai dinamika ruangwaktu selama ini
proses integrasi pada resolusi sel tunggal, yang pada akhirnya mengungkap
mekanisme pewarisan nongenetik yang tidak dihargai
selama Perjanjian Baru. Secara khusus, kami memberikan bukti langsung dan
kuantitatif bahwa tDNA berintegrasi sebagai ssDNA ke dalam genom. Hasil ini
mendukung penelitian molekuler selama beberapa dekade sebelumnya (Dubnau
dan Da-vidoff-Abelson, 1971; Fox dan Allen, 1964; Me´ jean dan Claverys,
1984). Kami menunjukkan bahwa, setelah integrasi ssDNA,
heterodupleks yang dihasilkan diselesaikan dengan replikasi kromosom
dan segregasi, yang membentuk sel predivisional yang menyimpan genom dari
dua genotipe berbeda (satu mengandung genotipe terintegrasi
DNA dan yang lainnya kekurangan itu). Kami juga menemukan bahwa itu terintegrasi
tDNA dengan cepat diekspresikan segera setelah kromosom
replikasi, yang terjadi sebelum pembelahan sel dalam kondisi yang diuji. Yang
penting, kami menunjukkan kombinasi keduanya
properti—integrasi ssDNA, resolusi heterodupleks oleh
replikasi kromosom, dan ekspresi cepat tDNA di
ke saudara kandung yang belum ditransformasikan
Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019 1507
Machine Translated by Google
sel yang ditransformasi. Di sini, kami memberikan bukti adanya pewarisan
nongenetik selama NT pada V. cholerae dan S. pneumoniae.
Dengan demikian, kemungkinan besar mekanisme pewarisan nongenetik
dijelaskan di sini berlaku secara luas untuk mode HGT ini. Untuk mendukung
hal ini, penelitian terbaru menunjukkan bahwa ekspresi DNA terintegrasi
sebelum pembelahan sel kemungkinan besar juga terjadi secara alami.
Helicobacter pylori dan Bacillus subtilis ( Boonstra
dkk., 2018; Corbinais dkk., 2016). Selain itu, pada beberapa spesies yang dapat
berubah bentuk secara alami seperti B. subtilis dan S. pneumoniae, NT menginduksi
keterlambatan pertumbuhan (Berge´ et al., 2017; Haijema et al., 2001). Ini
penundaan dapat membantu menjaga integritas genom (Berge´ et al., 2017)
dan mungkin juga mendorong pewarisan sifat nongenetik.
Hasil kami menunjukkan fusi fluoresen pada cabang
faktor migrasi ComM berfungsi sebagai penanda biologis sel untuk rekombinasi
homolog selama NT. Dengan menggunakan alat ini, kami berhasil
mampu mengukur tingkat keberhasilan integrasi DNA selama NT
in vivo sebesar 5% –50% tergantung pada sifat mutasi
sedang diperkenalkan. Konjugasi HGT oleh Hfr pada E. coli sebelumnya
diperkirakan terjadi pada efisiensi 96% (Babic et al.,
2008). Ini diukur secara mikroskopis menggunakan konjugatif
transfer antara donor Dam+ Hfr dan penerima Dam yang mengandung SeqA-
YFP, yang mengikat dan membentuk fokus fluoresen
DNA hemimetilasi yang terbentuk pada penerima. Jika SeqA-YFP
fokus bertahan selama> 4 jam, diasumsikan bahwa DNA terintegrasi secara
stabil ke dalam genom. Analisis kami mengenai tingkat keberhasilan rekombinasi
homolog selama NT memerlukan integrasi a
muatan DNA yang ditentukan ( situs parS ), sedangkan analisis sebelumnya
HGT oleh Hfr adalah urutan independen (Babic et al., 2008)
(rekombinasi wilayah mana pun dari DNA donor Hfr yang termetilasi
masih harus menghasilkan fokus SeqA-YFP pada penerima). Jadi, memang demikian
sangat mungkin bahwa integrasi DNA donor dalam kelompok homologi tDNA
dalam pengujian kami terjadi pada frekuensi yang lebih tinggi
dari apa yang diamati untuk integrasi situs parS . Namun, saat ini kami tidak
dapat memperkirakannya dengan menggunakan pendekatan yang sama
diuraikan di atas untuk E. coli karena bendungan sangat penting untuk kelangsungan hidup
V. kolera. Pembacaan yang kami kembangkan untuk upaya (ComM
fokus) dan rekombinasi homolog yang berhasil (integrasi
situs parS ) selama NT, namun, memberikan uji sensitif terhadap
mengukur efek mutasi yang berbeda (penghapusan, penyisipan,
dan mutasi titik) pada laju rekombinasi homolog.
Karena kami mengamati tingkat upaya integrasi yang serupa
tDNA yang berbeda (yaitu, jumlah fokus ComM) meskipun berbeda
tingkat keberhasilan integrasi, analisis ini juga menunjukkannya
bahwa pencarian homologi yang bergantung pada RecA dan/atau invasi untai
tidak terpengaruh oleh mutasi yang diperkenalkan karena
langkah-langkah ini mendahului pembentukan fokus ComM. Hasil kami
menunjukkan bahwa mutasi titik tidak terintegrasi dengan baik selama NT
karena ketidaksesuaian sistem perbaikan. Hal ini mungkin disebabkan oleh
komponen perbaikan ketidakcocokan menghalangi perkembangan rekombinasi
homolog (Tham et al., 2013) atau melalui perbaikan pasca-rekombinasi. Sistem
perbaikan ketidaksesuaian dapat diarahkan
oleh status metilasi DNA, dimana tidak termetilasi
untaian heterodupleks hemimetilasi ditargetkan untuk perbaikan.
Semua tDNA yang digunakan dalam penelitian ini adalah produk PCR yang
tidak termetilasi, yang akan menghasilkan heterodupleks hemimetilasi.
setelah integrasi tDNA. Penelitian terbaru menunjukkan hal tersebut
perbaikan ketidakcocokan fungsional, NT menggunakan DNA genom dapat membantu
transfer wilayah genom besar di V. cholerae yang mengandung
1508 Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019
sejumlah besar ketidakcocokan (Matthey dkk., 2019). Ini mungkin
karena fakta bahwa DNA genom dimetilasi atau mungkin disebabkan oleh
sistem perbaikan ketidakcocokan menjadi jenuh dengan diperkenalkannya
sejumlah besar mutasi titik seperti sebelumnya
dijelaskan dalam S. pneumoniae (Humbert et al., 1995). Masa depan
pekerjaan akan fokus pada mekanisme yang mendasari penghambatan NT
yang bergantung pada perbaikan dan faktor-faktor yang dapat mengatasinya
penghambatan ini dalam konteks alami.
Secara formal masih ada kemungkinan bahwa pewarisan nongenetik dari
produk gen selama NT hanyalah produk sampingan dari proses integrasi dan
tidak menghasilkan evolusi yang berarti
keuntungan. Namun kami telah memberikan bukti eksperimental dan diskusi
lebih lanjut di bawah ini untuk menyoroti beberapa potensi keuntungan dari
mode pewarisan nongenetik ini selama
tidak. Secara eksperimental, kami menunjukkan bahwa pewarisan nongenetik
selama NT dapat mempunyai konsekuensi biologis yang penting
untuk populasi yang ditransformasi menggunakan resistensi antibiotik sebagai
contoh. Secara khusus, kami menunjukkan bahwa, setelah integrasi
Pengkodean tDNA untuk penentu resistensi antibiotik, keduanya
sel yang ditransformasikan dan saudaranya yang tidak ditransformasikan secara
fenotip resisten terhadap antibiotik. Mungkin yang paling mengejutkan,
kami menemukan bahwa pewarisan resistensi antibiotik nongenetik ini bertahan
lama dan dapat memberikan resistensi terhadap sel yang belum berubah
selama beberapa generasi. Sementara kami hanya mengamati
pertumbuhan sel yang tidak berubah selama 3-5 generasi di
keberadaan antibiotik (Gambar 7, S7B, dan S7C; Video
S3, S4, dan S5), uji tantangan antibiotik kami menunjukkan hal tersebut
toleransi terhadap obat dapat bertahan lebih lama (Gambar 5).
Lingkungan alam pada umumnya bersifat dinamis dan ekspos
terhadap pemicu stres seperti antibiotik mungkin hanya bersifat sementara. Dengan demikian,
pewarisan nongenetik selama NT dapat memberikan keuntungan
dalam kondisi alami dengan memberikan resistensi sementara terhadap hal ini
pemicu stres. Menariknya, determinan resistensi yang digunakan
penelitian ini bekerja melalui mekanisme yang berbeda (KanR/SpecR =
menonaktifkan obat, CmR = pompa penghabisan, ErmR = memodifikasi obat
target); namun, semuanya merupakan mekanisme resistensi enzimatik.
Jika sel mewarisi sejumlah kecil enzim ini, mereka mungkin mengalaminya
memberikan resistensi obat fenotipik, yang dapat menjelaskan hal ini
mengapa resistensi dipertahankan selama beberapa generasi. Di sana
mungkin juga merupakan contoh di mana pewarisan nongenetik merugikan.
Misalnya, jika sel memperoleh modul toksin-antitoksin
oleh NT. Dalam sistem ini, antitoksin umumnya dilepaskan dengan cepat
terdegradasi, sedangkan toksinnya stabil (Gerdes et al., 2005).
Jadi, jika sel-sel mewarisi protein-protein ini secara non-genetik, mereka memang mewarisinya
cenderung menyerah pada aktivitas protein toksin karena
antitoksin akan terdegradasi dan tidak diisi ulang. Namun, pewarisan nongenetis
dari sifat apa pun melalui mode HGT ini,
bergantung pada ekspresi, stabilitas, dan aktivitas gen
produk yang menganugerahkannya.
Ada tiga mode utama HGT yang dapat memodifikasi bakteri
genom melalui rekombinasi: NT, konjugasi, dan fag
transduksi. Integrasi ssDNA, yang diperlukan untuk
transfer sifat nongenetik oleh NT, agak unik
ini. Konjugasi secara horizontal mentransfer satu untai
DNA ke penerima; Namun, diyakini bahwa untai komplementer disintesis
dengan cepat saat memasuki penerima sebelumnya
untuk rekombinasi (Willetts dan Wilkins, 1984). Demikian pula fag
transduksi dapat terjadi akibat suntikan dsDNA atau ssDNA,
Machine Translated by Google

Gambar 7. Uji Sel Tunggal untuk Mendemonstrasikan

Warisan Nongenetik dari Resistensi Kanamycin selama
NT Untuk skema rinci
pengaturan eksperimental, lihat Gambar S7A. Strain
induk secara konstitutif menyatakan mCherry-ParB1
(merah)/CFP-ParB2 (cyan) dan mengandung situs
parS1 dalam genom yang mengganggu gen gfp . Sel
kemudian diinkubasi dengan tDNA yang akan menghapus
situs parS1 , memulihkan gen gfp , dan mengintegrasikan
situs parS2 yang terhubung ke penanda KanR . Dengan
demikian, sel yang ditransformasi (yaitu sel yang benar-
benar mengintegrasikan tDNA) akan mengekspresikan
GFP (hijau), mengandung fokus CFP-ParB2, tidak
memiliki fokus mCherry-ParB1, dan harus
mengekspresikan produk gen KanR . Sementara sel
yang tidak ditransformasi harus mewakili genotipe induk
dan tidak boleh mengekspresikan GFP, mengandung
fokus mCherry-ParB1, tidak memiliki fokus CFP-ParB2,
dan tidak boleh mengekspresikan KanR. Namun, sel-sel
yang mewakili genotipe induk yang merupakan saudara
kandung dari sel yang ditransformasikan (yaitu, ''saudara
yang belum ditransformasi''), dapat mewarisi produk gen
GFP dan KanR secara non-genetik. Montase pencitraan
time-lapse dari satu sel transformasi predivisional yang
representatif di bawah bantalan glukosa M9+ yang
mengandung 100 mg/mL kanamisin ditampilkan. Titik
waktu awal menunjukkan bahwa saudara kandung yang
tidak bertransformasi mewarisi GFP yang diekspresikan
sebelum pembelahan sel, yang berfungsi sebagai proksi
untuk produk gen KanR (lihat sisipan pada 0 menit dan
50 menit untuk gambar saluran GFP saja). Seperti yang
diharapkan, saudara kandung yang bertransformasi,
yang secara genetik adalah KanR, tumbuh dengan baik
dengan adanya kanamisin. Dibandingkan dengan sel
yang tidak bertransformasi sama sekali, yang tidak tumbuh, saudara kandung yang tidak bertransformasi (yang secara genetik adalah KanS ) tumbuh dan membelah selama
beberapa generasi dengan adanya kanamisin, yang menunjukkan pewarisan nongenetik dari produk gen KanR. Eksperimen dicitrakan setiap 5 menit selama 10 jam. Batang skala, 2 mm.
Lihat juga Gambar S7 dan Video S3, S4, dan S5.

tetapi yang terakhir ini diyakini memerlukan sintesis untai komplementer sebelum yang dapat mengurangi kebugarannya dalam jangka panjang. Dengan demikian,
rekombinasi berhasil dengan genom inang (Kowalczykowski et al., 1994; van der warisan nongenetik, seperti yang dijelaskan dalam penelitian ini, dapat mewakili
Ende et al., 1983). Dengan demikian, tidak ada alasan apriori mengapa DNA harus lapisan tambahan lindung nilai taruhan untuk membantu memperbaiki biaya
diintegrasikan sebagai ssDNA selama NT, terutama mengingat tingginya tingkat kesesuaian yang terkait dengan HGT oleh NT.
rekombinasi yang diamati untuk dsDNA (Babic et al., 2008). Oleh karena itu,
tergoda untuk berspekulasi bahwa salah satu alasan sel mengintegrasikan ssDNA BINTANG+METODE
selama NT adalah untuk memfasilitasi transfer produk gen nongenetik selama
proses tersebut. Induksi kompetensi alami dan/atau keberhasilan NT hanya terjadi
Metode terperinci disediakan dalam versi online makalah ini dan mencakup hal-hal
pada subpopulasi kecil sel dalam populasi yang dapat ditransformasikan, yang
berikut:
diperkirakan terjadi sebagai strategi lindung nilai taruhan. Hal ini mungkin
disebabkan oleh fakta bahwa berkomitmen pada negara kompetensi menimbulkan d TABEL SUMBER DAYA UTAMA d
biaya kesesuaian (Johnsen et al., 2009; Ve-ening et al., 2008; Wylie et al., 2010). KONTAK UTAMA DAN KETERSEDIAAN BAHAN d MODEL
Alternatifnya, integrasi tDNA dari lingkungan, yang dapat mengandung mutasi EKSPERIMENTAL DAN RINCIAN SUBJEK
yang merusak, dapat merugikan sel yang ditransformasi (Moradigara-vand dan B Media dan kondisi pertumbuhan bakteri
Engelsta¨ dter, 2013; Redfield, 1988). Selain itu, meskipun terdapat keuntungan d RINCIAN METODE
nyata dari perolehan sifat-sifat seperti resistensi antibiotik, gen yang menghasilkan B Konstruksi strain mutan
sifat-sifat ini seringkali menimbulkan biaya kesesuaian yang signifikan (Melnyk et B Pencitraan
al., 2015). Dalam penelitian kami, sekitar setengah dari seluruh transforman berbagi Uji tantang antibiotik B NT d KUANTIFIKASI
produk gen turunan tDNA dengan saudara mereka yang tidak mengalami DAN ANALISIS STATISTIK d KETERSEDIAAN DATA DAN KODE
transformasi. Saudara kandung yang tidak bertransformasi yang mewarisi produk
gen ini memperoleh manfaat potensial dari tDNA dalam jangka pendek tanpa harus
mengeluarkan biaya potensial untuk mengintegrasikan mutasi yang merugikan atau INFORMASI SUPLEMEN
mempertahankan gen.
Informasi Tambahan dapat ditemukan online di https://doi.org/10.1016/j.
sel.2019.11.021.

Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019 1509

Machine Translated by Google
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami berterima kasih kepada CK Ellison dan NG Greene atas komentar kritisnya terhadap
naskah ini. Kami berterima kasih kepada CK Ellison, NG Greene, YV Brun, DK Chat-toraj,
dan ME Winkler atas diskusi yang bermanfaat. Untuk strain dan reagen yang terkait dengan
percobaan pneumokokus, kami berterima kasih kepada DA Morrison, ME Winkler, dan HT
Tsui. Kami berterima kasih kepada RL Gourse dan lab FX Barre untuk plasmid pFHC2973
dan pEP74. Kami juga berterima kasih kepada YV Brun dan anggota labnya atas bantuan
mikroskopi dan akses yang luas terhadap peralatan. Pekerjaan ini didukung oleh hibah
R35GM128674 dan AI118863 dari National Institutes of Health kepada ABD
KONTRIBUSI PENULIS
ABD merancang dan mengoordinasikan keseluruhan studi. ABD dan TND melakukan
eksperimen dan melakukan analisis data. ABD menulis naskah manuskripnya. Semua
penulis berkontribusi untuk mengedit naskah.
PERNYATAAN KEPENTINGAN
Para penulis menyatakan tidak ada kepentingan yang bersaing.
Diterima: 1 April 2019
Direvisi: 19 September 2019
Diterima: 14 November 2019
Diterbitkan: 12 Desember 2019
REFERENSI
Babic, A., Lindner, AB, Vulic, M., Stewart, EJ, dan Radman, M. (2008). Visualisasi langsung
transfer gen horizontal. Sains 319, 1533–1536.
Berge´, M., Mortier-Barrie`re, I., Martin, B., dan Claverys, JP (2003). Transformasi
Streptococcus pneumoniae bergantung pada perlindungan yang bergantung pada DprA
dan RecA pada untai tunggal DNA yang masuk. mol. Mikrobiol. 50, 527–536.
Berge´, MJ, Mercy, C., Mortier-Barrie`re, I., VanNieuwenhze, MS, Brun, YV, Grangeasse,
C., Polard, P., dan Campo, N. (2017). Penundaan pembelahan sel terprogram menjaga
integritas genom selama transformasi genetik alami pada Streptococcus pneumoniae. Nat.
Komunitas. 8 Agustus 1621.
Blokesch, M. (2016). Kompetensi alami untuk transformasi. Saat ini. biologi. 26, R1126–
R1130.
Boonstra, M., Vesel, N., dan Kuipers, OP (2018). DNA Berlabel Fluoresen Berinteraksi
dengan Protein Kompetensi dan Rekombinasi serta Terintegrasi dan Diekspresikan
Mengikuti Transformasi Alami Bacillus subtilis. MBio 9, e01161-18.
Borgeaud, S., Metzger, LC, Scrignari, T., dan Blokesch, M. (2015). Sistem sekresi tipe VI
Vibrio cholerae mendorong transfer gen horizontal. Sains 347, 63–67.
Corbinais, C., Mathieu, A., Kortulewski, T., Radicella, JP, dan Marsin, S.
(2016). Berikut transformasi DNA pada Helicobacter pylori dari serapan ke ekspresi. mol.
Mikrobiol. 101, 1039–1053.
Dalia, AB (2018). Kotransformasi Alami dan Pengeditan Genom Multipleks dengan
Transformasi Alami (MuGENT) dari Vibrio cholerae. Metode Mol. biologi. 1839, 53–64.
Dalia, AB, McDonough, E., dan Camilli, A. (2014). Pengeditan genom multipleks dengan
transformasi alami. Proses. Natal. Akademik. Sains. AS 111, 8937–8942.
Dalia, TN, Yoon, SH, Galli, E., Barre, FX, Waters, CM, dan Dalia, AB
(2017). Meningkatkan pengeditan genom multipleks dengan transformasi alami (Mu
-GENT) melalui inaktivasi eksonuklease ssDNA. Asam Nukleat Res. 45, 7527–7537.
David, A., Demarre, G., Muresan, L., Paly, E., Barre, FX, dan Possoz, C.
(2014). Dua situs yang berperan dalam Cis, parS1 dan oriC1, berkontribusi pada organisasi
longitudinal kromosom Vibrio cholerae I. Genet PLoS. 10, e1004448.
1510 Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019
Dubnau, D., dan Davidoff-Abelson, R. (1971). Nasib transformasi DNA setelah penyerapan
oleh Bacillus subtilis yang kompeten. I. Pembentukan dan sifat kompleks donor-penerima.
J.Mol. biologi. 56, 209–221.
Ducret, A., Quardokus, EM, dan Brun, YV (2016). MicrobeJ, alat untuk deteksi sel bakteri
dengan throughput tinggi dan analisis kuantitatif. Nat. Mikrobiol. 1, 16077.
Ellison, CK, Dalia, TN, Vidal Ceballos, A., Wang, JC, Biais, N., Brun, YV, dan Dalia, AB
(2018). Retraksi pili kompetensi tipe IV yang terikat DNA memulai pengambilan DNA
selama transformasi alami pada Vibrio cholerae. Nat. Mikro- biol. 3, 773–780.
Fogel, MA, dan Waldor, MK (2006). Mekanisme dinamis seperti mitosis untuk segregasi
kromosom bakteri. Pengembang Gen. 20, 3269–3282.
Fox, MS, dan Allen, MK (1964). Tentang Mekanisme Integrasi Deoksiribonukleat dalam
Transformasi Pneumokokus. Proses. Natal. Akademik. Sains. Amerika Serikat 52, 412–
419.
Gabor, M., dan Hotchkiss, RD (1966). Manifestasi organisasi linier dalam molekul DNA
transformasi pneumokokus. Proses. Natal. Akademik. Sains. Amerika Serikat 56, 1441–
1448.
Gerdes, K., Christensen, SK, dan Løbner-Olesen, A. (2005). Lokus respons stres toksin-
antitoksin prokariotik . Nat. Pendeta Mikrobiol. 3, 371–382.
Griffith, F. (1928). Pentingnya Jenis Pneumokokus. J.Hyg. (Lond.) 27, 113–159.
Haijema, BJ, Hahn, J., Haynes, J., dan Dubnau, D. (2001). Pos pemeriksaan yang
bergantung pada ComGA membatasi pertumbuhan selama pelarian dari kompetensi. mol.
Mikrobiol. 40, 52–64.
Humbert, O., Prudhomme, M., Hakenbeck, R., Dowson, CG, dan Claverys, JP (1995).
Rekombinasi homeolog dan perbaikan ketidakcocokan selama transformasi pada
Streptococcus pneumoniae: saturasi sistem perbaikan ketidakcocokan Hex. Proses. Natal.
Akademik. Sains. AS 92, 9052–9056.
Johnsen, PJ, Dubnau, D., dan Levin, BR (2009). Seleksi episodik dan pemeliharaan
kompetensi dan transformasi alami pada Bacillus subtilis.
Genetika 181, 1521–1533.
Kidane, D., dan Graumann, PL (2005). Protein intraseluler dan dinamika DNA dalam sel
Bacillus subtilis yang kompeten. Sel 122, 73–84.
Kowalczykowski, SC, Dixon, DA, Eggleston, AK, Lauder, SD, dan Rehrauer, WM (1994).
Biokimia rekombinasi homolog pada Escherichia coli. Mikrobiol. Wahyu 58, 401–465.
Kekurangan, S. (1962). Nasib molekuler DNA dalam transformasi genetik Pneumokokus .
J.Mol. biologi. 5, 119–131.
Lorenz, MG, dan Wackernagel, W. (1994). Transfer gen bakteri melalui transformasi
genetik alami di lingkungan. Mikrobiol. Wahyu 58, 563–602.
Marie, L., Rapisarda, C., Morales, V., Berge´, M., Perry, T., Soulet, AL, Gruget, C., Remaut,
H., Fronzes, R., dan Polard, P. (2017). Bakteri RadA adalah helicase tipe DnaB yang
berinteraksi dengan RecA untuk mempromosikan ekstensi D-loop dua arah.
Nat. Umum. 8, 15638.
Matthey, N., Stutzmann, S., Stoudmann, C., Guex, N., Iseli, C., dan Blokesch, M. (2019).
Predasi tetangga yang terkait dengan kompetensi alami mendorong perpindahan wilayah
genom besar pada Vibrio cholerae. eLife 8, e48212.
Megerle, JA, Fritz, G., Gerland, U., Jung, K., dan Ra¨ dler, JO (2008). Waktu dan dinamika
ekspresi gen sel tunggal dalam sistem pemanfaatan arabinosa . Biofisika. J.95 , 2103–
2115.
Meibom, KL, Blokesch, M., Dolganov, NA, Wu, CY, dan Schoolnik, GK
(2005). Kitin menginduksi kompetensi alami pada Vibrio cholerae. Sains 310, 1824–1827.
Me´ jean, V., dan Claverys, JP (1984). Penggunaan fragmen DNA hasil kloning untuk
menganalisis nasib DNA donor dalam transformasi Streptococcus pneumoniae.
J. Bakteriol. 158, 1175–1178.
Melnyk, AH, Wong, A., dan Kassen, R. (2015). Biaya kebugaran dari mutasi resistensi
antibiotik. berevolusi. Aplikasi. 8, 273–283.
Miller, VL, DiRita, VJ, dan Mekalanos, JJ (1989). Identifikasi toxS, gen pengatur yang
produknya meningkatkan aktivasi promotor toksin kolera yang dimediasi toxR. J. Bakteriol.
171, 1288–1293.
Machine Translated by Google

Modrich, P. (1991). Mekanisme dan efek biologis dari perbaikan ketidakcocokan. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch,
Tahun. Putaran. Jenderal. 25, 229–253. S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B ., dkk. (2012). Fiji: platform sumber terbuka untuk analisis

Moradigaravand, D., dan Engelsta¨ dter, J. (2013). Evolusi kompetensi alami: menguraikan gambar biologis. Nat. Metode 9, 676–682.

biaya dan manfaat seks pada bakteri. Saya. Nat. Seitz, P., dan Blokesch, M. (2014). Transportasi DNA melintasi membran luar dan dalam Vibrio
182, E112–E126. cholerae yang dapat ditransformasikan secara alami terjadi secara spasial tetapi tidak

Mortier-Barrie`re, I., Velten, M., Dupaigne, P., Mirouze, N., Pie´ trement, O., Mc -Govern, S., berpasangan secara temporal. MBio 5, e01409–e01414.

Fichant, G., Martin, B., Noirot, P., Le Cam, E., dkk. (2007). Peran prasinaptik utama dalam Tham, KC, Hermans, N., Winterwerp, HH, Cox, MM, Wyman, C., Kanaar, R., dan Lebbink, JH
transformasi protein bakteri yang tersebar luas: DprA menyampaikan ssDNA yang masuk ke (2013). Perbaikan ketidakcocokan menghambat rekombinasi homeolog melalui pelepasan
RecA. Sel 130, 824–836. terarah terkoordinasi dari struktur DNA yang terperangkap. mol.

Nero, TM, Dalia, TN, Wang, JC, Kysela, DT, Bochman, ML, dan Dalia, AB (2018). ComM adalah Sel 51, 326–337.

heksamerik helikase yang mendorong migrasi cabang selama transformasi alami pada beragam Unterweger, D., Miyata, ST, Bachmann, V., Brooks, TM, Mullins, T., Kostiuk, B., Provenzano,
spesies Gram-negatif. Asam Nukleat Res. 46, 6099–6111. D., dan Pukatzki, S. (2014). Sistem sekresi Vibrio cholerae tipe VI menggunakan beragam
modul efektor untuk kompetisi intraspesifik.

Nester, EW, Schafer, M., dan Lederberg, J. (1963). Keterkaitan Gen dalam Transfer DNA: Nat. Umum. 5, 3549.

Sekelompok Gen yang Berkaitan dengan Biosintesis Aromatik di Bacillus Subtilis. Genetika 48, van der Ende, A., Teertstra, R., van der Avoort, HG, dan Weisbeek, PJ
529–551. (1983). Sinyal inisiasi untuk sintesis DNA untai komplementer pada DNA plasmid untai tunggal.

Nielsen, HJ, Ottesen, JR, Youngren, B., Austin, SJ, dan Hansen, FG Asam Nukleat Res. 11, 4957–4975.

(2006). Kromosom Escherichia coli tersusun dengan lengan kromosom kiri dan kanan di bagian Veening, JW, Smits, WK, dan Kuipers, OP (2008). Bistabilitas, epigenetika, dan lindung nilai
sel yang terpisah. mol. Mikrobiol. 62, 331–338. pada bakteri. Ann. Pendeta Mikrobiol. 62, 193–210.

Piechowska, M., dan Fox, MS (1971). Nasib transformasi deoksiribonukleat menjadi Bacillus Weng, L., Biswas, I., dan Morrison, DA (2009). Kaset Cre-lox-ermAM yang dapat dihapus
subtilis. J. Bakteriol. 108, 680–689. sendiri , Cheshire, untuk penghapusan gen tanpa penanda pada Streptococcus pneumoniae .

Pillet, F., Sanchez, A., Lane, D., Anton Leberre, V., dan Bouet, JY (2011). J Mikrobiol. Metode 79, 353–357.

Spesifisitas pengikatan sentromer dalam perakitan kompleks partisi plasmid F. Willetts, N., dan Wilkins, B. (1984). Pemrosesan DNA plasmid selama konjugasi bakteri.
Asam Nukleat Res. 39, 7477–7486. Mikrobiol. Wahyu 48, 24–41.

Lapangan Merah, RJ (1988). Evolusi transformasi bakteri: apakah seks dengan sel-sel mati lebih Wylie, CS, Trout, AD, Kessler, DA, dan Levine, H. (2010). Strategi optimal untuk diferensiasi
baik daripada tidak berhubungan seks sama sekali? Genetika 119, 213–221. kompetensi pada bakteri. Genet PLoS. 6, e1001108.

Sel 179, 1499–1511, 12 Desember 2019 1511

Machine Translated by Google

BINTANG+METODE

TABEL SUMBER DAYA UTAMA

REAGEN atau SUMBER DAYA SUMBER PENGIDENTIFIKASI

Strain Bakteri

V. kolera E7946 (Miller dkk., 1989) T/A

S. pneumoniae R6 Rx1 Dcps DcomA Lihat (Weng dkk., 2009) T/A

Tabel S1 untuk daftar lengkap strain Pelajaran ini T/A

Bahan Kimia, Peptida, dan Protein Rekombinan

Kitin Alfa Aesar Kucing#J61206

Garam Laut Laut Instan Samudera Instan Kucing#SS15-10

Gelzan CM Sigma Aldrich Kucing#G1910-250G

NZ-Amina A Sigma Aldrich Kucing#C7290-500G

Trypticase Soy Agar dengan 5% darah domba BD BBL Kucing#221261

Oligonukleotida

Lihat Tabel S2 untuk daftar lengkap Pelajaran ini T/A

oligonukleotida

Perangkat Lunak dan Algoritma

Fiji/GambarJ (Schindelin dkk., 2012) https://imagej.net/Fiji

MikrobaJ (Ducret dkk., 2016) https://www.microbej.com/
Prisma v5.0a papan grafik T/A

KONTAK LEAD DAN KETERSEDIAAN BAHAN

Informasi lebih lanjut dan permintaan sumber daya dan reagen harus ditujukan dan akan dipenuhi oleh Kontak Utama, Ankur
Dalia (ankdalia@indiana.edu). Semua reagen unik/stabil yang dihasilkan dalam penelitian ini tersedia dari Kontak Utama tanpa
larangan.

MODEL EKSPERIMENTAL DAN RINCIAN SUBJEK

Media dan kondisi pertumbuhan bakteri

Semua strain V. cholerae yang digunakan selama penelitian berasal dari isolat V. cholerae E7946 (Miller et al., 1989). Lihat Tabel S1 untuk
daftar rinci semua strain yang digunakan dalam penelitian ini. Kecuali disebutkan lain, strain V. cholerae direkayasa agar kompeten secara alami seperti yang
dijelaskan sebelumnya (Ellison dkk., 2018). Strain secara rutin ditanam pada suhu 30C atau 37C dalam agar dan kaldu LB Miller
(BD Difco) ditambah dengan 100 mM IPTG, 200 mg/mL spektinomisin, 50 mg/mL kanamisin, 10 mg/mL trimetoprim, 100 mg/mL
streptomisin, 2 mg/mL kloramfenikol, 10 mg/mL eritromisin, 20 mg/mL karbenisilin, 0,5 mg/mL tetrasiklin dan/atau 50 mg/mL
zeocin sesuai kebutuhan.
Strain S. pneumoniae yang digunakan dalam penelitian ini adalah CP2137, turunan Dcps DcomA dari strain Rx1, yang disediakan dengan murah hati oleh
Dr Donald Morrison (Tabel S1). Semua strain pneumokokus secara rutin ditumbuhkan di CAT+GP (CAT = 10 g/L NZ-Amine A, 5 g/L tripton,
1 g/L ekstrak ragi, dan 5 g/L NaCl, yang ditambah dengan glukosa segar 0,2% dan 16 mM K2HPO4) dan pada Trypticase Soy Agar
dengan 5% darah domba (BD BBL) ditambah dengan 0,3 mg/mL eritromisin dan/atau 250 mg/mL kanamisin sesuai kebutuhan. Budaya di
CAT+GP ditanam secara statis pada suhu 37°C, sedangkan pelat agar diinkubasi pada suhu 37°C dalam stoples pemadaman lilin.

RINCIAN METODE

Konstruksi strain mutan

Semua strain mutan V. cholerae dan S. pneumoniae dihasilkan oleh PCR BUMN dan transformasi alami, kotransformasi, atau
MuGENT persis seperti yang dijelaskan sebelumnya (Dalia, 2018; Dalia et al., 2014, 2017). Untuk daftar semua primer yang digunakan dalam konstruksi regangan
lihat Tabel S2. Semua mutan dikonfirmasi oleh PCR dan/atau sekuensing. Sistem parB/S ortologis (yGFP-D23ParBMT1/parSMT1 =
yGFP-ParB1/parS1; CFP-D30ParBP1/parSP1 = CFP-ParB2/parS2) diamplifikasi dari pFHC2973 (Nielsen et al., 2006) (Plac-CFP- parBP1 yGFP-parBMT1) dan
pEP74 (Plac-yGFP-parBMT1) dan diintegrasikan ke dalam lokus lacZ menggunakan primer yang ditunjukkan pada Tabel S1.

e1 Sel 179, 1499–1511.e1–e3, 12 Desember 2019

Machine Translated by Google

Gen yGFP dalam konstruksi yGFP-parB1 dari sumber-sumber ini digantikan dengan mCherry atau CyPet (turunan CFP) seperti yang ditunjukkan pada
Tabel S1 menggunakan primer yang ditunjukkan pada Tabel S2.

Pencitraan
Semua strain V. cholerae yang digunakan untuk analisis biologis sel mengandung mutasi Ptac-tfoX dan DluxO yang menjadikan sel-sel ini kompeten secara
konstitutif tanpa adanya oligosakarida kitin. Latar belakang ini meningkatkan laju transformasi dalam populasi, sehingga memungkinkan analisis biologis
sel terhadap proses tersebut (Ellison et al., 2018). Kecuali dinyatakan lain, strain dibuat dengan menumbuhkan sel hingga log in LB yang ditambah dengan
20 mM MgCl2, 10 mM CaCl2, dan 100 mM IPTG. Sel-sel kemudian dicuci sekali dan diresuspensi dalam media laut instan (7 g/L; Sistem Akuarium). Sel
kemudian dicampur dengan tDNA sesuai indikasi dan ditempatkan di bawah bantalan gelzan 0,2% yang dibuat dengan media laut instan yang dilengkapi
dengan 100 mM IPTG kecuali dinyatakan lain.
Semua produk tDNA yang digunakan di seluruh naskah diamplifikasi dengan PCR (untuk detailnya lihat Tabel S1) dan berisi sisi homologi 3 kb karena hal
ini memungkinkan tingkat transformasi alami yang optimal (Dalia, 2018; Dalia et al., 2014). Gambar kontras fase dan fluoresensi dikumpulkan pada
mikroskop Nikon Ti-2 menggunakan objektif Plan Apo 3 60, kubus filter YFP, CFP, dan/atau mCherry, kamera Hamamatsu ORCAFlash4.0, dan perangkat
lunak pencitraan Nikon NIS Elements.

Tes tantangan antibiotik NT Untuk skema

prosedur eksperimental lihat Gambar S6A dan S6B. Untuk percobaan dengan V. cholerae yang hiperkompeten (yaitu, strain PtactoX DluxO ), sel
ditumbuhkan semalaman dalam LB yang ditambah dengan 100 mg/mL IPTG (seperti pada Gambar 5 dan S6). Kemudian, 108 sel dicuci, diresuspensi, dan
diencerkan ke dalam media laut instan. Selanjutnya, 3 mg tDNA (KanR atau SpecR yang sesuai) ditambahkan ke dalam reaksi, sementara tidak ada yang
ditambahkan ke reaksi kontrol 'tanpa DNA'. Produk tDNA diamplifikasi dengan PCR (untuk detailnya lihat Tabel S1) dan berisi sisi homologi 3 kb yang
mengelilingi penanda resistensi antibiotik karena hal ini memungkinkan tingkat transformasi alami yang optimal (Dalia, 2018; Dalia et al., 2014). Reaksi
diinkubasi pada suhu 30C selama 5 jam untuk memungkinkan integrasi DNA. DNAase I (NEB) kemudian ditambahkan ke reaksi untuk menghilangkan
semua DNA ekstraseluler yang tersisa. Selanjutnya, reaksi diencerkan ke dalam medium LB dan ditimbang selama waktu yang ditentukan (0 menit – 240
menit). Setelah pertumbuhan, sel-sel dicuci dua kali dan diresuspensi dalam media laut instan. Sebagian kecil dari setiap reaksi dimasukkan untuk kultur
kuantitatif pada media nonselektif untuk menentukan jumlah pertumbuhan. Selanjutnya, reaksi ditantang dengan antibiotik dosis tinggi (kanamisin 1000 mg/
mL atau spektinomisin 10.000 mg/mL jika diperlukan) selama 3 jam untuk membunuh semua sel yang rentan. Sel kemudian dicuci dua kali, diresuspensi
dalam medium laut instan, dan disepuh untuk kultur kuantitatif sesuai indikasi untuk menentukan jumlah transforman, non-transforman, dan rekombinan
tidak sah yang selamat dari pengobatan antibiotik. Kami juga melakukan eksperimen kontrol untuk menunjukkan bahwa sel KanR tidak dapat memberikan
resistensi fenotipik kanamisin terhadap sel yang rentan dalam trans (data tidak ditampilkan).

Untuk percobaan mempelajari transformasi alami antara dua strain V. cholerae dalam kondisi fisiologis (seperti pada Gambar 6), sel ditumbuhkan hingga
midlog dalam medium LB. Kemudian, 108 sel (strain dicampur 1:1) ditambahkan ke dalam 1mL reaksi yang mengandung 8 mg kitin (Alfa Aesar) dalam
media laut instan. Sel penerima mampu membunuh tipe VI yang diinduksi kitin, mengandung penanda DlacZ::SpecR yang memungkinkan untuk
membedakan sel penerima dan sel donor, dan mengandung penanda CmR dalam genomnya. Sel donor dalam pengujian ini dianggap rentan terhadap
pembunuhan tipe VI (melalui penghapusan ketiga modul toksin/antitoksin = DtseL/ tsiV1::CarbR, DvasX/ tsiV2::TetR, dan DvgrG3/ tsiV3::ZeoR), dianggap
non- dapat ditransformasikan (melalui mutasi DdprA::TmR ), dan menyimpan penanda KanR yang akan menggantikan penanda CmR di sel penerima.
Strain donor yang tidak memiliki penanda KanR digunakan sebagai kontrol negatif dalam pengujian ini. Reaksi diinkubasi secara statis selama 48 jam pada
kitin pada suhu 30C untuk menginduksi kompetensi alami dan memungkinkan pertukaran genetik melalui transformasi alami antara strain yang diinkubasi
bersama. Kemudian, DNase I ditambahkan ke reaksi untuk menghilangkan DNA ekstraseluler. Selanjutnya, 1 mL media LB ditambahkan ke dalam reaksi
dan dikocok dengan pengocokan pada suhu 37C selama 60 menit. Kitin dibiarkan mengendap selama 30 detik, dan kemudian supernatan yang
mengandung sel bakteri dipindahkan ke tabung segar, dicuci dua kali, dan disuspensikan kembali dalam media laut instan. Sel kemudian ditantang dengan
1000 mg/mL kanamisin dan diinkubasi pada suhu 30C selama 3 jam untuk membunuh sel yang rentan. Reaksi kemudian dicuci dua kali, diresuspensi
dalam media laut instan dan disepuh untuk kultur kuantitatif pada media selektif untuk menentukan jumlah transforman (SpecR + KanR CFUs),
nontransforman (SpecR + CmR CFUs), dan rekombinan ilegal (KanR + CmR CFUs) . ).

Untuk percobaan dengan S. pneumoniae, sel ditumbuhkan semalaman di piring agar darah. Keesokan harinya, sel-sel disuspensikan dari pelat ini
dengan CAT+GP dan diencerkan ke dalam 10 mL CAT+GP dan ditumbuhkan secara statis pada suhu 37°C selama 3-4 jam. Kemudian, 1mL reaksi
transformasi disiapkan dengan bahan berikut: 100 mL CAT+GP, 50 mL 20 mM CaCl2, 2,5 mL 250 mg/mL peptida stimulasi kompetensi (CSP), dan 850 mL
sel disesuaikan hingga OD600 = 0,05. Selanjutnya, 900 ng tDNA (DnanB::KanR) ditambahkan ke reaksi '+DNA', sementara tidak ada yang ditambahkan ke
reaksi 'NO DNA'. Produk tDNA diamplifikasi dengan PCR (untuk detailnya lihat Tabel S1) dan berisi sisi homologi 3 kb yang mengelilingi penanda resistensi
antibiotik karena hal ini memungkinkan tingkat transformasi alami yang optimal (Dalia, 2018; Dalia et al., 2014). Reaksi transformasi diinkubasi pada suhu
37C secara statis selama 30 menit untuk memungkinkan integrasi DNA. Kemudian, DNase I ditambahkan ke reaksi untuk mencerna DNA yang tidak
tercerna. Reaksi diinkubasi pada suhu 37C secara statis selama 30 menit tambahan. Reaksi kemudian ditumbuhkan dalam medium CAT+GP selama
waktu yang ditentukan (0 menit - 360 menit). Sebagian kecil dari setiap reaksi dimasukkan untuk kultur kuantitatif pada media nonselektif untuk menentukan
jumlah pertumbuhan. Sel kemudian dicuci satu kali dan diresuspensi dalam media laut instan yang mengandung kanamisin pada konsentrasi akhir 10.000
mg/mL. Reaksi diinkubasi pada suhu 37C secara statis selama 3,5 jam untuk membunuh sel yang rentan. Sel-sel kemudian dipelet, dicuci dua kali, dan
diresuspensi secara instan

Sel 179, 1499–1511.e1–e3, 12 Desember 2019 e2

Machine Translated by Google

media laut, dan disepuh untuk kultur kuantitatif yang diindikasikan untuk menentukan jumlah transforman (KanR CFUs), non-transforman (ErmR CFUs), dan
rekombinan tidak sah (KanR+ErmR CFUs) yang bertahan dari pengobatan kanamisin.

ANALISIS KUANTIFIKASI DAN STATISTIK

Nilai pasti dari n, apa yang diwakili oleh n, definisi pusat, dan ukuran penyebaran statistik didefinisikan dengan jelas dalam Gambar Legenda untuk setiap percobaan
di seluruh naskah.
Semua analisis pencitraan dilakukan dengan Fiji/ImageJ (Schindelin et al., 2012) dan MicrobeJ (Ducret et al., 2016). Untuk melacak fokus ComM, sel-sel langka
yang dimulai dengan fokus dalam timelapse (biasanya <<1%) dikeluarkan dari analisis. Durasi fokus ditentukan dengan menilai jumlah frame dimana fokus ComM
terlihat jelas. Jika fokus ComM dipisahkan oleh 2 bingkai atau lebih, maka peristiwa tersebut dianggap peristiwa independen (misalnya, diberi skor sebagai dua fokus
ComM jika terdapat dua bingkai intervensi yang tidak memiliki fokus). Berdasarkan durasi rata-rata fokus ComM adalah 9 menit (Gambar 1, dinilai melalui interval 1
menit), percobaan selanjutnya dicitrakan pada interval 3 menit untuk memungkinkan selang waktu yang lebih lama dan meminimalkan photobleaching. Untuk menilai
persentase sel yang membentuk fokus ComM, jumlah sel yang menghasilkan setidaknya satu fokus ComM dalam durasi waktu dibagi dengan jumlah total sel yang
dianalisis. Hasilnya, percobaan yang melacak sel dalam periode waktu yang lebih singkat menghasilkan persentase sel yang menunjukkan fokus ComM yang lebih
rendah, sedangkan selang waktu dengan durasi yang lebih lama menghasilkan persentase sel yang menunjukkan fokus ComM yang lebih tinggi (yaitu, bandingkan
Gambar 1 = 45 selang waktu menit ke Gambar 2 = selang waktu 5 jam).

Integrasi DNA yang berhasil menggunakan integrasi situs parS1 , dinilai dengan melacak pembentukan fokus de novo CyPet-ParB1 di dalam sel melalui mikroskop
time-lapse. Semua fokus ComM yang terbentuk sebelum munculnya fokus CyPet-ParB1 dinilai sebagai upaya independen dalam integrasi DNA. Tingkat keberhasilan
ditentukan berdasarkan 'per sel' dan 'per upaya'. Untuk basis per sel, ini didefinisikan sebagai persentase sel yang berhasil mengintegrasikan situs parS1 ke dalam
genomnya (yang diamati sebagai pembentukan fokus de novo CyPet-ParB1 di dalam sel) relatif terhadap jumlah total sel. yang mencoba mengintegrasikan DNA
(yaitu, jumlah sel yang menghasilkan setidaknya satu fokus ComM). Untuk setiap upaya, ini didefinisikan sebagai persentase sel yang berhasil mengintegrasikan
situs parS1 ke dalam genomnya (yang diamati sebagai pembentukan fokus de novo CyPet-ParB1 di dalam sel) relatif terhadap jumlah total upaya di Integrasi DNA
diamati (yaitu, jumlah total fokus ComM yang diamati.

Sel-sel yang berhasil mengintegrasikan situs parS ditandai dengan ''Sukses'', sementara sel-sel yang berusaha mengintegrasikan tDNA (yaitu, membentuk fokus
ComM) namun pada akhirnya gagal mengintegrasikan situs parS diberi batas ''Gagal.'' jumlah dan durasi fokus ComM dalam sel masing-masing kelas dianalisis
seperti yang ditunjukkan di atas dan diplot.
Untuk menilai integrasi ssDNA versus dsDNA, kami melakukan mikroskop time-lapse. Hanya sel-sel yang awalnya berisi satu genom (yaitu, dimulai dengan hanya
satu situs parS2 ) dan membentuk situs parS1 de novo selama selang waktu yang dianalisis. Sel yang menghasilkan sel predivisional dengan fokus ParB1 dan
ParB2 dinilai telah mengalami 'integrasi ssDNA', sedangkan sel yang membentuk dua fokus ParB1 dinilai telah mengalami 'integrasi dsDNA'.

Waktu yang diperlukan untuk ekspresi GFP turunan tDNA setelah replikasi kromosom ditentukan dengan mikroskop time-lapse. Integrasi tDNA menghasilkan
ablasi situs parS1 dan fokus ParB1 yang sesuai. Namun, setelah replikasi kromosom, situs parS1 dipulihkan dan sel-sel mereformasi fokus ParB1 yang sesuai
(seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4B). Dengan demikian, kemunculan kembali fokus ParB1 digunakan untuk membatasi replikasi kromosom. Waktu yang
dibutuhkan untuk ekspresi tDNA kemudian didefinisikan sebagai frame pertama setelah replikasi kromosom dimana ekspresi GFP terlihat jelas. Kadang-kadang, sel
mengekspresikan GFP tanpa kemunculan kembali fokus ParB1, yang kemungkinan mewakili peristiwa di mana integrasi dsDNA telah terjadi. Selain itu, untuk
percobaan di mana situs parS1 berada di hulu gen gfp yang tidak aktif (seperti yang ditunjukkan pada Gambar S5), karena penanda gfp* dan parS1 dipisahkan
sebesar 100 bp, kadang-kadang, sel akan mengintegrasikan penanda gfp tanpa menghapus situs parS1 ( atau sebaliknya). Kami tidak dapat membatasi ekspresi gfp
relatif terhadap replikasi kromosom secara andal untuk kejadian ini; oleh karena itu, sel-sel ini dikeluarkan dari analisis.

Warisan resistensi antibiotik nongenetik dilacak melalui mikroskop time-lapse. Sel yang mengandung alel gfp yang tidak aktif secara kromosom (Ptac-gfp*::parS1)
ditransformasikan dengan DNA yang akan memperbaiki gen gfp dan berisi penanda AbR dan situs parS2 yang terhubung. Urutan ketiga penanda pada tDNA ini
adalah parS2-AbR-Ptac-gfp. Urutan ini penting karena penanda pertama dan terakhir (parS2 dan Ptac-gfp) dapat dilacak secara visual dengan pembentukan fokus
ParB2 dan ekspresi GFP. Jadi, jika sel menerima penanda pertama dan terakhir, diasumsikan bahwa sel tersebut juga telah mengintegrasikan penanda AbR yang
mengintervensi. Dengan demikian, hanya sel yang menerima penanda pertama dan terakhir yang dianalisis untuk mengetahui pewarisan antibiotik nongenetik.
Dalam pengujian ini, sel pertama-tama diinkubasi dengan tDNA selama 3 jam dalam medium laut instan dan kemudian ditempatkan di bawah bantalan gelzan 0,2%
yang dibuat dalam medium minimal M9 yang dilengkapi dengan glukosa 1% dan antibiotik yang sesuai (kanamisin 100 mg/mL, eritromisin 10 mg/mL, atau
kloramfenikol 2 mg/mL sesuai indikasi). Sel dicitrakan setiap 5-10 menit hingga 12 jam.

KETERSEDIAAN DATA DAN KODE

Studi ini tidak menghasilkan/menganalisis kumpulan data/kode apa pun.

e3 Sel 179, 1499–1511.e1–e3, 12 Desember 2019

Machine Translated by Google

Angka Tambahan

Gambar S1. Fusi Fluoresen ComM Berfungsi sebagai Penanda Rekombinasi Homolog selama NT, Terkait dengan Gambar 1 (A dan B)
Montase pencitraan timelapse. Sel secara konstitutif menyatakan yGFP-ParB1/CFP-ParB2, berisi situs parS2 proksimal dari asal, situs parS1 proksimal dari
terminal, dan menyatakan mCherry-ComM. Sel diinkubasi dengan tDNA yang harus berintegrasi proksimal ke situs parS2 (lihat Gambar 1D untuk skema).
Montase di A memperlihatkan sel di mana fokus mCherry-ComM tidak tumpang tindih dengan situs parS2 . Bilah skala, 1 mm. Montase di B menunjukkan sel di
mana fokus mCherry-ComM menampilkan gerakan yang dilokalisasikan dengan situs parS2 . Bilah skala, 2 mm. (C) Skema, (D) contoh montase pencitraan
timelapse, dan (E) kuantifikasi kolokalisasi untuk eksperimen di mana sel ditransformasikan dengan tDNA yang mengintegrasikan proksimal ke situs parS1 .
Bilah skala di D adalah 1 mm. Data berasal dari dua percobaan independen; n = 136 fokus ComM dianalisis.
Machine Translated by Google

Gambar S2. Karakteristik Fokus ComM untuk Integrasi Mutasi Berbeda, Terkait dengan Gambar 2 Histogram yang
menunjukkan durasi fokus ComM dan jumlah fokus ComM dalam sel yang pada akhirnya berhasil versus gagal mengintegrasikan tDNA untuk (A) D0kb::parS1
DmutS (B) D1.5kb: :parS1, dan (C) parS1* DmutS.
Machine Translated by Google

Gambar S3. Contoh Integrasi dsDNA selama NT, Terkait dengan Gambar 3 Sel secara
konstitutif menyatakan yGFP-ParB1/CFP-ParB2 dan mengandung situs parS2 dalam genom. Sel kemudian ditransformasikan dengan tDNA yang akan menggantikan
situs parS2 dengan situs parS1 . (A) Skema untuk menunjukkan pengaturan eksperimental dan hasil yang diharapkan untuk integrasi dsDNA. (B) Montase pencitraan
timelapse untuk integrasi dsDNA selama NT. Setelah integrasi, replikasi dan segregasi kromosom menghasilkan dua fokus yGFP-ParB1 (panah putih), yang konsisten
dengan integrasi dsDNA. Bilah skala, 2mm.
Machine Translated by Google

Gambar S4. Penghapusan Situs parS yang Sudah Ada Memberikan Pembacaan Sensitif dan Segera untuk Integrasi tDNA dalam Sel Tunggal, Terkait dengan Gambar 2
(A) Skema
yang menunjukkan pengaturan eksperimental dan langkah-langkah yang diusulkan untuk integrasi tDNA. Sel secara konstitutif menyatakan yGFP-ParB1 dan CFP-ParB2,
berisi situs parS1 dan parS2 yang berdekatan dengan genom, dan menyatakan mCherry-ComM. Situs parS1 mengganggu gen gfp yang terintegrasi secara kromosom .
Sel ditransformasikan dengan tDNA untuk menghapus situs parS1 dan mengembalikan gen gfp . Eksperimen dicitrakan setiap 3 menit selama 5 jam. (B) Montase
pencitraan timelapse dari sel representatif yang berhasil mengintegrasikan tDNA. Pembentukan fokus ComM (panah putih) segera mendahului integrasi tDNA, yang
diamati sebagai hilangnya fokus yGFP-ParB1 (panah merah). Integrasi DNA yang berhasil juga dikonfirmasi oleh peningkatan ekspresi GFP (panah abu-abu). Skala bar, 2mm.
Machine Translated by Google

Gambar S5. Ekspresi DNA Terintegrasi Baru Terjadi dengan Cepat setelah Replikasi Kromosom, Terkait dengan Gambar 4 (A) Skema pengaturan
eksperimental. Sel mengandung situs parS1 (ParB1 merah) dan parS2 (cyan ParB2) yang berdekatan dengan kromosom. Situs parS1 berada di hulu gen gfp yang tidak
aktif (melalui penghapusan 87bp pada ujung 50 gen gfp atau mutasi dua titik yang memasukkan kodon stop prematur ke dalam gfp seperti yang ditunjukkan di bawah).
Sel kemudian ditransformasikan dengan tDNA untuk menghapus situs parS1 dan memperbaiki mutasi pada gen gfp . Eksperimen dicitrakan setiap 3 menit selama 5
jam. Histogram waktu ekspresi GFP turunan tDNA relatif terhadap replikasi kromosom (yang terjadi pada t = 0) untuk perbaikan (B) penghapusan 87bp pada gfp atau
(C) mutasi dua titik yang menyebabkan kodon stop prematur ke dalam gfp. Sel di C juga mengandung mutasi DmutS untuk menonaktifkan sistem perbaikan
ketidakcocokan. Data berasal dari tiga percobaan independen dan n = 104 dan n = 101 sel positif GFP dianalisis, masing-masing untuk B dan C.
Machine Translated by Google

Gambar S6. Warisan Nongenetik Resistensi Antibiotik Membutuhkan Integrasi DNA dan Relevan dengan Aminoglikosida Lain, Terkait dengan Gambar 5 (AB) Skema
pengujian
pewarisan nongenetik resistensi antibiotik. (C) Warisan nongenetik KanR diuji pada strain mutan yang ditunjukkan setelah pertumbuhan selama 60 menit. (D) Warisan
resistensi antibiotik nongenetik diuji dengan SpecR tDNA. Sel-sel tumbuh terlalu besar selama jangka waktu yang ditunjukkan pada sumbu x sebelum pengobatan
dengan spektinomisin dosis mematikan untuk membunuh sel-sel yang rentan. Semua data ditampilkan sebagai mean ± SD dan berasal dari 4 percobaan independen.
Machine Translated by Google

Gambar S7. Warisan Nongenetik selama NT Meningkatkan Resistensi terhadap Beragam Kelas Antibiotik, Terkait dengan Gambar 7 (A) Skema pendekatan
eksperimental yang digunakan untuk menguji pewarisan nongenetik resistensi antibiotik seperti pada Gambar 7 untuk kanamisin dan di sini untuk (B) eritromisin dan (C) kloramfenikol .
Sel ditransformasikan masing-masing dengan tDNA ErmR dan CmR , dan ditumbuhkan di bawah bantalan yang mengandung antibiotik yang sesuai (10 mg/mL eritromisin atau 2 mg/mL
kloramfenikol). Dibandingkan dengan 'sel yang tidak mengalami transformasi', yang tidak tumbuh, 'saudara kandung yang tidak mengalami transformasi' (yang secara genetis AbS )
tumbuh dan membelah selama beberapa generasi dengan adanya antibiotik. Hal ini menunjukkan bahwa saudara kandung yang tidak mengalami transformasi kemungkinan besar
mewarisi produk gen AbR yang diekspresikan dari genom saudara kandungnya yang telah mengalami transformasi sebelum pembelahan sel. Eksperimen dicitrakan setiap 10 menit
selama 12 jam. Batang skala, 2 mm.