MAKALAH IMUNOKIMIA

PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI TERBARU

(GENOME EDITING)
Diajukan sebagai tugas matakuliah Imunokimia yang
dibimbing oleh Dr. drh. Asmarani Kusumawati, MP.

Oleh :
Digdo Sudigyo
17/419967/PMU/09178

PROGRAM STUDI MAGISTER BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS GADJAH MADA
2018
I. PENDAHULUAN
Metode genome editing, yaitu metode perakitan genetik dimana sebuah sekuens
DNA disisipkan, digantikan, atau dipindahkan dari genom suatu organisme dengan
suatu enzim nuklease buatan yang berperan sebagai “gunting molekular”. Tujuan dari
metode ini adalah untuk mengedit susunan sekuens DNA pada genom sehingga
merubah asam amino yang dikode dan pada akhirnya merubah sifat organisme.
Aplikasi genome editing pada secara umum antara lain yaitu:
1. Gene targeting, yaitu introduksi substitusi nukleotida spesifik sehingga
mengubah susunan asam amino pada protein yang terbentuk.
2. Targeted mutagenesis, yaitu mentidak aktifkan atau menghapus suatu gen atau
segmen kromosom.
3. Trait stacking, yaitu menyisipkan DNA asing ke lokasi genom yang tepat.
Genome editing melibatkan metode yang secara tepat memanipulasi asam nukleat
pada sel hidup. Hal tersebut bergantung pada dua aspek penting, yaitu:
1. Perakitan enzim endonuklease spesifik sekuens yang berfungsi untuk
mengenai sekuens DNA target (biasanya berukuran 20 nukleotida) dan
memotong sekuens DNA target tersebut sehingga menghasilkan potongan
rantai ganda DNA.
2. Mekanisme perbaikan DNA selular, yaitu mekanisme untuk memperbaiki
potongan rantai ganda DNA (Riry Prihatini, 2015).

Teknologi genome editing tergolong baru karena baru resmi dipublikasikan pada
tahun 2005. Beberapa modul teknik genome editing yang telah digunakan diantaranya
Zinc Finger Nucleases (ZFNs) dan Transcription Activator-Like Effector Nucleases
(TALENs) (Ledford, 2016). Teknologi ini memungkinkan para peneliti untuk
menciptakan mutasi secara permanen, namun demikian, teknik ini sangat mahal dan
membutuhkan waktu yang lama serta terbatas untuk digunakan dalam skala luas
(Lusser et al., 2012). Untuk itu, para peneliti berusaha untuk menciptakan modul
terbaru genome editing yang lebih murah dan memiliki presisi tinggi. Belum lama ini,
teknologi tersebut sudah ditemukan dan diberi nama Cluster Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats-associated protein-9 nuclease (CRISPR-Cas 9). Modul
 teknologi genome editing ini disebut-disebut sebagai era penemuan baru dan terbesar
dalam dunia biologi molekuler.

II. METODE TERBARU GENOM EDITING

A. ZNF dan TALENS (Transcription Activator-Like Effector Nucleases)
ZNF (Zinc Finger Nucleases) merupakan metode genom editing pertama
yang mengenali target DNA spesifik dengan menggunakan enzim endonukelase
Fok 1 untuk memotong target DNA. Adanya enzim endonuclease sendiri dikenali
sebagai cleavage domain. Untuk pengenalan target pemotongan spesifik
digunakan protein Zinc yang berbentuk seperti jari berperan sebagai binding
domain. Protein Zinc sendiri mengenali basa nukleotida 3 sampai 6 basa dalam
satu protein.

Gambar 1. Mekanisme kerja ZNF (Zinc Finger Nucleases)

Struktur modular protein Zinc finger dalam pengenalannya pada DNA
spesifik mengandung lebih dari tiga basa nukleotida dalam satu domain binding
Zinc finger secara umum, tetapi perkembanagannya saat ini memungkinkan
konstruksi protein zinc-finger sintetis yang mengenali sekuens DNA dengan
panjang 9 hingga 18 bps (Liu et al., 1997). Karena bps urutan DNA 18 dapat
memberikan spesifisitas dalam 68 miliar bp DNA, metode ini memungkinkan
untuk urutan tertentu untuk ditargetkan dalam genom manusia untuk pertama
kalinya (Beerli et al., 1998). Sementara pada awalnya metode ini sangat
kontroversial, desain ini telah terbukti menjadi strategi optimal untuk membangun
protein zinc-finger yang mengenali sekuens DNA berdekatan yang spesifik dalam
genom kompleks.
 Pada TALENS (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) sendiri
hampir sama dengan Zinc, perbedaannya terletak pada binding domain-nya yang
menggunakan protein transcription activator-like effector (TALE) yang lebih
spesifik dalam mengenali basa nukleotida dibandingkan dengan protein Zinc yaitu
dapat mengenali tiap-tiap jenis basa nukleotida satu persatu sehingga
pengenalannya lebih spesifik (Gaj et al., 2013).

Gambar 2. Mekanisme kerja TALENS (Transcription Activator-Like

Effector Nucleases)
TALE sendiri merupakan protein alami dari genus bakteri patogen
tanaman Xanthomonas, yang mengandung domain pengikatan DNA yang terdiri
dari serangkaian 33-35 domain pengulangan asam amino yang masing-masing
mengenali satu bp. Kekhususan TALE ditentukan oleh dua asam amino
hypervariable yang dikenal sebagai variabel diresidu yang berulang atau Repeat-
Variable Diresidues (RVD). Seperti protein zinc-fingers, modular TALE repeats
dihubungkan bersama untuk mengenali rangkaian DNA yang berdekatan. Namun
berbeda dengan protein zinc-fingers, tidak ada rekayasa ulang hubungan antara
pengulangan yang diperlukan untuk membangun susunan TALE panjang dengan
kemampuan untuk secara teoritis menangani situs tunggal dalam genom (Moehle
et al., 2007).
B. CRISPR-Cas9 (Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-
associated protein-9 nuclease)
CRISPR merupakan metode genome editing yang berkembang pesat saat
ini yang terdiri atas kompleks CRISPR dan Caspase 9. CRISPR berperan dalam
pengenalan pada target sekuens yang akan diedit atau dilakukan pemotongan yang
didalamnya terdapat guide RNA dan Caspase 9 sendiri terdiri dari enzim-enzim
untuk binding, memotong serta membuka untai double heliks DNA. Pada bakteri,
sistem CRISPR memberikan kekebalan yang didapat terhadap invasi DNA asing
melalui pembelahan DNA yang dipandu RNA (gRNA) yang tersusun atas crRNA
dan tracrRNA.

Gambar 3. Skema sintesis Guide RNA (gRNA)

Cas 9 berfungsi sebagai enzim yang memotong DNA target di sekuen
yang posisinya dekat dengan situs protospacer adjacent motif (PAM). Sekuen di
situs PAM ini biasanya ditandai dengan 3 basa nukleotida (NGG, dengan N
adalah basa nukleotida yang bisa berupa A: Adenin; T: Timin; C: Cytocine; G:
Guanin). Protein cas9 ini memiliki 2 situs homolog yaitu RuvC dan HNH, yang
masing-masing memotong satu dari untai ganda DNA, yang menghasilkan
potongan tumpul (blunt cut) pada sekuen DNA target. Selanjutnya, sgRNA yang
merupakan RNA buatan gabungan dari dua noncoding RNA yaitu crRNA yang
berfungsi sebagai guide yang bisa menyesuaikan dengan sekuen dari DNA target
dan tracrRNAyang berfungsi sebagai scaffold. Sekuen sgRNA ini digunakan
untuk mentarget lokus genom tanaman/hewan yang panjangnya 19-22bp, dengan
penambahan 3 bp sekuen PAM (NGG). Cas9 dan sgRNA dapat dikonstruk dalam
satu vektor atau bisa menggunakan dua vektor yang terpisah dengan
mengkombinasikan dengan jenis promotor dan sekuen dari enzim restriksi lainnya
tergantung dari karakter genom yang ditargetkan. Metode pengeditan dari
CRISPR ini, sama dengan dua teknologi sebelumnya yaitu adanya mekanisme
reparasi akibat terpotongnya sekuen DNA target (Jiang et al., 2013).

Gambar 4. Mekanisme kerja CRISPR-Cas 9 (Cluster Regularly

Interspaced Short Palindromic Repeats-associated protein-9
nuclease)
Dalam sistem CRISPR / Cas Tipe II, segmen pendek DNA asing, disebut
"spacer" terintegrasi dalam lokus genom CRISPR dan ditranskripsikan dan
diproses menjadi CRISPR RNA pendek (crRNA). CrRNA anneal ini untuk trans-
mengaktifkan crRNA (tracrRNAs) dan pembelahan urutan-spesifik langsung dan
silencing DNA patogen oleh protein Cas. Pengenalan target oleh protein Cas9
membutuhkan urutan "seed" dalam crRNA dan sebuah protopacer yang
berdekatan dengan motif dinucleotide berdekatan motif (PAM) urutan hulu dari
kompleks bagian crRNA-binding. Sistem CRISPR / Cas dengan demikian dapat
ditargetkan ulang untuk membelah hampir semua rangkaian DNA dengan
mendesain kembali crRNA. Secara signifikan, sistem CRISPR / Cas telah terbukti
secara langsung yang mudah dipindahkan ke sel manusia dengan pengiriman
bersama plasmid mengekspresikan endonuklease Cas9 dan komponen crRNA
yang diperlukan (Cong et al., 2013).
 C. Perbandingan ZFN, TALENS dan CRISPR-Cas 9
ZFN dan TALEN mengenali sekuens DNA spesifik dengan interaksi
protein-DNA dan menginduksi lesi spesifik lokasi DNA melalui domain nuklease
dimeric dari Fok I. Masing-masing platform ini, bagaimanapun, memiliki
keterbatasan unik (Tabel 1). Meskipun beberapa strategi telah dikembangkan
untuk mengatasi banyak keterbatasan, menggabungkan ZFN dan TALEN
fungsional masih membutuhkan proses pemilihan dan screening binding protein
yang memakan waktu lama.
Perkembangan terbaru dari sistem penyuntingan genom CRISPR / Cas9,
menggunakan komponen jalur respon imun adaptif bakteri, tidak memerlukan
sintesis protein khusus, dan sebaliknya menggunakan panduan RNA yang unik
bersama dengan protein endonuklease tunggal (Cas9) (Feng et al., 2015).
Berdasarkan tabel 1 menunjukkan bahwa CRISPR-Cas 9 lebih efesien jika
dibandingkan faktor-faktornya dengan ZFN dan TALENS.

Tabel 1. Perbandingan kinerja teknis intrinsik untuk ZFN, TALEN dan CRISPR /
Cas9.

(Feng et al., 2015)

III. dCas 9 (Catalytically dead Cas9)

 Regulasi gen yang ditargetkan pada skala genome adalah strategi yang kuat untuk
menginterogasi, mengganggu, dan merekayasa sistem seluler. Pengembangan metode
untuk mengendalikan ekspresi gen berdasarkan Cas9, endonuklease DNA yang
dipandu RNA dari sistem CRISPR tipe II menunjukkan bahwa Caspase 9 yang
dimatikan aktivitas katalitik enzim endonuclease-nya, ketika diekspresikan dengan
RNA guide, menghasilkan kompleks pengenalan DNA yang dapat secara khusus
mengganggu perpanjangan transkripsi, binding polimerase RNA, atau faktor binding
transkripsi. Sistem ini yang juga disebut dengan CRISPR interference (CRISPRi),
dapat secara efisien menekan ekspresi gen yang ditargetkan, tanpa efek off-target
yang terdeteksi (Qi et al., 2013). Penggunaan dCas9 sendiri sebagai metode
interferensi transkripsi merupakan tahap awal. Segera setelah itu dilakukan
pemasangan efektor (seperti protein represor dan domain pengaktif) untuk
memanfaatkan kemampuan penargetan dCas9 untuk aktivasi gen reversibel,
penyuntingan epigenomik, dan banyak lagi. Apakah itu adalah wilayah promotor,
kawasan regulasi, atau wilayah pengkodean, para ilmuwan dapat menggunakan
sistem CRISPR dCas9 sebagai modular scaffold untuk pemasangan efektor yang
mudah, memungkinkan kontrol gen apa pun tanpa menyebabkan mutasi yang
merusak DNA yang tidak dapat diubah.
Untuk memberikan dCas9 dengan kemampuan aktivasi gen, dCas9 digabungkan
pertama kali dengan aktivator transkripsi klasik seperti VP64 (tetramer sintetis dari
Herpes Simplex Viral Protein 16) atau p65 (faktor transkripsi yang terlibat dalam
banyak proses seluler). Meskipun sistem regulator gen tunggal ini menunjukkan
aktivasi gen di berbagai sel eukariotik, hanya aktivasi moderat yang dicapai (2-5 kali
lipat). Dalam upaya untuk meningkatkan kekuatan aktivasi, sistem mediator aktivasi
sinergis (SAM) dikembangkan. Sistem ini dibangun berdasarkan struktur dCas9-
VP64 dasar, tetapi mencakup sgRNA yang dimodifikasi untuk merekrut aktivator
transkripsional tambahan untuk efek aktivasi sinergis. Sistem dCas9-SAM baru ini
dapat secara andal memperkuat ekspresi gen dari 10 hingga ribuan kali lipat,
tergantung pada ekspresi awal (Russa et al., 2015).
 Gambar 5. Sistem aktivasi transkripsi dCas9-SAM dengan activator VP64 atau
p65.
dCas9 sendiri mampu menargetkan penghambatan transkripsi gen karena
pengikatannya ke situs target secara sterik mengganggu pengikatan dan fungsi mesin
transkripsi, metode yang disebut CRISPRi (atau CRISPR interferensce). Sistem
CRISPRi yang sederhana ini dapat menyebabkan represi hingga 1.000 kali lipat,
secara efisien menurunkan ekspresi gen dalam sel. Pengembangan sistem dCas9-
KRAB merupakan sebuah sistem di mana dCas9 yang digabungkan dengan KRAB
(Krüppel-associated box), domain represor transkripsi Kox1. Sistem CRISPRi yang
ditingkatkan ini bergantung pada kemampuan KRAB untuk merekrut beragam
pengubah histon yang secara reversibel menekan ekspresi gen melalui pembentukan
heterochromatin (Shalem et al., 2015).

Gambar 6. Sistem penghambatan transkripsi dCas9-KRAB dengan represor

KRAB.
 dCas9 saat ini memungkinkan untuk mempelajari dan memanipulasi regulasi
epigenetik gen tanpa mengubah urutan sekuens gen. Sistem seperti fusi dCas9 ini
dapat membantu untuk memahami lebih jauh tentang peran perubahan epigenetik
pada jalur molekuler dan suatu penyakit yang disebabkan keabnormalan regulasi
epigenetik. Teknologi seperti histone deacetylases atau DNA methyltransferases
menyatu dengan protein zinc finger atau TALEs diciptakan untuk memodifikasi
epigenome melalui demethylation dan deacetylation yang ditargetkan. Namun,
asetilasi histon adalah salah satu sistem peningkat ekspresi gen yang paling kuat.
Hilton et al. (2015), mengembangkan sistem dCas9-p300 untuk mengatasi masalah
tersebut secara efektif yang memungkinkan modifikasi langsung dari kromatin yang
terlibat dalam berbagai jalur dan proses seluler.

Gambar 7. Sistem dCas9-p300 untuk aktivasi epigenetik (fusi dCas9 dengan

domain katalitik inti p300) mengasetilasi target dalam genom.
Dalam sistem ini, dCas9 menyatu dengan inti katalitik dari p300 protein yang
berhubungan dengan E1A manusia, komponen kunci dari domain yang
mengkompilasi histone. Sistem yang dihasilkan ini berhasil menginduksi ekspresi gen
ketika ditargetkan ke wilayah pengkodean atau peraturan, menunjukkan
keefektifannya sebagai transaktivator downstream gen (Hilton et al., 2015).
 dCas9-LSD1 adalah sistem represi / penghambat gen komplementer untuk
mengaktifkan kekuatan dCas9-p300. Dalam sistem ini, dCas9 digabungkan dengan
Lysine-specific histone demethylase 1 (LSD1). Penggunaan embrionik stem cell line
tikus yang secara stabil dinyatakan dCas9-LSD1, Kearns et al. (2015), berhasil
menunjukkan represi gen secara downstream ketika sistem ditargetkan di daerah
penambah distal gen Oct4.

Gambar 8. Sistem dCas9-LSD1 untuk represi epigenetik (fusi dCas9 dengan

LSD1) mendemetilasi target dalam genom.
Namun, ketika dCas9-LSD1 ditargetkan pada promotor Oct4, tidak ada efek yang
diamati. Hal ini menjadikan dCas9-LSD1 metode yang menjanjikan untuk
mempelajari aktivitas pengaturan dari enhancher. Ini berbeda dengan sistem lain
seperti dCas9-KRAB, yang merupakan pengendali ekspresi gen secara umum. dCas9-
LSD1 juga mampu mendiamkan / menghentikan ekspresi gen Tbx1 ketika ditargetkan
ke upstream enhancer tanpa mengganggu susunan genom lokal.

IV. REPAIR (RNA Editing for Programmable A to I Replacement)

Pengeditan RNA adalah proses posttranscriptional melalui mekanisme mesin
seluler yang dapat membuat perubahan diskrit untuk urutan nukleosida spesifik dalam
molekul RNA. Pada manusia, jenis penyuntingan RNA yang paling umum adalah
konversi adenosin menjadi inosin (A → I). Modifikasi ini dimediasi oleh dua
Adenosine Deaminases Acting on RNA (ADAR): ADAR1 dan ADAR2. ADAR
sendiri dapat dibaca sebagai guanosin di dalam mekanisme splicing dan translasi,
ADAR juga dapat mengubah pola penyambungan dan memodifikasi urutan asam
amino (Hogg et al., 2011). Pengeditan asam nukleat sangat menjanjikan untuk
mengobati penyakit genetik, terutama pada tingkat RNA, di mana urutan penyakit
yang relevan dapat diselamatkan untuk menghasilkan produk protein fungsional.

Gambar 9. Editing tools genom yang dapat deprogram.

Editor DNA CRISPR konvensional (A). CRISPR bergantung pada kemampuan
CRISPR sgRNA untuk menargetkan endonuklease Cas9 ke lokasi genom yang tepat.
Editor utama meminjam sgRNA dan Cas9 atau nuklease lainnya dari CRISPR.
Namun, editor dasar tidak memotong untaian ganda, tetapi sebaliknya mereka secara
kimia mengubah basis tunggal dengan enzim deaminase seperti TadA (B, editor basis
DNA) dan ADAR (C, editor basis RNA). Editor berbasis ADAR sendiri
dikembangkan sebagai salah satu metode genom editing yang merupakan
pengembangan dari metode CRISPR dengan modifikasi protein caspase dengan
menggunakan caspase 13 yang dimatikan aktivitas katalitiknya. Tipe VI CRISPR-Cas
sistem berisi RNA guide yang dapat diprogram sebagai efektor tunggal sebagai
memandu RNases Cas13. Sistem tipe VI digunakan untuk merekayasa ortologi Cas13
 yang mampu melakukan knockdown yang kuat dan mendemonstrasikan pengeditan
RNA dengan menggunakan Casin yang tidak aktif secara katalitis (dCas13) untuk
mengarahkan adenosin ke aktivitas deaminase inosin oleh ADAR2 ke transkrip dalam
sel mamalia. Sistem ini, yang disebut sebagai RNA Editing untuk Programmable A to
I Replacement (REPAIR), yang tidak memiliki batasan urutan yang ketat, dapat
digunakan untuk mengedit transkrip lengkap yang mengandung mutasi pathogen
(Cox et al., 2017).

V. DAFTAR PUSTAKA
Beerli R. R., et al. 1998. Toward controlling gene expression at will: specific
regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger
proteins constructed from modular building blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S. A. 1995 : 14628–14633.
Cong L., et al. 2013. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.
Science. 339 : 819–823.
Cox, D. B. T., Gootenberg J. S., Abudayyeh O. O., Franklin B., Kellner M. J., Joung
J., & Zhang F. 2017. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358(6366) :
1019 - 1027.
Feng W., Dai Y., Mou L., Cooper D. K., Shi D., & Cai Z. 2015. The Potential of the
Combination of CRISPR/Cas9 and Pluripotent Stem Cells to Provide Human
Organs from Chimaeric Pigs. Int. J. Mol. Sci. 16 : 6545-6556.
Gaj T., Gersbach, C. A., & Barbas C. F. 2013. ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-
based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7) :
397–405.
Hilton I. B., D’Ippolito A. M., Vockley C. M., Thakore P. I., Crawford G. E., Reddy
T. E., & Gersbach C. A. 2015. Epigenome editing by CRISPR/Cas9-based
acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat.
Biotechnol. 33 : 510 - 517.
Hogg M., Paro S., Keegan L. P., and O'connell M. A. 2011. RNA editing by
mammalian ADARs. Adv. Genet. 73 : 87 – 120.
 Hsu P. D., Lander E. S. ,& Zhang F. 2014. Development and applications of
CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157. 1262-1278.
Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F., & Marraffini L. A. 2013. RNA-guided editing
of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology.
31(3) : 2332-2339.
Kearns N. A., Pham H., Tabak B., Genga R. M., Silverstein N. J., Garber M., &
Maehr, R. 2015. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-
histone demthylase fusion. Nature Methods. 12 : 401 - 403.
Liu Q., et al. 1997. Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing
within complex genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94 : 5525–5530.
Moehle E. A., et. al. 2007. Targeted gene addition into a specified location in the
human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 104:3055–3060.
Prihatini R. 2015. Pemuliaan Presisi Menggunakan Metode Genome Editing.
https://balitbu.litbang.pertanian.go.id/index.php/hasil - penelitian mainmenu-
46 / teknologi - main menu - 78 / 114 - inovaso - tek / inovasi teknologi/717-
pemuliaan - presisi-menggunakan – metode – genome - editing. Diakses pada
tanggal 26 April 2018.
Qi L. S., Larson M. H., Gilbert L. A., Doudna J. A., Weissman J. S., Arkin A. P., &
Lim W. A. 2013. Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform
for Sequence-Specific Control of Gene Expression. Cell. 152(5) : 1173–
1183.
Russa M. F. & Qi, L. S. 2015. The New State Of The Art: Cas9 For Gene Activation
And Repression. Mol. and Cell. Biol. 35 : 3800-3809.
Shalem O., Sanjana N. E., & Zhang F. 2015. High-throughput functional genomics
using CRISPR-Cas9. Nat. Rev. 16 : 299 - 311.