Tugas kuliah Bioteknologi Kedokteran

Prinsip Rekayasa Genetika

HAVIZ YUAD
NIM : 2030312009
Pembimbing

dr. HIROWATI ALI, PhD

S 3 BIOMEDIK
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS ANDALAS PADANG
2021

1
 Prinsip Rekayasa Genetika

homas M. Lanigan 1,2,+, Huira C. Kopera 1,3,+ and Thomas L. Saunders 4,5,*

-0-

Abstrak:

Rekayasa genetika adalah penggunaan teknologi biologi molekuler untuk

memodifikasi urutan DNA dalam genom, dengan menggunakan berbagai
pendekatan. Misalnya, rekombinasi homolog dapat digunakan untuk menargetkan
sekuens spesifik dalam genom sel batang embrionik tikus (ES) atau sel kultur
lainnya, tetapi rumit, kurang efisien, dan bergantung pada seleksi positif/negatif
obat dalam kultur sel untuk sukses.

Metode lain yang diterapkan secara rutin termasuk integrasi acak DNA
setelah transfeksi langsung (mikroinjeksi), penyisipan DNA yang dimediasi
transposon, atau penyisipan DNA yang dimediasi oleh vektor virus untuk produksi
mencit dan tikus transgenik. Integrasi acak DNA terjadi lebih sering daripada
rekombinasi homolog, tetapi memiliki banyak kelemahan, meskipun efisiensinya.

Metode yang paling elegan dan efektif adalah teknologi berdasarkan

endonuklease terpandu, karena ini dapat menargetkan urutan DNA tertentu. Sejak
munculnya pengulangan palindromik pendek atau teknologi CRISPR / Cas9 yang
berkerumun secara teratur, penargetan gen yang dimediasi endonuklease telah
menjadi metode yang paling banyak diterapkan untuk merekayasa genom,
menggantikan penggunaan nuklease jari zinc, nuklease efektor seperti aktivator
transkripsi, dan meganuklease.

Perbaikan di masa depan dalam pengeditan gen CRISPR / Cas9 dapat

dicapai dengan meningkatkan efisiensi perbaikan yang diarahkan oleh homologi.
Di sini, kami menjelaskan prinsip-prinsip rekayasa genetika dan detail: (1)
bagaimana elemen umum dari teknologi saat ini mencakup kebutuhan untuk
terjadinya pemutusan kromosom, (2) penggunaan uji genotipe yang spesifik dan

2
sensitif untuk mendeteksi genom yang diubah, dan (3) modalitas pengiriman yang
berdampak pada karakterisasi modifikasi gen. Singkatnya, sementara beberapa
prinsip rekayasa genetika tetap teguh, yang lain berubah karena teknologi terus
berkembang dan terus merevolusi penelitian di banyak bidang.

1. Pendahuluan
Sejak identifikasi DNA sebagai unit hereditas dan dasar dari dogma sentral
biologi molekuler [1] bahwa DNA membuat RNA dan RNA membuat protein, para
ilmuwan telah melakukan eksperimen dan metode untuk memahami bagaimana
DNA mengontrol hereditas. Dengan ditemukannya alat biologi molekuler seperti
enzim restriksi, pengurutan DNA, dan kloning DNA, para ilmuwan dengan cepat
beralih ke eksperimen untuk mengubah DNA kromosom dalam sel dan hewan.
Dorongan untuk memahami fungsi gen pada hewan utuh pada akhirnya
diwujudkan dalam international knockout mouse project, yang tujuannya adalah
untuk melumpuhkan setiap gen dalam genom tikus, sehingga para peneliti dapat
memilih untuk membuat model tikus knockout dari perpustakaan gen. sel ES
knockout yang ditargetkan [11-13]. Ribuan model tikus telah dihasilkan dari upaya
itu dan telah digunakan untuk lebih memahami fungsi gen dan dasar penyakit
genetik manusia [14].

Proyek ini membutuhkan jalur pipa throughput tinggi untuk konstruksi

vektor, termasuk teknologi rekombinasi kromosom buatan bakteri (BAC) [13,15-
17]. BAC mengandung segmen panjang DNA genom kloning. Sebagai contoh,
library BAC mouse C57BL/6J, RPCI-23, memiliki ukuran insert rata-rata 197 kb
genomic DNA per clone [18]. Karena ukurannya, BAC sering membawa semua
elemen pengatur genetik untuk dengan tepat merekapitulasi ekspresi gen yang
terkandung di dalamnya, dan dengan demikian dapat digunakan untuk
menghasilkan tikus transgenik BAC [19,20].

Rekombinasi dapat digunakan untuk menyisipkan reporter di BACS yang

kemudian digunakan untuk menghasilkan tikus transgenik untuk secara akurat
memberi label sel dan jaringan sesuai dengan gen di BACS [21-26]. Berbagai
pendekatan untuk rekayasa genetika tersedia bagi para peneliti untuk memanipulasi
genom. Rekayasa transgen sel ES dan BAC telah memberikan cara untuk secara

3
langsung mengedit gen dalam zigot, akibatnya menghindari kebutuhan akan
intermediet sel ES atau BAC dalam perjalanan ke model hewan.
Sebelum adaptasi protein Streptococcus pyogenes Cas9 untuk
menyebabkan kerusakan kromosom, tiga sistem endonuklease lain digunakan: (1)
meganuklease pemotongan langka, (2) nuklease jari zinc (ZFNs), dan (3) efektor
seperti aktivator transkripsi (TALE ) nuklease (TALENS) [27]. Meganuclease I-
Crel mengenali sekuens DNA 22 bp [28,29]. Percobaan pembuktian konsep
menunjukkan bahwa endonuklease homing I-Crel yang direkayasa dapat digunakan
untuk menghasilkan tikus transgenik dan tikus transgenik [30]. Spesifisitas I-Crel
dapat disesuaikan untuk menargetkan sekuens spesifik dalam DNA dengan
metodologi rekayasa protein, meskipun hal ini membatasi penerapannya secara luas
pada rekayasa genetika [31]. Selanjutnya, teknologi ZFN dikembangkan untuk
menyebabkan kerusakan kromosom [32]. Satu jari zinc terdiri dari 30 asam amino
yang mengikat tiga pasangan basa.

Perkembangan transkripsi activator-like effector nucleases (TALENS)

diikuti setelah teknologi ZFN [38]. TALEN terdiri dari pengulangan tandem dari
34 asam amino. Asam amino pusat pada posisi 12 dan 13, bernama repeat variable
di-residues (NVDs), menentukan basa yang akan diikat oleh pengulangan [38].
Untuk mencapai pemutusan kromosom tertentu, diperlukan 15 pengulangan TALE
yang dirakit dan digabungkan ke domain endonuklease FokI (monomer TALEN).
Dengan demikian, satu monomer TALEN mengikat 15 pasangan basa pada satu
untai DNA, dan monomer TALEN kedua mengikat basa pada untai yang
berlawanan [38]. Ketika domain endonuklease FokI disatukan, terjadi pemutusan
DNA untai ganda. Dengan cara ini, heterodimer TALEN dapat digunakan untuk
menyebabkan pemutusan kromosom spesifik urutan. Diperkirakan bahwa, dalam
seluruh genom, TALENS memiliki situs pembelahan target potensial setiap 35 bp
[39].

Di sini, kami membahas prinsip-prinsip dalam rekayasa genetika untuk

desain dan karakterisasi alel yang ditargetkan pada zigot tikus dan tikus, atau dalam
garis sel yang dikultur, untuk produksi model kultur hewan dan sel untuk penelitian
biomedis.

4
Gambar 1. Tren terkini dalam injeksi mikro asam nukleat pada zigot, dan injeksi mikro sel punca
embrio (ES) ke dalam blastokista, untuk produksi tikus yang direkayasa secara genetik di Inti
Transgenik Universitas Michigan. Seperti yang ditunjukkan, sebelum pengenalan CRISPR / Cas9,
sebagian besar injeksi adalah sel ES, untuk menghasilkan tikus yang ditargetkan gen, dan transgen
DNA, untuk menghasilkan tikus transgenik. Setelah CRISPR/Cas9 tersedia, adopsi berjalan lambat
hingga 2014, ketika diterima dengan antusias, dan teknologi baru ini sesuai dengan berkurangnya
permintaan untuk injeksi mikro sel ES dan DNA.

2. Prinsip Rekayasa Genetika

2.1. Jenis-Jenis Modifikasi Genetik

Ada banyak jenis modifikasi genetik yang dapat dilakukan pada genom.
Kemampuan untuk secara khusus menargetkan lokasi dalam genom telah
memperluas kemampuan kami untuk membuat perubahan yang mencakup
knockout (penghapusan urutan DNA), knockins (penyisipan urutan DNA), dan
penggantian (penggantian urutan DNA dengan urutan eksogen). Penghapusan
dalam genom dapat digunakan untuk melumpuhkan ekspresi gen [56,57].
Penyisipan informasi genomik baru dapat digunakan untuk mengetuk
berbagai elemen genetik. Knockins juga merupakan pendekatan yang ampuh untuk
memodifikasi gen.

Penggantian sekuens DNA dalam genom dapat digunakan untuk mencapai

dua tujuan sekaligus, seperti memblokir fungsi gen, sekaligus mengaktifkan fungsi
gen baru seperti lacz. wartawan [66]. Penggantian urutan skala besar dimungkinkan
dengan teknologi sel ES tikus, seperti penggantian lokus imunoglobulin tikus

5
dengan lokus imunoglobulin manusia untuk menghasilkan tikus yang
"dimanusiakan" [67]. Selanjutnya, penggantian nukleotida tunggal yang sangat
kecil dapat digunakan untuk memodelkan mutasi titik yang diduga menyebabkan
penyakit pada manusia [68-70].
Jenis khusus dari penggantian urutan DNA adalah alel bersyarat. Alel
bersyarat memungkinkan ekspresi gen normal sampai Cre recombinase spesifik-
situs menghilangkan ekson kritis yang diapit loxP untuk menghasilkan ekson
"floxed" (diapit oleh loxP). Cre recombinase mengenali 34 bp loxP (locus of
recombination) elemen, dan mengkatalisis rekombinasi antara dua situs loxP
[71,72].

Rekombinasi situs-spesifik lainnya, seperti FLP, Dre, dan Vika, yang

bekerja pada prinsip yang sama juga telah diterapkan pada model tikus [75-80].
Knoin rekombinase dapat dirancang untuk melumpuhkan gen endogen atau
mempertahankan fungsinya [81,82]. Variasi dalam alel bersyarat adalah alel yang
dapat diinduksi, yang diam sampai ekspresinya diaktifkan oleh Cre recombinase
[79].

Aplikasi ini telah digunakan untuk menghasilkan tikus dengan gen bersyarat
untuk mutasi titik [89] dan telah diterapkan untuk menghasilkan gen ekson tunggal
bersyarat yang kekurangan ekson kritis menurut definisi [90].

2.2. Rekayasa Genetika dengan CRISPR/Cas9

Prinsip utama penargetan gen dengan CRISPR/Cas9, atau endonuklease
DNA terarah lainnya, adalah bahwa pemutusan DNA untai ganda dihasilkan dalam
sel yang diinginkan. Setelah pemutusan kromosom, hasil utama yang menarik
adalah perbaikan nonhomologous end-joining (NHEJ) [91] atau perbaikan yang
diarahkan homologi (HDR) [92]. Ketika pemutusan diarahkan ke ekson pengkode
dalam suatu gen, hasil NHEJ biasanya berupa penyisipan atau penghapusan kecil
urutan DNA pada pemutusan (indel), menyebabkan pergeseran bingkai pada
transkrip mRNA yang menyebabkan kodon terminasi prematur, menyebabkan
nonsense- peluruhan mRNA yang dimediasi dan hilangnya ekspresi protein [73].

6
 Aplikasi khas HDR termasuk penggunaan rekayasa genetika untuk
membatalkan ekspresi gen (gene knockouts), untuk memodifikasi kodon asam
amino (yaitu; mutasi titik), untuk mengganti gen dengan gen baru (misalnya;
knockins reporter fluorescent, Cre recombinase, pengkodean cDNA urutan), untuk
menghasilkan gen bersyarat (gen floxed yang biasanya diekspresikan sampai
mereka dinonaktifkan oleh Cre recombinase), untuk menghasilkan gen yang dapat
diinduksi Cre (gen yang hanya diekspresikan setelah Cre recombinase
mengaktifkannya), dan untuk menghapus DNA dari kromosom (misalnya;
menghapus elemen pengatur yang mengontrol ekspresi gen, menghapus seluruh
gen, atau menghapus hingga satu megabase segmen kromosom). Modifikasi yang
paling sederhana adalah pencabutan ekspresi gen.

Proses modifikasi gen yang dimediasi CRISPR/Cas9 (pengeditan gen)

untuk menghasilkan garis sel baru atau model hewan memiliki serangkaian langkah
yang sama untuk mencapai produk akhir. Pertama, gen yang diinginkan
diidentifikasi dan alel akhir yang diinginkan ditentukan. Langkah selanjutnya
adalah mengidentifikasi RNA pemandu tunggal (gRNA) yang akan digunakan
untuk menargetkan pemutusan kromosom di satu tempat atau lebih. Ada banyak
situs online yang dapat digunakan untuk tujuan ini [93]. Salah satu situs paling
mutakhir dan serbaguna adalah CRISPOR (http://crispor.tefor.net) [94].

Seperti yang dapat disimpulkan dari nama versi Cas9 yang direkayasa ini,
mereka dirancang untuk lebih spesifik daripada Cas9 tipe liar. Setelah gRNA dan
protein Cas9 tersedia, maka merupakan masalah "sederhana" untuk
menggabungkannya dan mengirimkannya ke sel target untuk menghasilkan
pemutusan kromosom dan mencapai knockout gen dengan memperkenalkan kodon
terminasi prematur atau penghapusan urutan DNA dari daerah pengatur atau
seluruh gen.

2.3. Vektor Rekayasa Genetika Khusus Lokus pada Zigot Tikus dan Mencit
Jenis rekayasa genetika yang paling menantang adalah penyisipan (yaitu;
knockin) dari urutan pengkodean yang panjang untuk mengekspresikan protein
reporter fluoresen, Cre recombinase, atau gen alel bersyarat (floxed). Selain
modifikasi genetik ini, banyak jenis reporter khusus lainnya dapat diperkenalkan,

7
masing-masing dirancang untuk mencapai tujuan yang berbeda. Ada minat besar
dalam mencapai penyisipan gen reporter yang cepat dan efisien dalam model hewan
dengan teknologi CRISPR/Cas9. Secara umum diakui bahwa, semakin lama
penyisipan, semakin kurang efisien untuk menghasilkan hewan knockin.
Prinsip desain donor DNA harus mencakup hal berikut: (1) perubahan
nukleotida yang mencegah pembelahan kromosom CRISPR/Cas9, setelah
pengenalan donor DNA; (2) penyisipan situs enzim restriksi yang unik untuk donor,
untuk menyederhanakan genotipe hilir; (3) penyisipan reporter atau urutan
pengkodean, setidaknya 1,5 kb panjangnya, yang dapat dimasukkan sebagai
templat DNA untai tunggal panjang dengan lengan pendek 100 pasangan basa
homologi [111], atau sebagai plasmid DNA untai ganda melingkar dengan panjang
(1,5 atau 2 kb) lengan homologi [63.110]; dan (4) penyisipan urutan pengkodean
yang lebih panjang, seperti Cas9, yang menggunakan donor DNA untai ganda
melingkar dengan lengan homologi yang lebih panjang [63,112].

Dengan demikian, uji PCR dirancang untuk secara khusus mendeteksi

persimpangan hulu dan hilir dari DNA yang dimasukkan dalam DNA genom. Tes
selanjutnya dapat digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa seluruh urutan eksogen
masih utuh. Gen bersyarat mewakili kasus penyisipan khusus, karena uji PCR yang
dirancang untuk mendeteksi penyisipan yang benar dari ekson yang diapit loxP juga
akan mendeteksi DNA genom [108]. Pada fase kedua, pendiri dikawinkan dan anak
anjing G1 diidentifikasi yang mewarisi mutasi yang diinginkan [114]. Pada fase
ketiga, penting untuk mengurutkan daerah genom tambahan di hulu dan hilir dari
DNA vektor penargetan yang disisipkan, karena Cas9 sangat efisien dalam
menginduksi pemutusan kromosom, tetapi tidak memiliki fungsi perbaikan.
Untuk knockout gen, amplikon PCR dari primer yang menjangkau situs
pemutusan kromosom dianalisis dengan sekuensing DNA. Hewan apa pun yang
merupakan tipe liar pada alel tidak dicirikan atau digunakan lebih lanjut, untuk
mencegah serangan yang tidak sesuai target memasuki koloni hewan atau fenotipe
yang mengacaukan. Hewan yang menunjukkan urutan DNA yang terganggu di
lokasi pemotongan Cas9 dikawinkan dengan hewan tipe liar untuk transmisi alel
mutan yang menghasilkan kodon terminasi prematur, untuk model knockout gen
[57,73]. Karena pendiri dari zigot yang dirawat dengan Cas9 adalah mosaik genetik

8
[55,115], penting untuk mengawinkan mereka dengan mitra pemuliaan tipe liar,
sehingga heterozigot wajib diproduksi. Dalam heterozigot, sekuens tipe liar dan
sekuens mutan dapat diidentifikasi secara tepat dengan teknik seperti kloning
TOPO TA (Invitrogen, CA, USA) atau metode sekuensing generasi berikutnya
(NGS) [117-120] Hewan yang membawa indel yang ditentukan , dengan sifat-sifat
yang diinginkan, kemudian digunakan untuk menetapkan garis untuk fenotip.
Pendekatan identik digunakan ketika sekuens DNA pendek dihapus oleh dua RNA
pemandu [58]..

2.4. Pengeditan Gen dalam Garis Sel yang Diabadikan

Pengeditan gen CRISPR/Cas9 dalam garis sel yang diabadikan
menghadirkan serangkaian tantangan unik dari yang digunakan dalam generasi
hewan transgenik. Garis sel mencakup berbagai karakteristik, sehingga setiap baris
ditangani secara berbeda. Beberapa karakteristik ini termasuk heterogenitas
fenotipe, ploidi kromosom yang menyimpang, tingkat pertumbuhan yang
bervariasi, efisiensi respons kerusakan DNA, efisiensi transfeksi, dan klonabilitas.
Sementara prinsip-prinsip desain eksperimental CRISPR/Cas9, sebagaimana
dinyatakan di atas, tetap sama, tiga pertimbangan utama harus diperhitungkan saat
menggunakan garis sel: (1) variasi jumlah salinan, atau jumlah alel dari gen yang
diinginkan; (2) efisiensi transfeksi garis sel; dan (3) isolasi klonal dari garis sel yang
dimodifikasi.

Karena semua jenis sel tidak sama, teknik pengiriman CRISPR/Cas9 yang
berbeda mungkin perlu diuji untuk mengidentifikasi metode mana yang paling
berhasil. Salah satu pendekatan adalah dengan menggunakan virus atau transposon
untuk mengirimkan reagen CRISPR/Cas9 (rinci di bawah). Namun, virus dan
transposon itu sendiri akan berintegrasi ke dalam genom, serta memungkinkan
ekspresi jangka panjang CRISPR/Cas9 di dalam sel. Ekspresi gRNA dan protein
Cas9 yang berkepanjangan ini dapat menyebabkan efek di luar target. Selain itu,
transfeksi dan elektroporasi dapat memiliki efisiensi yang bervariasi, tergantung
pada garis sel dan bentuk reagen CRISPR/Cas9 (misalnya; plasmid DNA atau
partikel ribonukleoprotein (RNPS)).

9
 Terlepas dari tantangan ini, kemajuan baru dalam teknologi CRISPR
kemungkinan dapat meringankan beberapa kesulitan ini saat mengedit garis sel.

2.5. Virus dan Transposon sebagai Vektor Rekayasa Genetika

Vektor virus dan transposon telah direkayasa untuk menjadi sistem
pengiriman materi genetik eksogen yang aman dan efisien ke dalam sel. Siklus
hidup alami beberapa virus dan transposon mencakup integrasi yang stabil ke dalam
genom inang. Di bidang rekayasa genom, vektor-vektor ini dapat digunakan untuk
memodifikasi genom dengan cara yang tidak diarahkan, dengan memasukkan kaset
yang mengekspresikan cDNA, shRNA, miRNA, atau RNA non-coding apa pun.
Vektor yang paling banyak digunakan yang mampu mengintegrasikan materi
genetik ektopik ke dalam sel adalah retrovirus, lentivirus, dan adeno-associated
virus (AAV).

Transposon, seperti vektor virus, diapit oleh pengulangan yang menandai

wilayah yang akan ditransposisikan [123]. Enzim transposase mengikat
pengulangan DNA mengapit dan memediasi eksisi dan integrasi ke dalam genom.
Tidak seperti vektor virus, transposon tidak dikemas menjadi partikel virus, tetapi
membentuk kompleks DNA-protein yang tetap berada di sel inang. Dengan
demikian, transgen yang akan diintegrasikan bisa jauh lebih besar daripada batas
pengemasan beberapa virus. Dua transposon, Sleeping Beauty (SB) dan piggybac
(PB), telah direkayasa dan dioptimalkan untuk aktivitas tinggi untuk menghasilkan
garis sel mamalia transgenik [124-126]. Sleeping Beauty adalah elemen
transposable yang dibangkitkan dari genom ikan. Sistem SB telah digunakan untuk
menghasilkan garis sel HeLa transgenik, sel T yang mengekspresikan reseptor
antigen chimeric yang mengenali antigen spesifik tumor, dan sel induk manusia
primer transgenik [127-129].

Selain penyisipan transgen, Sleeping Beauty (SB) dan piggyback (PB)

keduanya telah direkayasa untuk mengirimkan reagen CRISPR/Cas9 ke dalam sel
[133-135]. Mirip dengan lentivirus, integrasi stabil CRISPR/Cas9 oleh transposon
dapat meningkatkan kemanjuran penargetan dan memodifikasi banyak alel. SB dan
PB telah digunakan untuk mengirimkan beberapa gRNA untuk menargetkan
banyak gen (bukan hanya satu), membantu dalam penyaringan throughput tinggi.

10
 Salah satu solusi potensial untuk mengatasi tantangan ini adalah
menggabungkan teknologi. Misalnya, alih-alih mentransfeksi sel dengan plasmid
yang menyimpan gRNA yang diapit oleh pengulangan terminal SB (SB-CRISPR),
SB-CRISPR dapat diapit oleh pengulangan terminal AAV (rAAV) rekombinan
(AAV-SB-CRISPR), memungkinkan pengemasan ke TAAV. Untuk itu, rAAV-SB-
CRISPR telah digunakan untuk menginfeksi sel T murine primer, dan mengirimkan
konstruksi SB-CRISPR [136].

2.6. Rekayasa Genetika Menggunakan Retrovirus

Retrovirus adalah virus RNA yang bereplikasi melalui perantara DNA
[137]. Mereka termasuk dalam keluarga besar virus termasuk onco-retrovirus,
seperti Moloney murine leukemia virus (MMLV) (hanya disebut sebagai
retrovirus), dan lentivirus, termasuk human immunodeficiency virus (HIV). Di
semua retrovirus, genom RNA diapit di kedua sisi oleh pengulangan terminal
panjang (LTRS); dikemas dengan transkriptase balik virus, integrase, dan protease,
dikelilingi oleh kapsid protein; dan kemudian diselimuti menjadi partikel berbasis
lipid [138].

Tidak seperti retrovirus, lentivirus lebih suka berintegrasi ke dalam bagian

transkripsi dari gen yang diekspresikan di daerah kaya gen, jauh dari promotor dan
elemen pengatur [140.142.148]. Protein seluler LEDGF/p75 membantu dalam
pemilihan lokasi target dengan mengikat langsung ke gen aktif dan integrase virus
dalam kompleks praintegrasi HIV [149]. Secara keseluruhan, tampaknya vektor
SIN lentiviral lebih kecil kemungkinannya menyebabkan tumor dibandingkan
vektor retroviral dengan promotor LTR aktif [148.150-152].
Efisiensi transduksi yang tinggi dari lentivirus dapat menghasilkan banyak
sel pengekspres CRISPR/Cas9 untuk disaring, dibandingkan dengan metode
transfeksi yang lebih tradisional. Ekspresi CRISPR/Cas9 yang stabil dan
berkepanjangan dapat memfasilitasi penargetan beberapa alel gen yang diinginkan,
menghasilkan lebih banyak sel yang menyimpan modifikasi gen homozigot.
Sebaliknya, integrasi CRISPR/Cas9 yang stabil meningkatkan potensi efek di luar
target. Selain itu, integrasi lentiviral itu sendiri merupakan faktor yang dapat

11
mengacaukan fenotipe seluler dan harus dipertimbangkan ketika mengkarakterisasi
garis sel yang diedit CRISPR.

2.7. Penargetan Gen Menggunakan Virus Terkait Adeno

Adeno-associated virus (AAV) adalah parvovirus manusia dengan genom

DNA untai tunggal 4,7 kb, yang awalnya diidentifikasi sebagai kontaminan
preparat adenoviral [155]. Genom diapit di kedua sisi oleh pengulangan terminal
terbalik (ITR) dan berisi dua gen, rep dan cap [156.157]. Protein kapsid yang
berbeda memberikan serotipe dan penargetan spesifik jaringan dari AAVS yang
berbeda, in vivo AAV tidak dapat bereplikasi sendiri, dan membutuhkan virus
pembantu, seperti adenovirus atau virus herpes simpleks (HSV), untuk
menyediakan protein esensial dalam trans. AAV adalah satu-satunya virus yang
diketahui berintegrasi ke dalam genom manusia dengan cara spesifik lokasi di situs
AAVS1 pada kromosom 19q13.3-qter [158-160].

Namun, "keamanan" ini kontroversial, karena studi praklinis menunjukkan

genotoksisitas pada model tikus [168-171]. Diperlukan lebih banyak penelitian
untuk memahami dampak seluler dari integrasi rAAV. rAAV telah
digunakan untuk mengirimkan satu atau dua RNA panduan CRISPR (gRNA),
dalam sel dan hewan model, dengan memanfaatkan serotipe rAAV yang berbeda
untuk menargetkan sel atau tipe jaringan tertentu. Karena kapasitas pengemasan
rAAV, SpCas9 harus dikirimkan sebagai virus terpisah, tidak seperti lentivirus,
yang dapat dikirimkan sebagai vektor CRISPR/Cas9 "all-in-one". Namun, Cas9
alternatif yang lebih kecil dapat dikemas ke dalam rAAVs [172].

3. Kesimpulan
Ada banyak pendekatan untuk memasukkan informasi genetik baru ke
dalam kromosom dalam sel dan hewan. Saat ini, metode yang paling menarik
adalah penyisipan gen salinan tunggal pada lokus yang ditentukan. Pendekatan ini
memiliki banyak keuntungan, sehubungan dengan ekspresi transgen yang dapat
direproduksi. Transgenesis penyisipan acak telah efektif digunakan untuk
menyelidiki fungsi gen pada model tikus [176]. Secara umum diterima bahwa ini

12
membutuhkan pemutusan kromosom spontan [176]. Data NGS terbaru
menunjukkan bahwa mekanisme perbaikan menyerupai chromothripsis [118.177].

Selain gangguan gen yang tidak diinginkan karena kerusakan kromosom,

penyisipan transgen secara acak memaparkan mereka pada "efek posisi" di mana
ekspresi mereka dikendalikan oleh gen tetangga [118.178]. Idealnya, penyisipan
cDNA reporter dalam genom menghasilkan penyisipan transgen salinan tunggal di
lokus yang ditentukan sedemikian rupa sehingga gen endogen tidak terganggu, dan
reporter ditempatkan di bawah kendali promotor endogen tertentu [179].

Penerapan teknologi CRISPR/Cas9 untuk mengatasi masalah ini

menunjukkan dapat digunakan untuk mencapai tujuan tersebut [63,82,180].
Perkembangan teknologi pengeditan dasar CRISPR/Cas9 menunjukkan bahwa
dimungkinkan untuk membuat perubahan nukleotida tunggal dalam genom [181-
184]. Editor dasar memiliki keuntungan bahwa pemutusan kromosom untai ganda
tidak diproduksi, sehingga mengurangi kemungkinan mutasi yang tidak diinginkan
dalam genom.

Pendekatan baru untuk penyisipan kecil dalam genom dengan

menggunakan urutan donor RNA yang menyatu dengan sgRNA dalam kombinasi
dengan reverse transcriptase yang menyatu dengan Cas9 yang mati juga
menghindari kebutuhan untuk menghasilkan pemutusan untai ganda pada
kromosom.

Pendekatan ini disebut sebagai "pengeditan utama" [185]. Teknologi

CRISPR yang menghindari pemutusan kromosom, sambil membuat perubahan
pada genom, sangat penting dalam aplikasi klinis di mana perubahan yang tidak
diinginkan dapat berdampak buruk pada pasien. Versi lanjutan dari teknologi
CRISPR ini akan penting untuk penelitian di masa depan.
Keinginan untuk menerapkan CRISPR/Cas9 untuk penyisipan transgen
yang ditargetkan tercermin dalam banyaknya metode yang diarahkan untuk tujuan
ini [63.108.110.112.186.187]. Setiap metode berhasil digunakan untuk merekayasa
genom tikus dan tikus (Tabel 1). Setiap metode terbukti lebih hemat biaya dan cepat
daripada penerapan teknologi sel ES tikus atau tikus. Bagi praktisi seni,

13
pertanyaannya tetap: metode mana yang paling efisien? Artinya, metode mana yang
meminimalkan jumlah hewan yang dibutuhkan untuk produksi zigot dan
memaksimalkan jumlah pendiri bertarget gen? Salah satu pendekatan untuk
pertanyaan ini adalah membandingkan efisiensi transgenik dari masing-masing
metode [188]. Hasil pada Tabel 1 menunjukkan bahwa eksperimen efisiensi
tertinggi diperoleh ketika donor DNA untai tunggal panjang dan ribonukleoprotein
Cas9 digunakan untuk menghasilkan tikus rekayasa genetika. Semua metode sangat
efektif dibandingkan dengan metode tradisional penargetan gen pada zigot.
Mungkin jalan masa depan untuk penargetan gen yang lebih efisien terletak pada
penerapan aktivator molekul kecil untuk HDR [189-191].

--

14