Host Genetic Factors Associated with Vaginal Microbiome Composition in Kenyan Women1

Faktor Genetik Host yang Berhubungan dengan Komposisi Mikrobioma Vagina pada Wanita
Kenya1

ABSTRAK
Vaginosis bakteri (BV) mempengaruhi 20% wanita di seluruh dunia dan dikaitkan
dengan dampak buruk bagi kesehatan reproduksi dan peningkatan risiko HIV. Biasanya, BV
menandakan pergeseran mikrobioma vagina dari yang didominasi oleh Lactobacillus ke jenis
yang beragam. Perbedaan ras yang terus-menerus dalam BV dan komposisi mikrobioma
vagina yang beragam tumpang tindih dengan perbedaan ras dalam risiko HIV dan infeksi
menular seksual, terutama di antara wanita keturunan Afrika. Faktor risiko BV dan
mikrobioma vagina yang tidak optimal termasuk praktik seksual, perbedaan ras disesuaikan
dengan faktor perilaku, menunjukkan komponen genetik host. Di sini, kami melakukan studi
asosiasi genome pada sifat mikrobioma vagina pada wanita Kenya. Regresi linier dan regresi
logistik dilakukan, disesuaikan dengan usia dan komponen utama dari keturunan genetik,
untuk mengevaluasi hubungan antara Lactobacillus crispatus, Lactobacillus iner, Gardnerella
vaginalis, Shannon diversity index, dan Community State Type (CST) dengan host genetic
single nucleotide polymorphisme (SNPs). Kami mengidentifikasi lokus genomik baru yang
terkait dengan sifat mikrobioma vagina, meskipun tidak ada SNP yang mencapai signifikansi
luas genom. Selama analisis memperbanyak jalur, Toll-like Receptors (TLR), produksi
sitokin, dan komponen lain dari respons imun bawaan dikaitkan dengan L. crispatus, L. iner,
dan CST. Beberapa lokus genomik yang dilaporkan sebelumnya telah direplikasi, termasuk
IL-8(Shannon, CST), TIRAP (L. iner, Shannon),TLR2 (Shannon, CST), MBL2 (L. iner, G.
vaginalis, CST), dan MYD88 (L. iner, Shannon). Asosiasi genetik ini menunjukkan peran
sistem imun bawaan dan pensinyalan sel dalam komposisi mikrobioma vagina dan
kerentanan terhadap mikrobioma vagina yang tidak optimal.

PENTINGNYA
Secara global, bakterial vaginosis (BV) adalah kondisi umum pada wanita. BV
dikaitkan dengan hasil kesehatan reproduksi yang lebih buruk dan risiko HIV. Biasanya, BV
mewakili pergeseran mikrobioma vagina dari yang didominasi oleh Lactobacillus ke yang
beragam. Meskipun banyak wanita memiliki eksposur yang sama, prevalensi BV dan
mikrobioma vagina yang tidak optimal meningkat untuk wanita keturunan Afrika,
menunjukkan kemungkinan peran genetik host. Kami melakukan studi asosiasi genome dari
sifat mikrobioma vagina yang penting pada wanita Kenya. Kami mengidentifikasi lokus
genetik baru dan jalur biologis yang terkait dengan imunitas mukosa, pensinyalan sel, dan
infeksi yang terkait dengan sifat mikrobioma vagina; kami mereplikasi lokus yang dilaporkan
sebelumnya terkait dengan respons imun mukosa. Hasil ini memberikan wawasan tentang
pengaruh potensial genetik host pada komposisi mikrobioma vagina dan dapat memandu
studi longitudinal yang lebih besar, dengan perbandingan genetik dan fungsional di seluruh
situs mikrobioma dalam individu dan lintas populasi.
vaginosis akterial (BV) adalah kondisi klinis dan kesehatan masyarakat yang
signifikan. BV lazim pada 20 hingga 50% wanita di Afrika sub-Sahara. Dalam meta-analisis,
Atashili et al. memperkirakan risiko relatif tertular HIV menjadi 1,6 kali lebih tinggi untuk
wanita dengan BV, sama dengan fraksi yang disebabkan oleh populasi sebesar 15% karena
tingginya prevalensi dalam populasi. BV juga dikaitkan dengan peningkatan kemungkinan
infeksi menular seksual (IMS) dan berdampak pada kehamilan. BV mewakili pergeseran
polimikroba dalam mikrobioma vagina, seringkali dari koloni yang didominasi oleh
Lactobacillus ke salah satu yang beragam, dengan beberapa spesies bakteri anaerob.
Khususnya, Lactobacillus crispatus telah terbukti protektif terhadap BV, HIV, dan IMS. BV
dianggap sebagai infeksi yang ditingkatkan secara seksual, dan individu dengan pasangan
seks baru atau ganda, mereka yang melakukan hubungan seks vaginal tanpa kondom, atau
mereka yang pasangan seksnya tidak disirkumsisi diduga dapat meningkatkan risiko BV.
Selain faktor risiko seksual, faktor risiko nonseksual yang terkait dengan BV termasuk
praktik kebersihan intravaginal dan vagina, merokok, dan ras/etnis. Dalam banyak penelitian,
wanita keturunan Afrika memiliki peningkatan risiko BV dan komposisi mikrobioma vagina
yang tidak optimal. Asosiasi ini dengan ras bertahan bahkan ketika mengendalikan
sosiodemografi dan praktik seksual, yang mengarah ke hipotesis bahwa faktor genetik dapat
mempengaruhi komposisi mikrobioma vagina sehingga menyebabkan BV.
Sampai saat ini, sejumlah penelitian terbatas telah meneliti kontribusi genetik host
terhadap flora vagina dan BV. Terutama studi ini telah difokuskan pada perbedaan host
dalam gen kandidat yang bertanggung jawab untuk respon imun inflamasi mukosa dalam
kondisi infeksi lainnya. Sebagaimana diulas oleh Turovskiy et al., penelitian telah
menargetkan Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) dalam (i) gen Toll-like receptor
(TLR) karena perannya dalam mengenali potensi ancaman dan memulai respons inflamasi
dan mengaktifkan sel imun lainnya dan (ii) sitokin proinflamasi dan sitokin inflamasi
(misalnya, interleukin 1β [IL-1β], Tumor Necrosis Factor [TNF-α]). Sebagian besar studi ini,
mengevaluasi kaitan SNP dengan BV atau taxa spesifik yang terkait dengan BV (misalnya,
Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae), dan tidak ada penelitian yang mengukur
mikroflora vagina atau kontribusi genetik host secara komprehensif, seperti dengan
karakterisasi mikroba molekuler cultivation independent atau Genome-Wide Association
Study (GWAS).
Untuk mengatasi kesenjangan ini, kami melakukan GWAS pada sifat mikrobioma
vagina di antara wanita asli Kenya. Kami berhipotesis bahwa dengan melakukan GWAS,
kami akan mengidentifikasi lokus genomik baru yang terkait dengan sifat mikrobioma
vagina, memajukan pemahaman kami tentang faktor genetik yang mendasarinya.
Mengidentifikasi varian genetik dapat membantu dalam menjelaskan mekanisme biologis
yang terkait dengan sifat mikrobioma vagina yang kompleks ini dan penyakit terkait.
Melengkapi GWAS, kami melakukan analisis replikasi SNP yang sebelumnya dilaporkan
terkait dengan mikroflora vagina atau BV.

HASIL
Sampel Studi. Di antara 171 wanita yang dimasukkan dalam analisis ini, prevalensi
BV pada awal adalah 22% (Tabel 1). Lebih dari setengah (53%) wanita adalah seropositif
virus herpes simpleks 2 (HSV-2), dan 10% HIV positif, yang sesuai dengan prevalensi HIV
di antara wanita dalam rentang usia ini pada populasi umum di wilayah Kenya barat.
Lactobacillus crispatus ada 25% sampel (28% berarti prevalensi relatif), Lactobacillus iner
muncul di 83% sampel (rata-rata prevalensi relatif 45%), dan Gardnerella vaginalis hadir
dalam 75% sampel (25% rata-rata prevalensi relatif).
 Hasil asosiasi genom. Nilai faktor inflasi genomic control (GC), λ, adalah 1.01, 1.00,
1.00, 1.00, dan 1.00 untuk L. crispatus, L. iner, G. vaginalis, Shannon diversity index, dan
CST, masing-masing, setelah disesuaikan dengan usia dan tiga komponen utama pertama.
Setelah inspeksi visual dari plot Quantile-Quantile (QQ) (Gambar. S1 dalam bahan
tambahan), yang diamati nilai P tidak menyimpang dari nol, kecuali pada ekor yang ekstrim.
Bersama dengan faktor inflasi genomik, plot QQ menunjukkan kontrol yang tepat dari
stratifikasi populasi.
Gambar 1A hingga E menampilkan plot Manhattan dari seluruh nilai P genom untuk
setiap sifat mikrobioma vagina. Tabel 2 merangkum SNP teratas (P<1x10 -5) untuk setiap sifat
mikrobioma vagina dan frekuensi alel minor (MAF) yang berasal dari data kami. Secara
keseluruhan, tidak ada SNP yang mencapai signifikansi genom (0,05/336.151=1,49E-07).
SNP dengan penyesuaian nilai P terendah terkait dengan keberadaan L. Crispatus adalah
rs73330467 (P=4.79x10-6; Gambar 1A), terletak di wilayah intergenik antara LOC101927488
dan GRAMD2B pada kromosom 5. Alel minor G (MAF 0,07) dikaitkan dengan peningkatan
kemungkinan 11,6 kali lipat untuk mendeteksi L. crispatus. SNP paling signifikan terkait
dengan prevalensi relatif L. Iner adalah rs527430 (P=6.98x10-7; Gambar 1B) pada kromosom
1, terletak di daerah intergenik antara FOXD2 dan TRABD2B. Alel minor A (MAF 0,06)
dikaitkan dengan peningkatan prevalensi relatif L. Iner (β=1.05). SNP paling signifikan yang
terkait dengan G. vaginalis adalah rs1229660 (P=4.65x10-6; Gambar 1C) terletak di antara
SNX10-LOC441204 pada kromosom 7. Alel minor C (MAF=0.10) dikaitkan dengan
penurunan prevalensi relatif G. vaginalis (β= -0,99). SNP paling signifikan yang terkait
dengan Shannon diversity index adalah rs972741 (P=8.52x10 -7; Gambar 1D) terletak di
antara ZKSCAN2 dan HS3ST4 pada kromosom 16. Alel minor A (MAF=0,19) dikaitkan
dengan peningkatan Shannon diversity index (β=0,66). Yang paling signifikan SNP yang
terkait dengan CST adalah rs2302902 (P=3.09x10 -6; Gambar 1E) terletak di ELK3 pada
kromosom 12. Alel minor T (MAF=0,20) dikaitkan dengan peningkatan CST-I dan CST-II
dengan keragaman lebih rendah dibandingkan dengan CST-IV (β=0,41). Analisis sensitivitas
dilakukan untuk lebih menyesuaikan status HIV dan virus herpes simpleks (HSV) dan
menghasilkan hasil dan kesimpulan yang serupa (lihat Tabel S1 dalam materi tambahan).
Hasil untuk perbandingan SNP teratas antara sifat mikrobioma vagina yang disajikan pada
Tabel S2. Secara keseluruhan, setiap sifat mikrobioma dikaitkan dengan setidaknya satu SNP
teratas lainnya, yaitu, 1 untuk L. crispatus, 4 untuk L. iner, 4 untuk G. vaginalis, 3 untuk
Shannon diversity index, dan 5 untuk CST.
Gambar 1. (A sampai E) Manhattan plot untuk polimorfisme nukleotida tunggal yang terkait
dengan sifat mikrobioma vagina. Axis x sesuai dengan posisi genom, dan axis y
menunjukkan log10 dari nilai P. Garis merah horizontal sesuai dengan ambang batas genom-
wide.
aL.crispatus is modeled as presence/absence; L. iners and G. vaginalis are modeled as continuous and quantiles of inverse log-transformed relative
abundance,respectively. SNP, single nucleotide polymorphism.
bChr, chromosome.
cGene name is in boldface if the SNP is located within the gene.
dA1/A2, allele 1/allele 2.
eMAF, minor allele frequency.
_5
fSNPs with a P value of <1x10 for each trait are included in the table.
gReported as odds ratio.

Hasil dari SNP yang diperhitungkan. Kami melakukan imputasi genotipe untuk
memperluas cakupan genom dan menginterogasi SNP tambahan yang tidak secara langsung
digenotipe. Setelah menghapus SNP dengan kualitas imputasi rendah dan frekuensi rendah
(R-squared [Rsq] < 0,30 dan MAF < 1%), beberapa SNP yang diperhitungkan (tetapi tidak
ada wilayah genom tambahan) diidentifikasi. Gambar 2 menyajikan plot asosiasi SNP
regional untuk masing-masing ciri mikrobioma vagina. Dalam ZKSCAN2-HS3ST4 daerah
intergenik pada kromosom 16, beberapa SNP diperhitungkan lebih signifikan terkait dengan
Shannon diversity index daripada yang digenotip secara langsung (Gbr. 2E). SNP paling
signifikan di wilayah ini adalah rs115869045 (P=4,77x10-7; Rsq= 0,70).
Analisis bersyarat. Kami melakukan analisis kondisional untuk lokus genomik di
mana SNP paling signifikan diidentifikasi untuk setiap sifat mikrobioma vagina untuk
menentukan apakah SNP tambahan (±400 kb) berkontribusi pada asosiasi yang diamati.
Gambar S2 menampilkan asosiasi SNP regional yang mengkondisikan SNP dengan genotipe
langsung yang paling signifikan dengan memasukkan SNP sebagai kovariat dalam model
regresi. Seperti yang ditunjukkan di setiap plot, semua asosiasi SNP langsung dikurangi
menjadi nol, menunjukkan bahwa SNP yang diidentifikasi adalah SNP utama untuk asosiasi
yang diamati.
 Gambar 2. (A hingga E) Plot asosiasi regional dari lokus genom teratas yang terkait
dengan sifat mikrobioma vagina. Nilai P (-log10) dari GWAS (lingkaran padat) Axis y diplot
sebagai posisi genom setiap SNP pada axis x untuk setiap sifat mikrobioma. Gen di wilayah
tersebut ditunjukkan di bawah ini. Nilai linkage disequilibrium (LD) (r 2) antara SNP utama
dan SNP lainnya ditunjukkan dalam warna yang berbeda.
Analisis lokus yang dilaporkan sebelumnya. Kami menyelidiki hubungan SNP
yang dilaporkan sebelumnya dalam kaitannya dengan BV atau mikroflora vagina untuk
menentukan apakah hubungan ini relevan dalam populasi Kenya. Gambar 3 dan Tabel S3
merangkum temuan-temuan ini. Secara keseluruhan, 49 autosomal SNP diidentifikasi dari
penelitian sebelumnya, di mana 45 SNP menunjukkan kualitas imputasi tinggi (Rsq ≥ 0,30).
Saat dianalisis, 7 SNP untuk L. iner, 8 SNP untuk L. crispatus, 6 SNP untuk G. vaginalis, 10
SNP untuk Shannon diversity index, dan 8 SNP untuk CST memiliki P<0,05 dalam sampel
kami. Temuan ini, tidak signifikan setelah menerapkan koreksi Bonferroni
(0,05/49=0,00102).
Untuk mereplikasi lokus genom yang terkait dengan sifat-sifat mikrobioma, kami
mengekstraksi SNP yang diperhitungkan paling signifikan dalam 100 kb dari SNP yang
dilaporkan sebelumnya untuk setiap sifat mikrobioma dalam penelitian kami. Pendekatan ini
menghasilkan 6 wilayah genomik untukL. iner, 1 wilayah genom untukG. vaginalis, 7
wilayah genom untuk Shannon diversity index, dan 4 wilayah genom untuk CST yang
signifikan setelah koreksi Bonferroni (Gbr. 3 dan Tabel S3). Tidak ada wilayah yang
signifikan setelah beberapa koreksi pengujian untukL. crispatus. Daerah genomik yang
direplikasi meliputiIL1RN(CST),IL-5(Shannon),IL5RA(L. iner, Shannon),IL-8(Shannon,
CST),TIRAP(L. iner, Shannon),TLR2(Shannon, CST),TLR3(L. iner,Shannon), TLR4(L.
iner),MBL2(L. iner,G. vaginalis, CST), danMYD88(L. iner, Shannon).

Gambar 3. Heatmap merangkum koefisien beta untuk SNP paling signifikan dalam 100 kbp
dari SNP yang dilaporkan sebelumnya. Heatmap di sebelah kiri mewakili arah dan besarnya
koefisien (beta) untuk SNP dalam 100 kb yang terkait dengan lima sifat mikrobioma vagina:
(A) prevalensi relatif L. iner, (B) adanya L. crispatus, (C) prevalensi relatif G. vaginalis, (D)
Shannon diversity index, (E) community state type (CST), dengan CST-IV sebagai referensi.
Koefisien negatif diarsir dengan warna biru, dan koefisien positif diarsir dengan warna
merah, dengan intensitas yang lebih dalam mewakili besarnya koefisien. Heatmap di sebelah
kanan mewakili nilai koefisien P yang sesuai untuk SNP dan sifat mikrobioma vagina (A
sampai E). Semua asosiasi yang ditampilkan memiliki nilai P <0,05. Batas signifikansi
Bonferroni adalah <0,00102, dan nilai P ini diarsir kuning hingga ungu. Nilai P >0,00102
sampai 0,05 diarsir abu-abu.
Analisis gen, jalur, dan penyakit/fenotipe. Selama analisis berbasis gen, tidak ada
gen yang signifikan tetap setelah beberapa pengujian koreksi untuk salah satu sifat
mikrobioma (Tabel S4). Tabel 3 menyajikan lima jalur Kyoto Encyclopedia of Gens and
Genomes (KEGG) dan Reactome teratas dari WebGestalt untuk setiap sifat mikrobioma
vagina. Empat jalur secara signifikan terkait dengan L. Crispatus setelah beberapa
penyesuaian pengujian Benjamini-Hochberg, termasuk pengikatan ligan G-protein- coupled
receptor (GPCR) dan degranulasi neutrofil. Lima jalur dikaitkan dengan L. iner: 4 terkait
dengan kaskade TLR, dan satu dengan komponen TLR awal (MyD88:Mal TIRAP [MyD88-
adaptor-like TIR {Toll-interleukin 1 receptor} domain yang mengandung protein adaptor]).
Dua jalur biologis yang terkait dengan pensinyalan GPCR dikaitkan dengan G. vaginalis,
serta "degranulasi neutrofil," meskipun tidak memenuhi signifikansi Bonferroni. Demikian
pula, dua jalur dikaitkan dengan CST, termasuk jalur paling signifikan "Kelas B/2 (secretin
family receptors)," dan satu jalur dikaitkan dengan Shannon diversity index, "Kelas B/2
(reseptor keluarga secretin)."
Tabel 4 merangkum lima istilah teratas DisGeNET, GLAD4U, Online Mendelian
Inheritance in Man (OMIM), dan Human Phenotype Ontology dari WebGestalt untuk setiap
sifat mikrobioma vagina. Lima fenotipe secara signifikan terkait dengan L. crispatus setelah
beberapa penyesuaian pengujian Benjamini-Hochberg, termasuk "Infeksi bakteri" (P=0,011)
sebagai fenotipe yang paling signifikan. Tiga fenotipe dikaitkan dengan L. iner, dengan
"Autosomal dominant inheritance" yang paling signifikan (P=0,018). Tidak fenotipe secara
signifikan terkait dengan G. vaginalis. Satu fenotipe dikaitkan dengan Shannon diversity
index, "Abnormality of the female genitalia" (P=0,037). Lima fenotipe dikaitkan dengan
CST, termasuk "Abnormalitas integumen" (P=0,00023).
DISKUSI
Kami mengamati hubungan antara jalur genetik dan biologis pada wanita asli Kenya
dengan relevansi biologis dengan imun host, signaling sel, dan infeksi, mendukung peran
genetika host dalam variabilitas antar individu dalam sifat mikrobioma vagina.
Di GWAS, tidak ada SNP yang mencapai signifikansi genome-wide. SNP paling
signifikan yang terkait dengan CST (rs2302902) terletak di intron ELK3, anggota ETS
transcription factor family, yang sebelumnya tidak dikaitkan dengan sifat mikrobioma vagina
atau BV. Protein dalam ELK3 subfamili direkrut oleh faktor respons serum dan berpartisipasi
dalam regulasi transkripsi, dan mereka telah dikaitkan dengan berbagai kanker, termasuk
human papillomavirus (HPV) pada kanker orofaring dan HPV16 pada tumor serviks. Dalam
meta-analisis, ukuran molekuler dan klinis BV dikaitkan dengan peningkatan dua kali lipat
risiko tinggi Cervical epithelial neoplasia (CIN) atau kanker. Mikrobioma vagina yang tidak
optimal menyebabkan gangguan mukosa dan lingkungan proinflamasi yang dapat
memfasilitasi akuisisi HPV, tetapi mungkin juga ada mekanisme bersama atau sinergis yang
mendasari dengan ELK3. SNP lain yang diidentifikasi dalam GWAS terjadi terutama di
daerah intergenik yang sebelumnya tidak dikaitkan dengan BV atau sifat mikrobioma vagina,
dan mereka harus dinilai untuk replikasi dalam studi selanjutnya.

BV tidak ada pada CST-I (L. Crispatus dominan) dan jarang (5,1%) pada CST-III.
Meskipun CST-IV menyumbang 89% kasus BV dalam sampel ini, 57% wanita di CST-IV
tidak memiliki BV. Hal ini sesuai dengan banyak penelitian lain: wanita dengan CST yang
beragam lebih mungkin memiliki BV, tetapi sebanyak 50% wanita dengan CST ini tidak
memiliki BV. Genetika host mungkin sebagian menjelaskan variabilitas ini. Misalnya, wanita
dengan kolonisasi bakteri vagina yang serupa (seperti dalam CST-IV) mungkin memiliki
respons yang berbeda terhadap kolonisasi bakteri tergantung pada sifat genetik. Untuk wanita
yang mengalami respons inflamasi, respons imun ini dapat mempotensiasi BV dan bukan
semata-mata sebagai respons terhadap BV. Dalam penelitian kami, membatasi analisis pada
wanita yang tidak terinfeksi HIV tidak mengubah temuan kami. Ini tidak sepenuhnya tidak
terduga, karena hubungan antara HIV dan dampak selanjutnya pada mikrobioma vagina
bervariasi, dengan beberapa temuan tidak berpengaruh. Sebaliknya, ada data substansial yang
menunjukkan hubungan temporal antara komposisi mikrobioma vagina yang tidak optimal,
peradangan mukosa, dan risiko HIV berikutnya, dan hasil kami menunjukkan bahwa
perbedaan genetik host dapat mendukung hal ini. Studi longitudinal yang kuat yang meneliti
bagaimana genetika host dikaitkan dengan CST yang berbeda, marker imun mukosa, dan
lintasan BV dapat menjadi informatif untuk memahami variabilitas patologi ini dalam CST
yang tidak optimal. Selain itu, penelitian diperlukan untuk mengeksplorasi potensi regulasi
jangka panjang dari SNP ini pada gen, serta mengevaluasi ekspresi atau metilasi sifat asosiasi
lokus kuantitatif.
Karakteristik kompleks bersifat poligenik, dan analisis kami terhadap lokus yang
dilaporkan sebelumnya mengidentifikasi beberapa SNP di berbagai lokus genetik dengan
signifikansi koreksi Bonferroni. Beberapa SNP di wilayah MBL2 secara signifikan terkait
dengan L. iner, G. vaginalis, dan CST. Kalia dkk. Studi yang dilaporkan sebelumnya MBL2
SNP ada hubungannya dengan BV pada wanita di India karena hubungan antara insufisiensi
mannose binding lectin (MBL) dan peningkatan kerentanan terhadap penyakit menular. Di
antara wanita Brasil, spesifik MBL2 polimorfisme dikaitkan dengan peningkatan
kemungkinan BV berulang dibandingkan dengan kontrol, meskipun sebuah penelitian di
antara wanita Italia yang menyaring tiga spesifik MBL2 SNP tidak menemukan perbedaan
untuk wanita dengan BV berulang dibandingkan dengan kontrol. Relevansi gen ini mungkin
populasi spesifik atau subjek interaksi dengan faktor lain seperti prevalensi koinfeksi
(misalnya, HSV-2, HIV), pajanan seksual (misalnya, status sirkumsisi pasangan, banyak
pasangan seks, penggunaan kondom), atau faktor nonseksual (misalnya, merokok, praktik
intravaginal). Selain itu, kami mengidentifikasi SNP di IL-1RN (CST), IL-5 (Shannon), dan
IL-5RA (L. iner, Shannon). IL-1RN (gen untuk agonis reseptor interleukin 1 [IL-1RA])
menghambat sitokin IL-1 inflamasi, IL-1α dan IL-1β. Dalam sebuah penelitian terhadap 62
wanita Italia, dibandingkan wanita dengan skor Nugent 0 hingga 3, wanita dengan BV (skor
Nugent 7 hingga 10) mengalami peningkatan IL-1RA, dan peningkatan inflamasi IL-5
dikaitkan dengan penurunan Lactobacillus. Dalam analisis gen kandidat, Si et al. varian
genetik IL-5 yang ditargetkan, menemukan hubungan dengan peningkatan koloni berbagai
Prevotella. Temuan kami melanjutkan studi ini dengan menganalisis faktor genetik dan sifat
mikrobioma vagina dalam populasi baru dan dengan menunjukkan asosiasi trans-etnis untuk
lokus yang diidentifikasi sebelumnya.
Dalam pathway analysis, jalur GPCR diidentifikasi dengan L. crispatus, G. vaginalis,
dan CST, dan kelas B/2 (reseptor keluarga secretin) dalam keluarga GPCR diidentifikasi
dengan Shannon diversity index dan CST. GPCR memainkan peran penting dalam
pensinyalan intraseluler dalam menanggapi berbagai rangsangan (misalnya, hormon,
neurotransmiter, protein, dll.) Dan di berbagai fungsi (misalnya, pertumbuhan, kebutuhan
nutrisi, respons terhadap penyakit, dll.). Ini kemungkinan termasuk modulasi mikrobioma
vagina, dan variasi dalam pensinyalan GPCR mungkin terkait dengan variasi dalam respons
imun bawaan. LL-37 meningkat pada wanita dengan BV, dan pada model ex vivo
endoserviks, setelah penerapan inhibitor GPCR, induksi produksi IL-8 yang dimediasi LL-37
dihambat; ini relevan mengingat bahwa IL-8 sering meningkat pada wanita dengan BV.
Dalam analisis SNP yang dilaporkan sebelumnya, kami menemukan bahwa SNP di wilayah
gen IL-8 dikaitkan dengan Shannon diversity index dan CST. Dalam sebuah studi
eksperimental, Mares et al. menunjukkan bahwa penerapan cervicovaginal lavage (CVL) dari
wanita dengan BV menginduksi tingkat IL-8 dan NF- kB yang lebih tinggi dalam monosit
manusia daripada CVL dari wanita tanpa BV. Di antara wanita dalam uji coba CAPRISA
004, dengan CST- IV vagina mengalami peningkatan peradangan mukosa (termasuk
peningkatan IL-8) dan peningkatan risiko serokonversi HIV. Efek variasi dalam pensinyalan
GPCR pada respons imun bawaan dapat meluas ke hasil lainnya. Di antara wanita Belanda,
wanita dengan Chlamydia trachomatis seropositif dibandingkan dengan 169 wanita kontrol.
Pensinyalan GPCR mencakup berbagai tindakan, tetapi dalam hubungannya dengan hasil
jalur kami yang melibatkan IL-8 dan TLR dan penelitian lain yang menunjukkan peran
potensial untuk GPCR dalam kesehatan serviks, pensinyalan GPCR patut dipelajari lebih
lanjut sebagai jalur potensial yang memengaruhi perolehan atau pemeliharaan vagina L.
crispatus, CST, dan status BV berikutnya.
Pathway analysis kami juga menghubungkan degranulasi neutrofil dengan L.
crispatus dan G. vaginalis. Neutrofil adalah sel efektor dalam imunitas bawaan, dan
degranulasi dapat memiliki konsekuensi merugikan yang serius bagi host karena pelepasan
molekul yang merusak. Kami tidak mengetahui penelitian lain yang menghubungkan
degranulasi neutrofil dengan mikrobioma vagina, BV, atau infeksi vagina lainnya. Namun,
myeloperoxidase (MPO) adalah ukuran neutrofil dan meningkat pada wanita dengan infeksi
menular seksual (IMS). Apakah degranulasi neutrofil merupakan proses penting dalam
komposisi mikrobioma vagina dapat dievaluasi dalam penelitian selanjutnya, seperti dengan
menargetkan gen yang mengkode molekul yang terkait dengan jalur ini (misalnya,β-arrestins,
Rac2).
Terakhir, pathway analysis mengidentifikasi "kaskade MyD88:MAL (TIRAP)"
dengan L. iner, dan kami mengidentifikasi SNP dalam MyD88 gen dalam kaitannya dengan
L. Iner dan Shannon diversity index. MyD88:Mal (TIRAP) adalah adaptor untuk MyD88,
komponen hilir pertama TLR4 dan TLR2, dan bagian dari proses keseluruhan yang lebih
besar untuk efek sitokin inflamasi. Dalam pathway analysis, beberapa asosiasi pensinyalan
TLR dikaitkan dengan prevalensi relatif L. iner, dan dalam analisis SNP yang dilaporkan
sebelumnya, TLR2 dan TLR3 memiliki asosiasi dengan Shannon diversity index, CST, dan
L. iner. Seperti yang dirangkum dalam Tabel S3 dalam materi tambahan, beberapa peneliti
telah menemukan polimorfisme pada gen TLR terkait dengan perubahan risiko BV dan
banyaknya bakteri terkait BV. TLRs, terutama TLR2 sendiri atau dalam kombinasi dengan
TLR1/TLR6 dan TLR4, telah diakui hubungannya dengan BV dan bakteri terkait BV, karena
TLR ini memicu pelepasan sitokin proinflamasi dan perekrutan sel inflamasi. Seperti yang
diringkas oleh Taylor et al., varian gen TLR dapat menyebabkan respon imun inflamasi yang
tidak memadai atau berlebihan, yang dapat mempengaruhi kerentanan atau perkembangan
penyakit. Selain itu, penelitian diperlukan untuk mengevaluasi potensi peran biologis yang
dimiliki TLR pada komposisi mikrobioma vagina. Mengingat bahwa mikrobioma adalah sifat
kompleks dan sifat kompleks adalah pleiotropik, ini dapat memberikan pemahaman tentang
bagaimana varian TLR berkontribusi terhadap risiko BV, respons terhadap pengobatan BV,
atau hasil lain komposisi mikrobioma vagina yang tidak optimal, seperti resiko kehamilan
yang merugikan.
Kami berhipotesis bahwa faktor genetik host mungkin terkait dengan sifat
mikrobioma vagina, seperti yang telah ditemukan di intestinal dan saluran napas, termasuk
asosiasi dengan komponen genetik host yang mengkode varian dalam sistem kekebalan
bawaan. Seperti yang diringkas oleh Thaiss et al., sistem imun bawaan merasakan bakteri
oleh produk metabolisme mereka dan menerjemahkan ini menjadi respon fisiologis host
untuk mendukung homeostasis organisme. Misalnya, mikrobiota mempengaruhi fungsi
interleukin, berpotensi mendorong peradangan, dan ekspresi MyD88 pada barier epitel
mendukung homeostasis usus. Secara keseluruhan, temuan kami menunjukkan banyak jalur
yang relevan secara biologis yang terkait dengan sifat mikrobioma vagina. Namun, asosiasi
tersebut tidak menyiratkan kausalitas, dan studi tambahan diperlukan untuk mengatasi
ekspresi gen yang tidak diketahui, jalur dengan banyak fungsi, dan gen polimorfisme
nonspesifik atau jalur dengan mikrobioma vagina, dengan studi yang lebih besar pada
beberapa kelompok etnis.
Keterbatasan. Kekuatan penelitian ini dibatasi oleh ukuran sampel yang kecil: di
GWAS kami, tidak ada SNP yang mencapai signifikansi luas genom setelah beberapa
koreksi, dan kami tidak dapat menilai gen dengan interaksi lingkungan. Kami menghitung
jumlah asosiasi yang melewati ambang batas nilai P (Tabel S5), yang menunjukkan bahwa
kami tidak akan mendeteksi SNP signifikan pada tingkat signifikansi seluruh genom (5x10- 8)
atau tingkat signifikansi Bonferroni dari penelitian kami (1,49x10 -7). Sangat mungkin kami
memiliki temuan negatif palsu karena ukuran sampel yang kecil. Untuk memahami ukuran
sampel yang diinginkan untuk studi yang mereplikasi pendekatan kami, kami memperkirakan
ukuran sampel minimum yang diperlukan untuk mencapai tingkat signifikansi Bonferroni
(Tabel S6): Studi GWAS dari sifat mikrobioma ini dalam sampel yang serupa dengan kita
akan membutuhkan ukuran sampel setidaknya 188 hingga 376 wanita, dan ukuran sampel
bervariasi berdasarkan sifat dan ukuran asosiasi.
Kami menemukan substansial fungsional yang tumpang tindih dalam beberapa jalur
imun bawaan yang relevan secara biologis. Ini mungkin sebagian didorong oleh komposisi
taksa individu. Untuk mengurangi ini, kami membatasi pemeriksaan pada beberapa ciri yang
diketahui penting dalam hubungannya dengan karakterisasi koloni yang komprehensif. Kami
menganalisis CST secara linier, meskipun multinomial atau quasi-Poisson mungkin lebih
dapat diterapkan mengingat kemungkinan efek yang tidak setara di seluruh level; namun,
pendekatan ini tidak didukung oleh perangkat lunak analisis statistik genetik. Kami juga
mengkonfirmasi banyak SNP di dekat lokus genomik yang terkait dengan imunitas bawaan
yang dilaporkan dalam penelitian sebelumnya tentang sifat genetik host yang terkait dengan
BV dan taksa vagina. Meskipun kami mengidentifikasi daerah kandidat baru yang terkait
dengan sifat mikrobioma vagina, studi tambahan diperlukan untuk mereplikasi temuan kami.
Terlepas dari keterbatasan ukuran sampel yang kecil, keuntungan dari pendekatan penemuan
kami yang tidak bias adalah dapat lebih mudah digabungkan dengan penelitian masa depan
lainnya. Evaluasi dampak fungsional dengan studi multiomik (seperti ekspresi gen,
epigenetik, dan fine mapping) akan memungkinkan inferensi mekanistik dan bantuan dalam
menjelaskan elemen regulasi, yang dapat mengarah pada kemajuan translasi dalam
mengoptimalkan mikrobioma vagina dan mencegah BV dan konsekuensi terkait.
Kesimpulan. Mengingat beberapa asosiasi sifat mikrobioma penting dengan berbagai
jalur pensinyalan imun, komposisi mikrobioma vagina (dan selanjutnya, risiko BV) dapat
dipengaruhi oleh genetika host melalui fenotipe imun. Studi replikasi dan studi fungsional
diperlukan untuk mengkonfirmasi dan lebih menjelaskan pemahaman tentang bagaimana
bakteri vagina berinteraksi dengan susunan genetik host untuk mempengaruhi mikrobioma
vagina yang tidak optimal dan hasil terkait. Mengingat risiko terjadinya BV, mikrobioma
vagina yang tidak optimal, dan HIV dan IMS di antara wanita Afrika dan Afrika-Amerika,
studi lintas negara yang didukung dengan baik diperlukan untuk menjawab apakah varian
umum direplikasi di seluruh populasi dan untuk mengidentifikasi gen penting melalui
interaksi lingkungan yang menginformasikan seberapa besar risiko mikrobioma vagina yang
tidak optimal dapat dimodifikasi, seperti melalui modifikasi perilaku atau pencegahan atau
pengobatan koinfeksi (misalnya, HSV-2, HIV).

BAHAN DAN METODE

Studi ini telah disetujui oleh Komite Peninjau Etis Universitas Maseno (Kisumu,
Kenya; MSU/ DRPC/MUERC/00054/13; 13 Januari 2014), dan Institutional Review Board
dari University of Illinois di Chicago (AS; 2013-0511 ; 12 Februari 2014).
Desain studi dan peserta. Subyek dalam analisis ini terdaftar di Afya Jozi, Afya
Jami (Kiswahili untuk “Pasangan Sehat, Koloni Sehat”), sebuah studi kohort prospektif dari
pasangan heteroseksual di Kisumu, Kenya. Rekrutmen dan kriteria kelayakan telah
diterbitkan sebelumnya. Secara singkat, kami memasukkan pria berusia 18 hingga 35 tahun
dan pasangan wanita mereka berusia 16 tahun ke atas, yang secara independen
mengkonfirmasi hubungan seksual setidaknya selama 6 bulan. Pria atau wanita yang
melaporkan penggunaan antibiotik dalam 60 hari terakhir, pria yang disirkum dalam 6 bulan
terakhir, dan wanita yang melaporkan douching vagina dalam 7 hari terakhir dikeluarkan
sementara sampai waktu yang cukup telah berlalu. Setelah kunjungan awal, pasangan
dijadwalkan untuk tindak lanjut pada 1 bulan, 6 bulan, dan 12 bulan. Pasangan terdaftar dari
1 April 2014 hingga 22 Juni 2016, dan tindak lanjut 12 bulan selesai pada 21 Juni 2017.
Koleksi spesimen. Pada setiap kunjungan studi yang dijadwalkan, peserta menjalani
riwayat medis standar dan pemeriksaan fisik, diikuti dengan wawancara pribadi untuk
mendapatkan informasi sosiodemografi dan perilaku. Pada awal dan setiap kunjungan
selanjutnya, dokter mengumpulkan swab vagina untuk penilaian BV. Slide yang diwarnai
Gram dievaluasi menurut kriteria Nugent, skor 7 sampai 10 didefinisikan sebagai BV
mengikuti rekomendasi klinis. Pengambilan swab vagina diikuti dengan pengambilan CVL
dalam 10 ml air steril. Aliquots dari 2 ml disimpan pada 80°C sampai pengiriman ke
Chicago, IL, untuk diproses.
 Karakterisasi mikrobioma vagina. Kami menggunakan mikrobioma vagina yang
diukur dari kunjungan awal untuk analisis ini, karena pengobatan antimikroba diberikan
untuk BV dan infeksi serviks lainnya yang dapat mengacaukan pengamatan mikrobioma
vagina berikutnya. Ekstraksi DNA, persiapan perpustakaan, dan pengurutan dilakukan di
University of Illinois di Chicago Sequencing Core (UICSQC). DNA diekstraksi dari
spesimen CVL menggunakan kit DNA PowerFecal (Qiagen). Protokol PCR dua tahap
digunakan untuk mengamplifikasi daerah variabel V3-V4 dari gen 16S rRNA bakteri.
Illumina MiSeq digunakan untuk mengurutkan amplikon setelah penyatuan, menerapkan
kimia V3 (600 siklus). Kontrol kualitas dan anotasi taksonomi dilakukan oleh University of
Maryland Institute for Genomic Science (UMD IGS) mengikuti protokol yang diterbitkan
sebelumnya. Community state types (CST) ditentukan oleh algoritme VALENCIA yang
diimplementasikan oleh UMD IGS, yang menggunakan metrik berbasis jarak untuk
mengklasifikasikan setiap sampel ke CST berdasarkan kesamaan sampel tersebut dengan
centroid CST diidentifikasi dalam set referensi. Secara singkat, taksa dominan menurut CST
adalah sebagai berikut: CST-I,L. crispatus; CST-II, Lactobacillus gasseri; CST-III, L. iner;
CST-IV, diverse; CST-V, Lactobacillus jensenii.
Genotipe dan kontrol kualitas. DNA genom diperoleh dari 200 wanita Kenya
menggunakan swab oral dan diekstraksi menggunakan QIAamp DNA blood minikit
(Qiagen). Ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan di Pusat Epigenetik Populasi di Universitas
Northwestern. Peserta penelitian digenotipe menggunakan Infinium Global Screening Array
(640.000 marker; Illumina, Inc., San Diego, CA). Perangkat lunak Illumina GenomeStudio
(v2.0.4; Illumina, Inc., San Diego, CA) digunakan untuk mendapatkan polimorfisme
nukleotida tunggal (SNP) di Fasilitas Genomic, Universitas Chicago. Peserta penelitian
dengan tingkat pencarian genotipe kurang dari 95% dikeluarkan dari analisis seperti juga
peserta penelitian dengan ciri mikrobioma vagina yang hilang. Karena keterkaitan samar
yang diidentifikasi selama kontrol kualitas, kami membatasi semua analisis pada jumlah
maksimum individu yang tidak terkait. Penerapan kriteria eksklusi ini menghasilkan 171
peserta penelitian untuk dianalisis. SNP dengan call rate kurang dari 95%, frekuensi alel
minor kurang dari 1%, atau Hardy-Weinberg equilibrium nilai P kurang dari 10 -6 dihilangkan.
Setelah kriteria eksklusi ini, 336.151 tetap untuk analisis lebih lanjut.
Imputasi genotipe. Kami melakukan imputasi genotipe untuk mengidentifikasi SNP
tambahan yang terkait dengan sifat mikrobioma vagina yang tidak digenotipe secara langsung
menggunakan panel referensi Luhya di Webuye, Kenya, dari Proyek 1000 Genom. Program
Shapeit2 digunakan untuk fase genotipe, dan imputasi dilakukan dengan menggunakan
Minimac3. Genotipe yang diperhitungkan dikodekan sebagai dosis alelik (perkiraan jumlah
mulai dari 0 hingga 2). SNP diperhitungkan berkualitas rendah, yaitu Rsq <0,30 dan
MAF<1%, dikeluarkan dari analisis lebih lanjut.
Analisis statistik. Kami mengevaluasi hubungan antara polimorfisme nukleotida
tunggal (SNPs) dengan lima sifat mikrobioma vagina: (i) adanya L. crispatus, (ii) prevalensi
relatif L. iner, (iii) prevalensi relatif G. vaginalis, (iv) Shannon diversity index, dan (v) CST.
Kami memilih L. Crispatus karena pentingnya diketahui dalam kesehatan mikrobioma
vagina, L. Iner untuk dominasinya di antara Lactobacillus spesies dalam sampel kami dan
sampel Afrika lainnya, dan G. Vaginalis untuk dimasukkan sebagai morfotipe dalam
penilaian Nugent dan penentuan BV. Untuk ukuran keragaman alfa, kami memilih Shannon
diversity index, karena semua ukuran keragaman alfa sangat berkorelasi (korelasi Spearman,
0,77 hingga 0,98). Sebelum analisis, prevalensi relatif L. Iner dan Shannon diversity index
ditransformasikan log terbalik untuk mendekati distribusi yang lebih normal (lihat Gambar.
S1 dalam bahan tambahan). Karena transformasi tidak mengarah ke perkiraan normal,
prevalensi relatif dari G. Vaginalis dianalisis dengan kuartil. Mengingat frekuensi L.
Crispatus (hadir dalam 24% sampel), kami menganalisisnya sebagai muncul atau tidak
muncul. Dari 171 subjek dalam analisis, 168 (98%) koloni mikroba vagina awal
diklasifikasikan sebagai CST-I (n=14; 0% dengan BV), CST-III (n=77; 5,2% dengan BV),
atau CST-IV (n=77; 43% dengan BV). Ada tiga outlier (dua dengan CST-II dan satu dengan
CST-V), dan pengamatan ini dikeluarkan dari analisis CST. BV tidak dianalisis sebagai hasil
yang terpisah karena colinear dengan CST. Kami menganalisis CST sebagai hasil linier
(yaitu, jarak yang sama antara CST-I, CST-II, dan CST-III) mengingat sifat ordinal risiko BV
dan untuk memenuhi parameter perangkat lunak statistik.
Komponen utama dari genetik ancestry dihasilkan menggunakan program
EIGENSOFT, dan tiga komponen utama pertama dipertahankan dan dimasukkan sebagai
kovariat. Plot quantil-quantil (QQ) dihasilkan untuk setiap sifat untuk memvisualisasikan uji
statistik, dan faktor inflasi kontrol genom dihitung. Kami menggunakan PLINK (v1.90) untuk
menguji hubungan antara L. iner, G. vaginalis, Shannon diversity index, dan CST dengan
SNP menggunakan regresi linier, dan hubungan antara L. crispatus dan SNP menggunakan
regresi logistik, disesuaikan dengan usia dan komponen utama. Kami mengasumsikan model
efek genetik aditif untuk semua analisis. Untuk memperhitungkan ketidakpastian genotipe,
dosis alel dari SNP yang diperhitungkan dianalisis menggunakan Mach2QTL untuk regresi
linier dan Mach2DAT untuk regresi logistik. SNP dengan nilai P kurang dari 1,49 x 10 -7
(0,05/336.151) dinyatakan signifikan di seluruh genom. Perangkat lunak R (3.5.0) dan
LocusZoom (hg19/1000 Genomes AFR) digunakan untuk membuat grafik. Kami menghitung
jumlah SNP yang memenuhi kisaran nilai ambang P (lihat Tabel S5 dalam materi tambahan).
Selain itu, kami memperkirakan ukuran sampel minimum yang diperlukan untuk mencapai
tingkat signifikansi Bonferroni (1,49x10-7) berdasarkan regresi linier masing-masing sifat dan
SNP pada ambang batas daya 80%, 90%, dan 95% (Tabel S6). Kami tidak dapat
menghasilkan perkiraan ukuran sampel yang andal untuk L. crispatus karena perkiraan rasio
odds dan sifat prevalensi yang rendah.
Analisis gen, jalur, dan penyakit/fenotipe. Kami melakukan analisis gen, jalur, dan
penyakit/fenotipe menggunakan SKAT-O dan WebGestalt untuk memeriksa efek genetik
gabungan pada mekanisme biologis yang mendasari yang mempengaruhi sifat mikrobioma
vagina. Kami memetakan semua SNP yang digenotipe langsung ke gen autosomal
berdasarkan posisi genom dari rakitan GRCh37 / hg19 dan memasukkan batas gen 20-kb
untuk menangkap elemen pengatur dan fungsional proksimal yang berkontribusi pada
regulasi gen, menghasilkan 21.213 gen untuk analisis. Asosiasi set gen dilakukan
menggunakan SKAT-O, disesuaikan dengan usia dan tiga komponen utama pertama. Analisis
representasi jalur yang berlebihan (Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes [KEGG] dan
Reactome) dan penyakit/ fenotipe (DisGeNET, GLAD4U, Online Mendelian Inheritance in
Man [OMIM], dan Ontologi Fenotipe Manusia) dianalisis menggunakan WebGestalt. Gen
dengan nilai P kurang dari 2,36 – 10-6(0,05/21.213) dinyatakan signifikan. Jalur, penyakit,
dan fenotipe dengan false discovery rate (FDR) nilai P <0,05 setelah Benjamini-Hochberg
multiple testing adjustment dinyatakan signifikan. Lima gen teratas, jalur, dan
penyakit/fenotipe dari SKAT-O dan WebGestalt dilaporkan.
Web resources. The Web resources are as follows: Mach2DAT
(http://csg.sph.umich.edu/abecasis/MACH/download/) and Mach2QTL
(http://csg.sph.umich.edu/abecasis/MACH/download/)
Ketersediaan data. Raw sequence data files tersedia di Arsip Baca Urutan (National
Center for Biotechnology Information; pengenal BioProject PRJNA516684).

SUPPLEMENTAL MATERIAL
Supplemental material is available online only.
FIG S1, TIF file, 0.2 MB.
FIG S2, TIF file, 0.9 MB.
TABLE S1, DOCX file, 0.01 MB.
TABLE S2, DOCX file, 0.02 MB.
TABLE S3, XLSX file, 0.03 MB.
TABLE S4, DOCX file, 0.01 MB.
TABLE S5, DOCX file, 0.01 MB.
TABLE S6, DOCX file, 0.02 MB.
DATA SET S1, XLS file, 0.1 MB
1. Supriya D. Mehta, Drew R. Nannini, Fredrick Otieno, Stefan J. Green, Walter Agingu,
Alan Landay, Yinan Zheng, Hou L. Host Genetic Factors Associated with Vaginal
Microbiome Composition in Kenyan Women. Am Soc Microbiol. 2020;5(4):1-16.
doi:https://doi .org/10.1128/mSystems.00502-20.